课时训练13 多聚酶链式反应扩增DNA片段
1.PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比,主要有两点不同,它们是( )。
①PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA ②PCR过程不需要DNA聚合酶 ③PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶,而是通过对反应温度的控制来实现的 ④PCR过程中,DNA不需要解旋,直接以双链DNA为模板进行复制
A.③④ B.①②
C.①③ D.②④
解析:PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比较,主要有两点不同:(1)PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA,长度通常为20~30个核苷酸。(2)PCR 过程中,DNA解旋不依赖解旋酶,而是通过对反应温度的控制来实现的。
答案:C
2.PCR技术中,引物的作用是( )。
A.打开DNA双链
B.催化合成DNA子链
C.使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始复制
D.提供模板
解析:DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,而只能从3'端延伸DNA链,引物的作用就在于此。
答案:C
3.下图表示PCR扩增的产物,请分析它是哪次循环的产物?( )
A.第一次循环 B.第二次循环
C.第三次循环 D.第四次循环
解析:在PCR反应中,以引物为标记,第一次循环时,以加入的DNA为模板,两条DNA链可分别由引物Ⅰ和引物Ⅱ与其结合并在DNA聚合酶的作用下延伸,所以形成的每个子DNA中只有一种引物;从第二次循环开始,上次产生的DNA分子又可作为模板参与反应,所以会形成DNA分子两端均含有引物的情况。因此题干中所出现的情况是第一次循环的产物。
答案:A
4.下列关于DNA双链的叙述,错误的是( )。
A.通常将DNA的羟基末端称为5'端,而磷酸基团的末端称为3'端
B.通常将DNA的羟基末端称为3'端,而磷酸基团的末端称为5'端
C.通常DNA聚合酶只能从3'端延伸DNA链
D.通常DNA聚合酶不能从5'端延伸DNA链
解析:为了明确DNA分子的方向,通常将DNA的羟基末端称为3'端,而磷酸基团的末端称为5'端。
答案:A
5.下列有关PCR的描述,不正确的是( )。
A.PCR技术的原理是DNA复制
B.用PCR技术扩增DNA是一个酶促反应,需耐高温的解旋酶和DNA聚合酶
C.一个DNA片段经PCR扩增,可形成2n个DNA片段(n代表循环次数)
D. PCR利用了DNA的热变性来控制DNA的解旋与结合
解析:PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术,它以极少量的DNA为模板,以四种脱氧核苷酸为原料,在引物作用下使DNA聚合酶从引物的3'端连接脱氧核苷酸,短时间内迅速复制上百万份的DNA拷贝。PCR利用DNA在不同温度下变性解聚或复性的特性来解旋并结合引物,不用解旋酶解旋。
答案:B
6.下列有关PCR过程的叙述,不正确的是( )。
A.变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键,也可利用解旋酶实现
B.复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的
C.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸
D.PCR与细胞内DNA复制相比,其所需要酶的最适温度较高
解析:变性是破坏碱基之间的氢键,解旋酶与高温都可起到相同的作用,A项正确;复性过程引物与模板DNA结合过程遵循碱基互补配对原则,B项正确;延伸过程需要DNA聚合酶和四种脱氧核糖核苷酸,PCR是体外操作的,不需要ATP供能,C项错误;PCR所需酶为耐高温的Taq DNA聚合酶,D项正确。
答案:C
7.DNA检测技术可应用于亲子鉴定、遗传病检测等领域。DNA检测离不开对样品DNA的PCR扩增。不同样品DNA的扩增过程或条件不同的是( )。
A.引物 B.DNA聚合酶
C.四种脱氧核苷酸 D.预变性的温度
解析:不同的样品DNA有不同的核苷酸序列,由于引物能与模板DNA(样品DNA)按照碱基互补配对原则结合,因此不同样品DNA所需的引物有不同的核苷酸序列。
答案:A
8.小鼠杂交瘤细胞表达的单克隆抗体用于人体试验时易引起过敏反应,为了克服这个缺陷,可选择性扩增抗体的可变区基因(目的基因)后再重组表达。下列相关叙述正确的是( )。
A.设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列
B.用PCR方法扩增目的基因时必须知道基因的全部序列
C.PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶
D.一定要根据目的基因编码产物的特性选择合适的受体细胞
解析:本题考查PCR技术。A项中,设计扩增目的基因的引物时,要考虑扩增的目的基因与载体两端序列碱基互补配对,故错误。B项中,DNA复制沿着模板进行,不必知道基因的全部序列,故错误。C项中,PCR技术中的DNA聚合酶是耐高温的DNA聚合酶,不是从受体细胞中提取的DNA聚合酶,故错误。D项中,目的基因编码产物不同,相应的受体细胞不同,故正确。
答案:D
9.在PCR扩增的实验中,加入一种提取物(一种模板DNA片段),但实验得到的产物却有两种DNA。其原因可能是( )。
A.基因突变
B.Taq DNA聚合酶发生变异
C.基因污染
D.温度过高
解析:发生题述状况的原因是基因污染。因此,在PCR实验中,一定要做到隔离操作区、分装试剂、简化操作程序、使用一次性吸液枪头等,尽量避免基因污染。
答案:C
10.PCR技术(多聚酶链式反应)是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术,如图表示合成过程。下列说法错误的是( )。
A.A过程高温使DNA变性解旋,该过程不需要解旋酶的作用
B.C过程要用到的酶在高温下失活,因此在PCR扩增时需要再添加
C.如果把模板DNA的两条链用15N标记,游离的脱氧核苷酸不标记,控制“94 ℃~55 ℃~72 ℃”温度循环3次,则在形成的子代DNA中含有15N标记的DNA占25%
D.PCR中由碱基错配引起的变异属于基因突变
解析:PCR技术中用的Taq DNA聚合酶是耐高温的,在72 ℃时不会失活,因此在PCR扩增时不需添加。
答案:B
11.一个有15N标记的DNA分子,放在没有15N标记的环境中培养,利用PCR循环5次后15N标记的DNA分子占总数的( )。
A.1/10 B.1/5
C.1/16 D.1/25
解析:一个DNA分子复制n次后产生的DNA分子数目为2n。在没有15N标记的环境中培养,不论经过多少次复制,得到的DNA分子中只有2个DNA分子被15N标记,则经过5次循环后,标记的DNA分子占总数的2/25,即1/16。
答案:C
12.在PCR扩增DNA的实验中,预计一个DNA分子经过30次循环后,应该得到230个DNA分子,但是结果只有约210个DNA分子,那么出现该现象的原因不可能是( )。
A.Taq DNA聚合酶的活力不够,或活性受到抑制
B.系统设计欠妥
C.循环次数不够
D.引物不能与亲链结合
解析:如果Taq DNA聚合酶活力不够,或活性受到抑制,则导致催化效率降低,得到的产物比预期的少,则A项正确。如果PCR系统设置欠妥,达不到预期的结果,则B项正确。如果循环次数过少,产物的量比预期的少,则C项正确。如果引物设计不合理,也许不能与模板DNA结合,造成无法进行扩增,则D项错误。
答案:D
13.在进行DNA亲子鉴定时,需大量的DNA。PCR技术(多聚酶链式反应)可以使样品DNA扩增,获得大量DNA克隆分子。该技术的原理是利用DNA的半保留复制,在试管中进行DNA的人工复制(如下图,图中短粗线是引物)。在很短的时间内将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍,使实验室所需的遗传物质不再受限于活的生物体。
(1)图中的变性、延伸分别是指 、 。?
(2)假设PCR反应中的DNA模板为P,第一轮循环的产物2个子代DNA为N1,第二轮的产物4个子代DNA为N2,N1、N2中分别含有模板DNA单链的DNA分别有 个、 个。若继续循环,该DNA片段共经过30次循环后能形成 个DNA片段。?
(3)某样品的一个DNA分子中共含3 000个碱基对,碱基数量满足:(A+T)/(G+C)=1/2,若经5次循环,至少需要向试管中加入 个腺嘌呤脱氧核苷酸。(不考虑引物所对应的片段)?
(4)若下图为第一轮循环产生的产物,请绘出以a链和b链为模板经PCR扩增的产物。
解析:(1)变性的实质是DNA双链解旋;延伸的实质是以DNA单链为模板,按碱基互补配对原则合成子链的过程。
(2)由于PCR原理为DNA双链复制,其特点是半保留复制,所以无论复制几次,模板链一直存在于2个DNA分子中。DNA复制的数量变化是指数式增长方式。
(3)由(A+T)/(G+C)=1/2可知A∶T∶G∶C=1∶1∶2∶2,所以A的比例为1/6,在一个DNA分子中的数量为3 000×2×(1/6)=1 000个,5次循环形成的DNA数为32个,所以由原料合成的DNA数相当于32-1=31个,至少需腺嘌呤脱氧核苷酸为31×1 000=31 000个。
(4)画图的关键是注意引物A、B的位置和所对应的模板链。
答案:(1)模板DNA双链解旋形成单链 在DNA聚合酶的作用下,原料脱氧核苷酸聚合形成新的DNA链
(2)2 2 230
(3)31 000
(4)如图
14.近10年来,PCR技术(多聚酶链式反应)成为分子生物学实验室的一种常规手段,其原理是利用DNA半保留复制,在试管中进行DNA的人工复制(如下图所示)。
(1)加热使DNA双链打开,这一步是打开 键,称为 ,在细胞中是在 酶的作用下进行的。?
(2)当温度降低时,引物与模板末端结合,在DNA聚合酶的作用下,引物沿模板延伸,最终合成两条DNA分子,此过程中原料是 ,遵循 。?
(3)PCR技术的必需条件,除了模板、原料、 酶以外,至少还有三个条件,即:液体环境、适宜的 和 。?
(4)通过PCR技术使DNA分子大量复制,若将一个用15N标记的DNA分子放入试管中,以含有14N的脱氧核苷酸为原料,连续复制4次之后,则15N标记的DNA分子占全部DNA总数的比例为 。?
(5)现有一段DNA序列:5'CAAGGATCC3' 3' G T T C C T A G G 5'。如果它的引物1为5'GGA—OH,则引物2为 。?
解析:DNA两条链之间的碱基通过氢键形成碱基对,从而将两条链连接起来。因而,要想打开DNA双链,必须打开氢键,这一过程在细胞内是在解旋酶作用下完成的,在细胞外(PCR)则是通过高温实现的。合成DNA时,所用的原料是4种游离的脱氧核苷酸,复制过程遵循碱基互补配对原则。PCR技术的条件除了模板、原料、酶以外,还要有适宜的温度和酸碱度以及液体环境;用含15N标记的DNA分子作为模板,连续复制4次,共得到DNA分子数为24=16个,其中含有15N标记的有两个,占全部DNA分子总数的1/8。
答案:(1)氢 解旋 解旋
(2)4种脱氧核苷酸 碱基互补配对原则
(3)Taq DNA聚合 温度 pH
(4)1/8
(5)5'CAA—OH
15.多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。请回答下列有关PCR技术的基本原理及应用问题。
(1)DNA的两条链是反向平行的,通常将 的末端称为5'端,当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后,DNA聚合酶就能从引物的 开始延伸DNA链。?
(2)PCR利用DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题,但又导致了DNA聚合酶失活的新问题。到20世纪80年代,科学家从一种Taq细菌中分离到 ,它的发现和应用解决了上述问题。要将Taq细菌从其他普通的微生物中分离出来,所用的培养基叫 。?
(3)PCR的每次循环可以分为 三步。假设在PCR反应中,只有一个DNA片段作为模板,请计算在5次循环后,反应物中大约有 个这样的DNA片段。?
(4)请用简图表示出一个DNA片段PCR反应中第二轮的产物。
(5)简述PCR技术的主要应用。
解析:(1)DNA聚合酶只能把新的核苷酸加到已经存在的核酸的3'羟基上,与DNA母链结合的RNA引物就提供这个羟基。(2)因PCR利用了DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题,所以用于催化DNA复制过程的DNA聚合酶要具有耐高温的特性。用选择培养基可将Taq细菌从其他普通的微生物中分离出来。(3)DNA复制两条链均作为模板,进行半保留复制,所以复制5次后得到的子代DNA分子数为25=32个。(4)新合成的DNA链带有引物,而最初的模板DNA的两条链中只有一条带有引物。(5)PCR技术可以对DNA分子进行扩增,所以可用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等方面。
答案:(1)磷酸基团 3'端
(2)耐高温的Taq DNA聚合酶 选择培养基
(3)变性、复性和延伸 32
(4)
(5)遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等。
专题5 DNA与蛋白质技术
课题5.2 多聚酶链式反应扩增DNA片段
一、【课题目标】
（一）知识与技能
1、了解PCR技术的基本操作
2、理解PCR的原理
3、讨论PCR的应用
???（二）过程与方法
在多聚酶链式反应扩增DNA片段的实验过程中，应避免外源DNA污染，严格控制温度等反应条件
（三）情感、态度与价值观
通过对PCR实验的操作及结果分析，培养学生严谨的科学态度和实事求是的科研精神
二、【课题重点】
PCR的原理和PCR的基本操作
三、【课题难点】
PCR的原理
四、【教学方法】
启发式教学
五、【教学工具】
多媒体课件
六、【教学过程】
（一）引入新课
在现代生物技术中，DNA技术可谓是尖端技术。人类基因组计划、基因工程、基因诊断、基因检测、古生物鉴定等都离不开对DNA分子碱基序列的分析。而分析DNA碱基序列，就需要一定量的DNA片段。怎样迅速获得足够量的DNA片段呢？今天我们来研究学习DNA分子的扩增技术――PCR技术。
（二）进行新课
1．基础知识
PCR技术扩增DNA的过程，与细胞内DNA复制过程类似：
1．1细胞内DNA复制条件分析：
条件
组分
作用
模板
DNA的两条单链
提供复制的模板
原料
四种脱氧核苷酸
合成DNA子链的原料
酶
解旋酶
DNA聚合酶
打开DNA双螺旋
催化合成DNA子链
能量
ATP
为解螺旋和合成子链供能
引物
RNA
为DNA聚合酶提供合成的3’端起点
1．2细胞内DNA复制过程
（1）DNA的反向平行结构：（结合教材图5－6）
核苷酸分子的结构与方向性：（分子结构模式图）
由核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链：（模式图，体现方向性）。
DNA双螺旋结构的反向平行结构：
（2）DNA的复制过程:
解 旋：解旋酶、ATP，DNA两条链打开，，形成两条DNA单链。
引物结合：在DNA单链3’端与DNA反向配对结合，确保引物3’端与DNA单链准确配对。
DNA聚合酶结合：
子链合成：DNA聚合酶从引物3’端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。
后续加工：DNA聚合酶I将引物切去，并合成空缺处的DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来（半不连续合成。先导链，滞后链）
子链合成特点：不能从头合成；合成方向为“5’→3’合成”。
感悟生命的神秘：DNA聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成，还具有校对功能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次，只有碱基配对无误后才能继续往下聚合，它不能从头合成。RNA聚合酶没有校对功能，因此RNA的合成不需要引物，而是从头合成的，它的错配可能性较大，在RNA引物完成功能后即被DNA聚合酶I删去，代之以高保真的DNA链。
［思考］DNA分子能准确复制的原因有哪些？
DNA双螺旋结构提供模板；碱基互补配对；DNA聚合酶的复查功能。
［思考］细胞内哪些物质是从头合成的？RNA合成、蛋白质合成。
1．3DNA分子复制的人工控制
解开螺旋：在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。
恢复螺旋：在50℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。
复制条件：缓冲液,DNA模板,四种脱氧核苷酸,热稳定DNA聚合酶,两种引物。
反应场所：PCR仪（自动温度周期性调节）。
［思考］缓冲液相当细胞内的什么成分？（核基质）4．PCR的反应过程
变性：在95℃时DNA解旋
复性：在50℃时引物与DNA单链结合
延伸：在72℃时合成DNA子链（两个引物间的序列）
2．实验操作
2．1 PCR反应体系：缓冲液、DNA模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物，水
2．2 实验操作步骤
2．3 按照PCR反应体系配方配制反应液；
（2）将PCR反应体系50μL用微量移液器转移到微量离心管（0.5mL）中；
（3）将微量离心管放到PCR仪中；
（4）设置PCR仪的工作参数。
（5）DNA在PCR仪中大量扩增。
2．4 水浴法：将微型离心管依次在95℃、55℃、72℃的恒温水浴锅中循环处理相应时间。
3．实验注意事项
3．1避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。
3．2缓冲液和酶分装成小份，－20℃低温保存。
3．3每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。
3．4混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。
4．结果分析与评价
4．1反应液稀释：取2μLPCR反应液，添加98μL蒸馏水；2．分光光度计调零：将100μL蒸馏水添加到比色杯中，在260nm处将分光光度计调整读数为零。
4．2将100μL反应稀释液倒入比色杯中，测定在260nm处的光吸收值。
4．3计算：DNA含量＝50×光吸收值×稀释倍数
（三）课堂总结、点评
（四）实例探究
例1 在（ ）的温度范围内，DNA的双螺旋结构解开
A. 10－20℃ B. 80－100℃ C. 20－30℃ D. 40－60℃
解析：蛋白质大多不能忍受60－80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。
答案：B
例2 关于DNA的复制，下列叙述正确的是（ ）
A. DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5’端延伸DNA链
B. DNA复制不需要引物
C. 引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合
D. DNA的合成方向总是从子链的3’端向5’端延伸
解析：由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3’端即复制方向由3’端向5’端延伸；由于DNA分子是反向平行的，子链是依据碱基互补配对原则，在DNA聚合酶作用下合成的，其合成方向是从子链5’端向3’端延伸。
答案：C
☆综合应用
例3 下列有关PCR描述，不正确的是（ ）
A. 是一种酶促反应
B. 引物决定了扩增的特异性
C. 扩增产量按y＝（1＋X）n
D. 扩增对象是氨基酸序列
E. 扩增对象是DNA序列
解析：PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它以极少量的DNA为模板，以四种脱氧核苷酸为原理，在引物的作用下使DNA聚合酶从引物的3’端连接脱氧核苷酸，短时间内迅速复制上百万份的DNA拷贝，其扩增产量为y＝（1＋X）n，y代表DNA片段扩增后的拷贝数，x表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数，因此答案选D。
答案：D
（五）巩固练习
1．DNA分子复制时，解旋的两条链中（ ）
A仅一条作为复制模板
B两条链作为模板并复制出两个不同的DNA分子
C两条链作为模板并复制出两个相同的DNA分子
D两条链作为模板，各自合成一条子链，然后两条母链重新结合为原来的双螺旋分子，两条新链结合成一个全新的DNA分子
2.下列关于DNA复制过程的正确顺序是（ ）
①互补碱基对之间氢键断裂②互补碱基对之间形成氢键③DNA分子在解旋酶的作用下解旋④以解旋后的母链为模板进行碱基互补配对⑤子链与母链盘旋成双螺旋状结构
A①③④②⑤ B①④②⑤③ C①③⑤④② D③①④②⑤
3.下列各项过程中，遵循“碱基互补配对原则”的有（ ）
①DNA复制②RNA复制③转录④翻译⑤逆转录
A①②③④⑤ B①②③④ C①②③⑤ D①③④⑤
4.实验室内模拟生物体DNA的复制必需的一组条件是（ ）
①酶②游离的脱氧核苷酸③ATP④DNA分子⑤mRNA⑥tRNA⑦适宜的温度⑧适宜的酸碱度
A①②③④⑤⑥ B②③④⑤⑥⑦ C②③④⑤⑦⑧ D①②③④⑦⑧
5.利用PCR技术，把一个双链DNA分子当作第一代，经过3次循环，在第四代DNA分子中，有几条第一代脱氧核苷酸的长链？（ ）
A 2 B 4 C 8 D 16，
6.关于DNA分子的叙述中，正确的是（ ）
A .DNA的两条链是极性相同，同向平行 B.DNA的两条链是极性相同，反向平行
C.DNA的两条链中极性不同，反向平行的 D.DNA的两条链是极性不同，同向平行
7.假设PCR反应中，只有一个DNA的片段作为模板，请计算在30次循环后，反应物中大约有多少这样的DNA片段（ ）
A 215 B 230 C 260 D 231
8.DNA的合成方向总是（ ）延伸。
A从DNA分子的左端向右端 B从DNA分子的右端向左端
C从子链的5，端向3，端 D从子链的3，端向5，端
9.要使PCR反应在体外的条件下顺利地进行，需要严格的控制（ ）
A 氧气的浓度 B酸碱度 C温度 D 大气的湿度
10.DNA分子经PCR反应循环一次后，新合成的那条子链的脱氧核苷酸的序列应与（ ）
A模板母链相同 B非模板母链相同
C两条模板母链相同 D两条模板母链都不相同
答案： CDADA CBCCB
七、【课余作业】
1、PCR与生物体DNA复制有何区别？
2、如果在案件侦破过程中，只收集到一根毛发，但它所含的遗传信息太少，该怎么办呢？
八、【教学体会】
教师在教学过程中，可以鲜引导学生回忆必修2的有关DNA复制的知识，在此基础上，学生可加深对于PCR原理的认识。对于PCR反应过程的教学，应以读图识图为主。教材中反应过程图解详细的描绘了参与PCR的各种组成成分；每一轮反应的三个基本步骤—变性、复性、延伸；每一步骤的作用。教师在教学中可以请学生在读图的同时，结合教科书中的文字说明来加深理解。当学生遇到难以理解的地方时，教师要及时给予解答。
九、【资料袋】
免疫-PCR
免疫-PCR(immuno-PCR)是新近建立的一种灵敏、特异的抗原检测系统.它利用抗原-抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏性来检测抗原，尤其适用于极微量抗原的检测.
免疫-PCR试验的主要步骤有三个:①抗原-抗体反应，②与嵌合连接分子结合，③PCR扩增嵌合连接分子中的DNA(一般为质粒DNA).该技术的关键环节是嵌合连接分子的制备.在免疫-PCR中，嵌合连接分子起着桥梁作用，它有两个结合位点，一个与抗原抗体复合物中的抗体结合，一个与质粒DNA结合，其基本原理与ELISA和免疫酶染色相似，不同之处在于其中的标记物不是酶而是质粒DNA，在操作反应中形成抗原抗体-连接分子-DNA复合物，通过PCR扩增DNA来判断是否存在特异性抗原.
免疫PCR优点为:①特异性较强，因为它建立在抗原抗体特异性反应的基础上.②敏感度高，PCR具有惊人的扩增能力，免疫PCR比ELISA敏感度高105倍以上，可用于单个抗原的检测.③操作简便，PCR扩增质粒DNA比扩增靶基因容易得多，一般实验室均能进行.
课件33张PPT。专题5 DNA和蛋白质技术 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段在刑事侦破案件中常需要对样品DNA进行分析，PCR技术能快速扩增DNA片段，在几个小时内复制出上百万份的DNA拷贝，有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。现在PCR技术已广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和基因测序。
请思考：
1．PCR技术的基本原理是什么？
2．PCR反应过程是怎样的？
1．生物体内DNA复制的条件
(1)原料：___________________________________________________。
(2)模板：解旋后的每一条____________。
(3)酶：打开DNA双链的________和合成DNA单链的____________。
(4)引物：为DNA聚合酶的起始提供________末端。
一、PCR的原理及反应过程
4种脱氧核苷酸 DNA母链 解旋酶 DNA聚合酶 3′ 2．PCR扩增的原理
(1)概念：PCR即多聚酶链式反应，是一种体外________________的技术。它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。
(2)原理：
①DNA变性：在__________的温度范围内，DNA的________结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。 迅速扩增DNA片段 80 ～100 ℃ 双螺旋 ②DNA复性：当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新____________，这个过程称为复性。
③DNA合成：DNA聚合酶从引物____________端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的________端向________端延伸。
结合成双链 3′ 5′ 3′ (3)条件：
①模板：解旋后的每一条___________。
②引物：能分别与____________结合的两种引物。
③原料：____________________________________________________。
④酶：________DNA聚合酶。
⑤其他条件：需要稳定的__________和能自动调节温度的温控设备。
DNA母链 两条模板链 4种脱氧核苷酸 耐热的 缓冲溶液 90 ℃ 50 ℃ 碱基互补配对 72 ℃ DNA聚合酶 碱基互补配对原则 1．实验用具
(1)PCR仪：该仪器能自动调控________，实现DNA的扩增。如果没有PCR仪，可用3个________水浴锅代替，操作时按程序在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。
(2)微量离心管：总容积为________mL，实际上是进行PCR反应的场所。
(3)微量移液器：用于向微量离心管中转移PCR配方中的液体，每吸取一种试剂后其上的一次性吸液枪头都必须更换。
二、PCR的实验操作 温度 恒温 0.5 2．实验步骤 用微量移液器 轻轻弹击 10 3．DNA含量的测定
(1)原理：利用DNA在________的紫外线波段有一强烈的吸收峰。
(2)计算公式：
DNA含量(μg/mL)＝__________________×稀释倍数。
点拨：在PCR实验操作中，常用微量离心管作为反应场所，在操作时，用微量移液器按照PCR反应体系的配方在微量离心管中依次加入各组分，再设计好PCR仪的循环程序就可以了。
260 nm 50×(260 nm的读数) 一、生物体内的DNA复制与PCR反
应的比较①DNA单链有方向性，DNA母链的3′端对应着子链的5′端，即DNA的两条链是反向平行的。
②注意不同酶的作用：解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合酶与DNA连接酶都是催化形成磷酸二酯键的。
③DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3′端上，需要模板，而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。
特 别
提 醒例1标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是( )
A．92 ℃、50 ℃、72 ℃ B．72 ℃、50 ℃、92 ℃
C．50 ℃、92 ℃、72 ℃ D．80 ℃、50 ℃、72 ℃解析：当温度上升到90 ℃(90～96 ℃)以上时，双链DNA解聚为单链，称之为变性；当温度下降到50 ℃(40～60 ℃)左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；当温度上升到72 ℃(70～75 ℃)时，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在Taq DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，称为延伸。
答案：A
变式
训练1．DNA的复制需要引物，其主要原因是( )
A．可加快DNA的复制速度
B．引物可与DNA母链通过碱基互补配对结合
C．引物的5′端有助DNA聚合酶的延伸DNA链
D．DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链
变式
训练解析：：DNA的两条链是反向平行的，为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基(－OH)末端称为3′端，而磷酸基团的末端称为5′端。DNA聚合酶不能从5′端开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链。因此，DNA复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。
答案：D二、PCR技术的基本原理
类似于DNA的天然复制过程，由变性—复性—延伸三个基本反应步骤构成：
1．模板DNA的变性
模板DNA经加热至95 ℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的DNA的双链解开，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。
2．模板DNA与引物的退火(复性)
模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55 ℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。
3．引物的延伸
DNA模板引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以四种脱氧核苷酸为反应原料，DNA母链为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性—复性—延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4 min,2～3 h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
PCR扩增过程中的易错点
①PCR过程中无解旋酶，破坏氢键需要升高温度才能打开氢键，但此时的温度还不能破坏磷酸二酯键，因此，热变性后是DNA单链，并未分解成单体。
②复性时只是在引物和DNA单链之间形成氢键，两条单链之间并未形成氢键，因此复性后，无双链DNA分子形成。
特 别
提 醒三、PCR的实验操作
1．操作步骤
(1)按PCR反应体系的配方配制所需试剂。
(2)用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各组分。
(3)盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。
(4)将微量离心管放在离心机上，离心约10 s。(5)将离心管放在PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。
以上过程可以概括为准备、移液、混合、离心、反应五大步。2．实验结果与分析
(1)实验中DNA含量的测定。
①稀释：取2 μL PCR反应液，加入98 μL蒸馏水，即将样品稀释了50倍。
②对照调零：以蒸馏水作空白对照，在波长260 nm处，将紫外分光光度计的读数调至零。
③测定：取DNA稀释液100 μL至比色杯中，测定260 nm处的光吸收值。
④计算：DNA含量(μg/mL)＝50×(260 nm的读数)×稀释倍数。
(2)理论上DNA扩增数目的计算。
DNA扩增与DNA复制一样，呈指数扩增。若只有一个DNA为模板，则复制n次后有2n个；若一开始有a个模板，则复制n次有a×2n个DNA。
(3)DNA扩增是否成功。
检测DNA片段扩增情况可以采用上述方法，也可以采用电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。如果扩增不成功，则要分析失败原因。可能的原因有：漏加了PCR的反应成分、各反应成分的用量不当、PCR程序设置不当等。
例2下列操作过程的叙述中错误的是( )
A．PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌
B．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存
C．PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化
D．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的吸液枪头都必须更换解析：从冰箱中放置的缓冲液和酶取出后应放在冰块上缓慢融化，而不能迅速融化。
答案：C2．在PCR实验操作中，下列说法不正确的是( )
A．在微量离心管中添加各种试剂时，只需一个枪头
B．离心管的盖子一定要盖严，防止液体外溢
C．用手轻弹离心管壁的目的是使反应液充分混合
D．离心的目的是使反应液集中在离心管部，提高反应效果变 式
训 练解析：在微量离心管中添加各种试剂时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换，以确保实验的准确性；离心管的盖子一定要盖严，防止实验中脱落或液体外溢；离心10 s的目的是使反应液集中在离心管部，提高反应效果。
答案：A
变 式
训 练专题五 课题2
一、选择题
1．引物的作用是 ( )
A．打开DNA双链
B．催化合成DNA子链
C．使DNA能够从引物的3′端开始复制
D．提供模板
[答案] C
[解析] 引物的作用是使DNA开始从3′端开始复制。
2．DNA复制过程的前提是 ( )
A．获得引物 B．催化合成DNA子链
C．解旋 D．4种脱氧核糖核苷酸
[答案] C
[解析] DNA复制的前提是先解旋。
3．DNA合成方向是 ( )
A．从子链的3′端向5′端延伸
B．从引物的5′端开始延伸
C．从子链的5′端向3′端延伸
D．以上皆可
[答案] C
[解析] DNA合成方向是从子链的5′端向3′端延伸。
4．PCR过程中DNA复性所需的温度条件为 ( )
A．90℃以上 B．72℃左右
C．80℃以上 D．50℃左右
[答案] D
[解析] PCR过程中DNA的复性所需温度条件为50℃左右。
5．PCR操作中，从第二轮循环开始扩增的DNA片段 ( )
A．固定长度 B．一端固定
C．都不固定 D．不能确定
[答案] D
二、非选择题
6．(1)PCR每次循环都可分为________、________和________________三步。
(2)________的发现和使用大大增加了PCR的效率，使PCR技术趋向________。
(3)PCR通过控制________来控制双链的________与________。
(4)PCR反应需要在一定的缓冲溶液中提供________分别与两条模板链结合的________、________种脱氧核苷酸、________的DNA聚合酶。
(5)从第二轮循环开始，DNA聚合酶只能特异地复制________的DNA序列，使这段________的序列呈指数扩增。
[答案] (1)变性 复性 延伸
(2)Taq聚合酶 自动化 (3)温度 解聚 结合
(4)DNA模板 两种引物 四 耐热
(5)处于两个引物之间 固定长度
一、选择题
1．PCR具体操作时用 )
A．微量离心管 B．微量移液管
C．玻璃试管 D．塑料瓶
[答案] C
[解析] PCR具体操作时用玻璃试管。
2．从第二次循环开始，复制DNA片段呈哪种方式扩增 ( )
A．直线 B．指数
C．对数 D．不变
[答案] B
[解析] 从第二次循环开始，DNA片段的复制以指数形式扩增。
3．DNA的羟基(－OH)末端称为 ( )
A．3′端 B．5′端
C．1′端 D．2′端
[答案] A
[解析] DNA的羟基末端称为3′端。
4．PCR利用了DNA的什么原理，来控制DNA的解聚与结合 ( )
A．特异性 B．稳定性
C．热变性 D．多样性
[答案] C
[解析] PCR利用了DNA的热变性原理来控制DNA的解聚与结合。
5．有关PCR反应的叙述中正确的是 ( )
A．PCR反应所需要的引物只是RNA
B．PCR反应所需要的材料是核糖核苷酸
C．PCR反应所需要的酶在60℃会变性
D．PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行
[答案] D
6．下图中是哪次循环的产物 ( )
A．第一次循环 B．第二次循环
C．第三次循环 D．第四次循环
[答案] A
二、非选择题
7．近十年来，PCR技术(多聚酶链式反应)成为分子生物学实验室里的一种常规手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如图)，在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。
(1)加热使DNA双链打开，这一步是打开________键，称为________。
(2)当温度降低时，引物与模板________端结合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最终合成两个DNA分子，此过程中原料是________，遵循的原则是________。
(3)PCR技术的必要条件，除了模板、原料、ATP、酶以外，至少还需要三个条件，即：液体环境、适宜的________和________，前者由PCR仪自动调控，后者则靠________来维持。
(4)DNA的复制需要引物，其主要原因是( )
A．可加快DNA复制速度
B．引物可与DNA母链通过碱基互补配对结合
C．引物的5′端有助于DNA聚合酶延伸DNA链
D．DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链
[答案] (1)氢 变性
(2)3′ 四种脱氧核苷酸 碱基互补配对原则
(3)温度 酸碱度 缓冲液
(4)D
