课时训练14 血红蛋白的提取和分离
1.下列关于凝胶色谱柱的操作,正确的是( )。
A.将橡皮塞上部用刀切出锅底状的凹穴
B.将橡皮塞下部用刀切出凹穴
C.插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面
D.将尼龙网剪成与橡皮塞下部一样大小的圆片
解析:制作凝胶色谱柱时,先选择合适的橡皮塞打孔,然后将橡皮塞上部用刀切出锅底状的凹穴,取适宜长度的玻璃管插入橡皮塞孔内,插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面。将尼龙网剪成与橡皮塞上部一样大小的圆片,覆盖在橡皮塞的凹穴上,再用尼龙纱将橡皮塞上部包好,插入到玻璃管的一端。
答案:A
2.使用SDS—聚丙烯酰胺电泳的过程中,不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于( )。
A.电荷的多少 B.分子的大小
C.肽链的多少 D.分子形状的差异
解析:SDS能与各种蛋白质形成蛋白质/SDS复合物,SDS所带的负电荷量大大超过蛋白质分子原有的电荷量,因而掩盖了不同蛋白质间的电荷差别,使电泳迁移率完全取决于分子的大小。
答案:B
3.在血红蛋白的整个提取过程中,不断用磷酸缓冲液处理的目的是( )。
A.防止血红蛋白被氧气氧化
B.血红蛋白是一种碱性物质,需磷酸中和
C.磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程
D.让血红蛋白处在稳定的pH范围内,维持其结构和性质
解析:磷酸缓冲液的作用是稳定pH,从而维持血红蛋白的结构和性质。
答案:D
4.蛋白质的提取和分离分为哪几步?( )
A.样品处理、凝胶色谱操作、SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
B.样品处理、凝胶色谱操作、纯化
C.样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定
D.样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定
解析:蛋白质的提取和分离分为样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定四步。A中凝胶色谱操作及SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳为实验操作过程中的技术。
答案:C
5.下列关于DNA的粗提取实验和血红蛋白的提取实验,叙述正确的是( )。
A.前者选择鸡血细胞作为实验材料较好,后者选择哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料较好
B.样品预处理时,前者静置1天处理除去上清液;后者需要加入清水,反复低速短时间离心洗涤,至上清液无黄色
C.在DNA粗提取实验中,往2 mol/L氯化钠溶液中加入蒸馏水析出DNA时,应该缓慢加入,直到出现黏稠物即止
D.洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐等
解析:鸡血细胞有细胞核,适于提取DNA;哺乳动物成熟红细胞无细胞核和众多细胞器,适用于提取血红蛋白。提取血红蛋白的实验中,洗涤红细胞时,不能加清水,应该加入生理盐水,否则细胞会提早释放出血红蛋白与杂质混合,加大提取难度。DNA初次析出时,加蒸馏水至黏稠物不再增加为止。洗涤红细胞的目的是去除杂质蛋白,以利于血红蛋白的分离和纯化。
答案:A
6.关于凝胶色谱柱的装填,除哪项外均为正确解释?( )
A.交联葡聚糖凝胶(Sephadex G/75)“G”表示凝胶的交联程度、膨胀程度及分离范围,75表示凝胶得水值
B.色谱柱内不能有气泡存在,一旦发现有气泡,必须重装
C.用300 mL物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12 h
D.凝胶用自来水充分溶胀后,配成凝胶悬浮液
解析:本实验中使用的交联葡聚糖凝胶(Sephadex G/75),其中G表示凝胶的交联程度、膨胀程度及分离范围,75表示凝胶得水值,即每克凝胶膨胀时吸水7.5 g;气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序,降低分离效果,因此,一旦发现有气泡,必须重装;在洗脱过程中,应在约50 cm高的操作压下,用300 mL物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12 h,以使凝胶装填紧密;凝胶溶胀时,应使用蒸馏水将其充分溶胀,制成凝胶悬浮液。
答案:D
7.下列各项中,一般不影响在凝胶色谱法分离蛋白质中的分离度的是( )。
A.层洗柱高 B.层洗柱的直径
C.缓冲溶液 D.样品的分布
解析:分离度取决于柱高,为分离不同组分,凝胶柱床必须有适宜的高度。样品的分布也影响分离度。缓冲溶液的pH影响蛋白质所带的电荷,因此也影响分离度。只有层洗柱的直径一般不影响分离度。
答案:B
8.已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种蛋白质分子,其分子大小、电荷的性质和电荷量情况如下图所示,下列有关蛋白质分离的叙述正确的是( )。
/
A.若将样品以2 000 r·min-1的速度离心10 min,分子戊存在于沉淀中,则分子甲也存在于沉淀中
B.若用凝胶色谱柱分离样品中的蛋白质,则分子甲移动速度最快
C.将样品装入透析袋中透析12 h,若分子乙保留在袋内,则分子丙也保留在袋内
D.若用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白质分子,则分子甲和分子丙形成的电泳带相距最远
解析:若用离心法分离蛋白质,则相对分子质量大的分子先沉淀下来,即丙在沉淀中。若用凝胶色谱柱分离样品中的蛋白质,则相对分子质量越小,移动越慢,即甲的移动速度最慢。将样品装入透析袋中透析12 h,若分子乙保留在袋内,则相对分子质量更大的丙也保留在袋内。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素,据图无法判断五种蛋白质在凝胶上的电泳带距离;为消除净电荷对迁移率的影响,可在凝胶中加入SDS使电泳的迁移率完全取决于分子的大小。
答案:C
9.下列关于凝胶色谱法的原理及操作,不正确的是( )。
A.是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法
B.在洗脱过程中,大分子不能进入凝胶内部而最先流出,而小分子可以进入凝胶内部而流速缓慢,以致最后流出
C.凝胶内部有很微细的多孔网状结构,其孔隙大小与被分离的物质分子的大小无相应关系
D.一般情况下,凝胶对要分离的物质没有吸附作用,因此所有要分离的物质都应该被洗脱出来
解析:凝胶色谱法是根据相对分子质量大小不同分离蛋白质的有效方法。凝胶是由多糖类化合物构成的,其内部有很微细的多孔网状结构,小分子蛋白质可以进入凝胶内部,路程较长,移动速度慢,而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部,路程较短,移动速度快,因此在洗脱过程中分离。选用不同种凝胶,其网状结构不同,孔隙大小不同,可分离的分子大小不同,二者是相关的,故C项不正确。
答案:C
10.在装填色谱柱时,不得有气泡存在的原因是( )。
A.气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序,降低分离效果
B.气泡阻碍蛋白质的运动
C.气泡能与蛋白质发生化学反应
D.气泡会在装填凝胶的时候使凝胶不紧密
解析:装填凝胶柱时,产生的气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序,从而影响分离效果。
答案:A
11.下面说法不正确的是( )。
A.在一定范围内,缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响,维持pH基本不变
B.缓冲溶液通常由1~2种缓冲剂溶解于水中配制而成
C.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
D.透析袋能使大分子自由进出,而将小分子保留在袋内
解析:透析袋一般是用硝酸纤维素(又叫玻璃纸)制成的。透析袋能使小分子自由进出,而将大分子保留在袋内。透析可以除去样品中相对分子质量较小的杂质,或用于更换样品的缓冲液。
答案:D
12.下列关于样品的加入和洗脱的操作,不正确的是( )。
A.加样前,打开色谱柱下端的流出口,使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面
B.用吸管小心地将1 mL透析后的样品加到色谱柱的顶端,不要破坏凝胶面
C.加样后,打开下端出口,使样品渗入凝胶床内
D.等样品完全进入凝胶层后,关闭下端出口
解析:选项A中,应该是使缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐,而不是下降到凝胶面的下面。其他选项符合凝胶色谱法的基本操作。
答案:A
13.血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分,负责血液中O2和部分CO2的运输。请根据血红蛋白的提取和分离流程图回答问题。
/
(1)将实验流程补充完整:A为 ,B为 。凝胶色谱法的基本原理是根据 而分离蛋白质。?
(2)洗涤红细胞的目的是去除 ,洗涤次数过少,无法除去 ;离心速度过高和时间过长会使 一同沉淀,达不到分离的效果。洗涤干净的标志是 。释放血红蛋白的过程中起作用的是 。?
(3)在洗脱过程中加入物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH为7.0)的目的是?
。如果红色区带 ,说明色谱柱制作成功。?
解析:本题考查血红蛋白提取和分离的实验步骤和基本操作。
答案:(1)血红蛋白的释放 样品的加入和洗脱 蛋白质相对分子质量的大小
(2)杂蛋白(血浆蛋白) 血浆蛋白 白细胞和淋巴细胞 离心后的上清液中没有黄色 蒸馏水和甲苯
(3)准确模拟生物体内的生理环境,保持体外的pH和体内的一致 均匀一致地移动
14.下图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置,请回答下列问题。
/
(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分,其在红细胞中的作用体现了蛋白质具有 功能。?
(2)甲装置中,B是血红蛋白溶液,则A是 ;乙装置中,C溶液的作用是 。?
(3)甲装置用于 ,目的是 。用乙装置分离蛋白质的方法叫 ,是根据 分离蛋白质的有效方法。?
(4)用乙装置分离血红蛋白时,待 时,用试管收集流出液,每5 mL收集一管,连续收集。?
解析:A表示磷酸缓冲液,B表示血红蛋白溶液,C表示缓冲液。甲装置可对血红蛋白粗分离,血红蛋白留在透析袋中,而小分子物质进入缓冲液。乙装置中的缓冲液(C)可对色谱柱中的血红蛋白进行洗脱。
答案:(1)运输
(2)磷酸缓冲液 洗脱血红蛋白
(3)透析(粗分离) 去除样品中相对分子质量较小的杂质 凝胶色谱法 相对分子质量的大小
(4)红色的蛋白质接近色谱柱底端
15.下面是某研究小组开展的“猪血浆某白蛋白的提取及相对分子质量测定”研究,请协助完成有关问题。
材料仪器:新鲜猪血、低速冷冻离心机、透析袋、电泳仪等。
化学试剂:pH为7.4的缓冲液、柠檬酸钠、奈氏试剂(与N
H
4
+
反应出现黄色或红棕色沉淀)、饱和(NH4)2SO4溶液、生理盐水等。
实验步骤:
(1)样品获取:向新鲜猪血中加入 ,静置一段时间后取上层血浆。?
(2)盐析法粗提蛋白质。
①向血浆中加入一定体积的饱和(NH4)2SO4溶液,使(NH4)2SO4的浓度达到50%,充分混合后静置、离心,取沉淀物。
②向沉淀物中加入适量生理盐水使之溶解,再向其中加入一定体积的饱和(NH4)2SO4溶液,使(NH4)2SO4的浓度达到33%,充分混合后静置、离心,取沉淀物。
③重复步骤①②2~3次,最后用生理盐水将沉淀溶解即得粗提品。
盐析粗提取“血浆某白蛋白”的主要原理是 ,重复步骤①②的主要目的是 。?
(3)透析除盐:将粗提品装入透析袋,以pH为7.4的缓冲液做透析液,每隔4 h更换一次透析液,每次更换前利用奈氏试剂检测透析液中N
H
4
+
的量。利用缓冲液做透析液的目的是 。检测中,若观察到透析液 时,即可终止透析。?
(4)凝胶色谱法分离:透析后的样品经凝胶柱洗脱,获得纯净血浆某白蛋白样品。
(5)相对分子质量测定:化学物质SDS能使蛋白质变性,解聚成单条肽链。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中加入一定量的SDS,使电泳迁移率完全取决于肽链的分子大小。
/
上图为本实验中用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血浆某白蛋白的结果。根据电泳结果,某同学得出“提取的血浆某白蛋白有两条肽链”的结论,这种说法可靠吗?理由是?
?
。?
解析:(1)为防止血液凝固,在采血容器中要预先加入抗凝血剂柠檬酸钠。(2)利用血浆某白蛋白在一定浓度(NH4)2SO4溶液中的溶解度低的特性去除杂蛋白。(3)过酸、过碱、温度过高都会使蛋白质变性。(5)电泳的原理是利用待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子的大小、形状的不同,使带电分子产生不同的迁移速度。本实验只能判断肽链的大小,而不能判断其条数。
答案:(1)(适量的)柠檬酸钠
(2)该血浆白蛋白在50%和33%的(NH4)2SO4溶液中溶解度低 除去更多的杂蛋白
(3)防止pH变化对蛋白质结构的影响 不出现黄色或红棕色沉淀
(5)不可靠,只能得出提取的血浆某白蛋白含有两种大小不同的肽链,不一定是两条
专题5 DNA与蛋白质技术
课题5.3 血红蛋白的提取和分离
一、【课题目标】
（一）知识与技能
1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白
2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理
???（二）过程与方法
体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，注意按照操作提示进行相关步骤
（三）情感、态度与价值观
初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神
二、【课题重点】
凝胶色谱法的原理和方法
三、【课题难点】
样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填
四、【教学方法】
启发式教学
五、【教学工具】
多媒体课件
六、【教学过程】
（一）引入新课
蛋白质是生命活动的主要承担者，是细胞内含量最高的有机化和物。对蛋白质的研究有助于人们对生命过程的认识和理解。所以需要从细胞中提取蛋白质进行研究。怎样提取蛋白质呢？
（二）进行新课
1．基础知识
蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。
1．1凝胶色谱法（分配色谱法）：
（1）原理：（图5－13a）分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。
（2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。
（3）分离过程：（图5－13b）
混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子
＊洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。
1．2缓冲溶液
（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3，HC－NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。
（2）缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。
1．3凝胶电泳法：
（1）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。
［思考］阅读教材后，填写下表：
决定运动方向
形成库仑力
形成阻力
决定运动速率
电荷性质
√
电荷量
√
√
分子形状
√
√
分子大小
√
√
（2）分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺经胶电泳等。
（3）分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。
2．实验设计
2.1蛋白质的提取和分离一般分为哪些基本步骤？
样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。
思考：是否所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的？为什么？
不是。因为蛋白质的来源和性质不同，分离方法差别很大。
2.2选择实验材料
（1）你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？
哺乳动物血液。因为该细胞中没有细胞核，血红蛋白含量高。
（2）请阅读教材，认识哺乳动物血液组成及血红蛋白性质。并思考回答下列问题：
血液由 和 两部分组成。
血细胞中 细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是 。
该化合物是由 和 构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的 基团。
2.3从红细胞中分离出血红蛋白的过程为：洗涤红细胞、释放血红蛋白、分离血红蛋白、透析。洗涤红细胞的目的是什么？
除去血浆蛋白的杂蛋白，有利于后续步骤的分离纯化。
红细胞的洗涤过程为
血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍体积生理盐水 →缓慢搅拌10min→低速短时离心→吸出上清液→反复洗涤直至上清液无黄色
思考：加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？
防止血液凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。
思考：你有什么方法将红细胞中的血红蛋白释放出来？
加入蒸馏水，用玻璃棒快速搅拌一段时间。
补充：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。此时，红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白，而且还含有细胞破碎物、脂质、甲苯有机溶剂等。怎样除去这些杂质呢？由于它们的密度不同，科学家采取了离心分离的方法：
红细胞破碎混合液→中速长时离心（2000c/min×10min）→滤纸过滤除去脂质→分液漏斗分离出血红蛋白
2.4如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？。
透析。半透膜的选择透过性，大分子物质不能通过半透膜，离子和小分子能够通过半透膜。
在透析过程中，血红蛋白溶液中的离子和小分子不断通过半透膜扩散进入到pH＝7的磷酸缓冲液中。
思考：为何使用pH＝7的磷酸缓冲液？为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量？
维持血红蛋白的正常特性。有利于杂质分子充分地向外扩散。
总结：通过以上四个基本过程，红细胞中的血红蛋白就被提取出来。但其中还含有其他种类的蛋白质分子（如呼吸酶等）。怎样将杂蛋白与血红蛋白分离开来呢？我们来研究蛋白质提取和分离的第二个步骤――粗分离（凝胶色谱操作）。
2.5凝胶色谱分离蛋白质包括：制作色谱柱、装填色谱柱、样品加入和洗脱。
根据教材图5－19，说出制作色谱柱需要的材料。
橡皮塞2个、打孔器、小刀、移液管、尼龙纱、尼龙网、玻璃管、尼龙管等。
色谱柱的制作过程：准备材料→加工橡皮塞→安装色谱柱
下面进行第二步――凝胶色谱柱的装填。请阅读教材：
色谱柱的装填过程。
步骤
操作要求
①
操作要求
色谱柱垂直固定在支架上
②
计算称量凝胶
根据色谱柱体积计算凝胶用量
③
配制悬浮液
凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀
凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴
④
装填悬浮液
一次性缓慢倒入；轻轻敲打
⑤
缓冲液洗涤平衡
立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h
样品加入和洗脱。其基本过程是：
调节缓冲液面→加入蛋白质样品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质
至此，血红蛋白即可得到粗分离。在整个操作过程中，应当注意以下事项：
（1）红细胞的洗涤：
洗涤次数不能过少；低速、短时离心。
（2）凝胶的预处理：
沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡
（3）色谱柱的装填：
装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。
（4）色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。
（三）课堂总结、点评
（四）实例探究
例1 利用凝胶色谱法，什么样的蛋白质先洗脱出来（ ）
A. 相对分子质量大的
B. 溶解度高的
C. 相对分子量小的
D. 所代电荷多的
解析：凝集色谱法使根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。相对分子质量较小的蛋白质能进入凝胶内部通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量大的蛋白质，路程较短，移动速度较快，首先洗脱出来。
答案：A
例2 蛋白质提取和分离分为哪几步（ ）
A. 样品处理、凝胶色谱操作、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
B. 样品处理、凝胶色谱操作、纯化
C. 样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定
D. 样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定
解析：蛋白质的提取和分离分为样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定四步。A中凝胶色谱操作及SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳为实验操作过程中的技术
答案：C
☆综合应用
例3用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质（ ）
A路程较长，移动速度较慢 B路程较长，移动速度较快
C路程较短，移动速度较慢 D路程较短，移动速度较快
解析：在小球体内部有许多贯穿的通道，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。
答案：D
（五）巩固练习
1. 凝胶色谱法分离蛋白质的依据是（ ）
A. 对其他分子的亲和力
B. 溶解度
C. 所带电荷多少
D. 相对分子质量的大小
2. 凝胶色谱法中所用的凝胶化学本质大多是（ ）
A. 糖类化合物
B. 脂质
C. 蛋白质
D. 核酸
3. 选用红细胞作为分离蛋白质的实验材料，有何好处（ ）
A. 血红蛋白是有色蛋白
B. 红细胞无细胞核
C. 红细胞蛋白质含量高
D. 红细胞DNA含量高
4. 将搅拌好的混合液离心来分离血红蛋白溶液时，第二层是（ ）
A. 甲苯
B. 血红蛋白水溶液
C. 脂溶性物质的沉淀层
D. 其他杂质的沉淀
5. 血红蛋白因含有（ ）而呈红色
A. O2 B. CO C. CO2 D.血红素
6. 下列操作正确的是（ ）
A. 分离红细胞时采用低速长时间离心
B. 红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可
C. 分离血红蛋白溶液是低速短时间离心
D. 透析时要用20mmol/l的磷酸缓冲液，透析12h
7. 样品的加入和洗脱的叙述正确的是（ ）
A. 先加入1ml透析后的样品
B. 加样前要使缓冲液缓慢下降全部流出
C. 如果红色带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功
D. 洗脱时可以用缓冲液也可以用清水
8. 下列有关提取和分离血红蛋白的程度叙述错误的是（ ）
A. 样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液
B. 通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取
C. 可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化
D. 可通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度
9. 凝胶色谱法操作正确的是（ ）
A. 将橡皮塞上部用刀切出锅底状的凹穴
B. 将橡皮塞下部切出凹穴
C. 插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面
D. 将尼龙网剪成与橡皮塞下部一样大小的圆片
10. 样品的加入和洗脱的操作不正确的是（ ）
A. 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面
B. 加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内
C. 等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口
D. 用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面
答案：1. D 2.A 3.A 4.D 5.D 6.D 7.C 8.B 9.A 10.D
七、【课余作业】
1、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？
2、与其他真核细胞相比较，红细胞有什么特点？这对你进行蛋白质的分离和提取有什么意义？
八、【教学体会】
本课题重在让学生了解生物科学在蛋白质领域的进展，说明提取、分离高纯度的蛋白质的重要性和必要性，并学习一些蛋白质分离和提取的基本技术。教师可以发挥学生的主动性，让学生介绍当前有关蛋白质研究的新进展，激发学生的学习兴趣，然后指出本课题的学习意义，让薛生初步体会分离纯化蛋白质的过程和方法
九、【资料袋】
凝胶色谱法分离蛋白质的原理
凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一。所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成，小球体内部有许多贯穿的通道，当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时，各分子在色谱柱内进行两种不同的运动，即垂直向下的运动和无规则的扩散运动，相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，这种现象又叫分子筛现象。此外，凝胶本身具有三维网状结构，相对分子质量大的分子通过这种网状结构上的空袭时阻力大，而相对分子质量小的分子通过时阻力小，因此不同分子量的蛋白质分子可以获得分离。
课件29张PPT。专题5 DNA和蛋白质技术 课题3 血红蛋白的提取和分离蛋白质是生命活动不可缺少的物质。随着人类基因组计划的进展以及多种生物基因组测序工作的完成，人类跨入了后基因组和蛋白质组时代。对蛋白质的研究与应用，首先需要获得纯度较高的蛋白质。因此，从复杂的细胞混合物中提取、分离高纯度的蛋白质是生物科学研究中经常要做的工作
请思考：
1．怎样从血细胞中提取血红蛋白呢？
2．用猪血和鸡血提取血红蛋白，效果一样吗？
1．概念
____________是根据____________________分离蛋白质的有效方法，也称作分配色谱法。
一、凝胶色谱法——血红蛋白的分离方法
凝胶色谱法 相对分子质量的大小 多孔球体 多糖类化合物 贯穿的通道 (2)分离原理：
①相对分子质量较小的蛋白质：容易进入________的通道，路程________，移动速度较慢，通过凝胶柱的时间________。
②相对分子质量较大的蛋白质：无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程________，移动速度较快，通过凝胶柱的时间________。 凝胶内部 较长 较长 较短 较短 二、缓冲溶液
1．作用
在一定范围内，缓冲溶液能够抵制______________对溶液pH的影响，维持pH基本不变。
2．配制
通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成，调节缓冲剂的____________就可以制得在______________________________的缓冲液。
外界的酸和碱 使用比例 不同pH范围内使用 三、电泳——血红蛋白的分离或鉴定方法
1．概念
带电粒子在________的作用下发生________的过程。
2．原理
(1)许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有________________，在一定的pH下，这些基团会带上________或________。
电场 迁移 可解离的基团 正电 负电 (2)在电场的作用下，这些带电分子会向着______________________________移动。
(3)电泳利用了待分离样品中各种分子________________以及分子本身的________、________的不同，使带电分子产生不同的__________，从而实现样品中各种分子的分离。 与其所带电荷相反的电极 带电性质的差异 大小 形状 迁移速度 四、蛋白质的提取和分离过程
蛋白质的提取和分离一般分为四步：________、粗分离、________和纯度鉴定。
样品处理 纯化 一、血红蛋白的提取和分离的原理
1．蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析2.电泳原理及方法
电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH中会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。
例1关于电泳的说法不正确的是( )
A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B．带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动
C．蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少
D．用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子的大小解析：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质－SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。
答案：C变式
训练1．凝胶色谱法是分离蛋白质分子的一种常用方法。但并非所有的蛋白质都可用此方法进行分离。能分离的蛋白质分子之间必须( )
A．具有相同的相对分子质量
B．相对分子质量不同，但都是相对分子量较大的分子
C．相对分子质量不同，但都是相对分子质量较小的分子
D．具有相对分子质量不同的蛋白质
变式
训练解析：若在每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内的各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子较小的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝捍材谝贫?嗬虢隙蹋?肿咏闲〉囊贫?嗬虢铣ぁＳ谑欠肿咏洗蟮南韧ü??床而分子较小的后通过凝胶床，这样就利用分子筛可将分子量不同的物质分离。分子量大小不同的多种成分在通过凝胶床时，按照分子量大小“排队”，凝胶表现出分子筛效应。
答案：D
二、血红蛋白的提取和分离的实验操作
1．样品处理
(1)红细胞的洗涤：洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白。采用低速短时间离心，吸出上层透明的黄色血浆，再加入五倍体积的生理盐水，重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。洗涤次数过少，无法去除血浆蛋白；离心速度过高和时间过长会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，达不到分离的效果。
(2)血红蛋白的释放：红细胞在蒸馏水和甲苯的作用下破裂，释放出血红蛋白。
(3)分离血红蛋白溶液：将混合液进行离心后，会明显看到试管中的溶液的分层情况：第3层的红色透明液体是血红蛋白的水溶液。
(4)透析：目的是除去样品中的相对分子质量较小的杂质。
2．凝胶色谱操作
(1)凝胶色谱柱的装填：
①装填前，凝胶用蒸馏水或者洗脱液充分溶胀。
②凝胶装填要均匀，色谱柱内不能有气泡，一旦发现存在气泡，必须重装。
③装填完后，立即用300 mL 20 mmol/L磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶，使凝胶装填紧密。
(2)样品的加入和洗脱：
①加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。
②按正确方法加样，不能破坏凝胶面。
③进行洗脱时，等红色蛋白质接近色谱柱底端时，采用试管收集。
例2 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳法中加入SDS的作用是( )
A．增大蛋白质的相对分子质量
B．改变蛋白质分子的形状
C．掩盖不同蛋白质分子间的电荷差别
D．减少蛋白质分子的相对分子质量解析：SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二、三级结构。在样品和凝胶中加入还原剂SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白－SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。
答案：C
2．下列对凝胶电泳的相关认识，错误的是( )
A．蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率只取决于分子的大小
B．蛋白质在SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率完全取决于分子的大小
C．SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳不仅用于蛋白质相对分子质量的测定，还可用于蛋白质混合组分的分离
D．凝胶中加入SDS可以消除净电荷对迁移率的影响
变 式
训 练解析：电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，而SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量，是根据大多数蛋白质都能与阳离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然变 式
训 练蛋白质分子的负电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质分子相对迁移率的大小完全取决于相对分子质量的高低。
答案：A变 式
训 练专题五 课题3
一、选择题
1．凝胶色谱法是根据( )分离蛋白质的有效方法。 ( )
A．分子的大小 B．相对分子质量的大小
C．带电荷的多少 D．溶解度
[答案] B
[解析] 凝胶色谱法分离蛋白质依据的是蛋白质相对分子质量的大小。
2．缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持( )基本不变
A．温度 B．pH
C．渗透压 D．氧气浓度
[答案] B
[解析] 缓冲液可维持溶液在一定范围内的pH稳定。
3．电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷( )的电极移动
A．相同 B．相反
C．相对 D．相向
[答案] B
[解析] 电泳时，离子移动的方向应与其所带电荷相反。
4．在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理过程中，分析无误的是
A．洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐
B．洗涤时离心速度过低，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果
C．洗涤过程选用0.1%的生理盐水
D．透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质
[答案] D
[解析] 在蛋白质的提取和分离中，透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质。
5．下列操作正确的是 ( )
A．分离红细胞时采用低速长时间离心
B．红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水即可
C．加样之前不需要调整缓冲液的液面
D．透析时要用20mmol/L的磷酸缓冲液，透析12h
[答案] D
二、非选择题
6．红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成的，血红蛋白的主要功能是携带O2或CO2，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题： (1)血红蛋白提取和分离的程序可分为四步：________、________、________和________。
(2)实验前取新鲜的血液，切记要在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。
①加入柠檬酸钠的目的是___________________________________________________
________________________________________________________________________。
②以上所述的过程即是样品处理，它包括________、________、收集血红蛋白溶液。
③收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗分离。
①透析的目的是____________________________________________________
________________________________________________________________________。
②透析的原理是____________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)纯度鉴定时最常用的方法是SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳。
①样品纯化的目的是______________________________________________________
________________________________________________________________________。
②血红蛋白有什么特点____________________________。这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？___________________________________________________
________________________________________________________________________。
[答案] (1)样品处理 粗分离 纯化 纯度鉴定
(2)①防止血液的凝固 ②红细胞的洗涤 血红蛋白的释放
(3)①除去相对分子质量较小的杂质 ②透析袋能使小分子物质自由进出，而大分子物质被保留在袋内
(4)①通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去 ②血红蛋白呈现红色 在用凝胶色谱法分离时可以通过观察颜色来判断什么时期应该收集洗脱液；同时通过观察颜色使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作
[解析] 本题主要考查蛋白质提取和分离的相关知识，具体分析如下：
一、选择题
1．为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入下列哪一种抗凝血剂
A．NaCl B．甲苯
C．蒸馏水 D．柠檬酸钠
[答案] D
[解析] 柠檬酸钠是血液常用的凝固剂。
2．将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层，其中第3层是 ( )
A．无色透明的甲苯层
B．脂溶性物质的沉淀层
C．血红蛋白的水溶液
D．其他杂质的暗红色沉淀物
[答案] C
[解析] 混合液离心后的第3层为血红蛋白的水溶液。
3．红细胞的洗涤过程错误的是 ( )
A．低速短时间离心，如500r/min离心2min
B．离心后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆
C．将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的蒸馏水
D．直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净
[答案] C
4．在装填凝胶柱时，不得有气泡存在的原因是 ( )
A．气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果
B．气泡阻碍蛋白质的运动
C．气泡能与蛋白质发生化学反应
D．气泡会在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密
[答案] A
[解析] 装填凝胶柱时，若有气泡存在，则气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。
二、非选择题
5．如图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请据图回答下列问题。
(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，它在红细胞中的作用体现了蛋白质具有________功能。
(2)甲装置中，B是血红蛋白溶液，则A是________；乙装置中，C溶液的作用是________________________________________________________________________。
(3)甲装置用于________，目的是____________________________________________。用乙装置分离蛋白质的方法叫________。
(4)用乙装置分离血红蛋白时，待________时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集。
[答案] (1)运输
(2)磷酸缓冲溶液 洗脱血红蛋白
(3)透析(粗分离) 去除样品中相对分子质量较小的杂质 凝胶色谱法
(4)红色的蛋白质接近色谱柱的底端
[解析] 用透析法(如图甲)对血红蛋白进行粗分离，将血红蛋白溶液装入透析袋中，可以除去样品中分子较小的杂质。血红蛋白的纯化采用凝胶色谱法(如图乙)，血红蛋白相对分子质量较大，无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路径较短，移动速度较快，可以收集到红色的蛋白质。
