课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段
学习目标：1.理解PCR的原理。(重点) 2.体验PCR这一常规的分子生物学实验的方法。(难点) 3.了解PCR的应用。(重点)
1．PCR扩增的原理和过程
(1)细胞内DNA复制过程的解析
解旋：在解旋酶作用下，DNA两条链打开，形成两条DNA单链
↓
引物结合：在DNA单链3′端，通过碱基互补配对与DNA母链结合
↓
DNA聚合酶结合：DNA聚合酶与模板链结合，标志着单链合成 开始
↓
子链合成：DNA聚合酶从引物3′端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来
↓
后续加工：将引物切去，并合成空缺处的DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来，子链和母链再形成双螺旋结构
(2)PCR技术的原理
①PCR技术：即多聚酶链式反应，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。
②子链扩增：需要引物，合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。
③解旋原理：DNA的热变性原理。在80～100_℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。
④条件
ⅰ模板：DNA的两条链。
ⅱ引物：分别与模板DNA两条模板链相结合的两种小的核酸片段。
ⅲ原料：A、T、G、C四种脱氧核苷酸。
ⅳ酶：耐热DNA聚合酶，一般用耐高温的TaqDNA聚合酶。
ⅴ其他条件：需要一定的缓冲溶液和能严格控制温度的温控设备。
(3)PCR技术的过程
①变性
当温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解旋为单链。
②复性
温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③延伸
温度上升到72 ℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
2．PCR的实验操作及操作提示
(1)实验用具
①PCR仪：该仪器能自动调控温度，实现DNA的扩增。如果没有PCR仪，可用3个恒温水浴锅代替，操作时按程序在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。
②微量离心管：总容积为0.5 mL，实际上是进行PCR反应的场所。
③微量移液器：用于向微量离心管中转移PCR配方中的液体。
(2)实验操作程序
准备：按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上
↓
移液：用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各组分
↓
混合：盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁，使反应液混合均匀
↓
离心：将微量离心管放在离心机上，离心约10 s。目的是使反应液集中在离心管底部
↓
反应：将离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应
(3)实验操作注意事项
①为避免外源DNA等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行高压灭菌。
②所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20_℃储存。
③在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换。
(4)DNA含量的测定
①原理：利用DNA在260_nm的紫外线波段的吸收峰曲线来测定相应含量。
②计算公式：
DNA含量(μg/mL)＝50×(260_nm的读数)×稀释倍数。
1．判断对错
(1)PCR技术利用的是碱基互补配对原则。 ( )
(2)PCR技术可用于基因诊断、判断亲缘关系等。 ( )
(3)PCR技术需在体内进行。 ( )
(4)PCR技术可能为变性、复性、延伸三个阶段。 ( )
提示：(1)√ (2)√
(3)× PCR技术是聚合酶链式反应的简称，是在体外快速大量复制DNA片段的一种新技术。
(4)√
2．PCR技术控制DNA的解聚与结合是利用了DNA的( )
A．特异性 B．稳定性
C．热变性 D．多样性
C [DNA分子在80～100 ℃的温度范围内变性，双链解开成单链；当温度缓慢降低时，又能重新结合形成双链。]
PCR扩增的原理和过程
[合作交流]
1．什么是引物？DNA复制时为什么需要引物？
提示：所谓引物是指两段与待扩增的DNA序列互补的一小段DNA或RNA片段。在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，因此克隆DNA时应加入两种引物。
2．PCR扩增DNA过程中是否还需要解旋酶？
提示：不需要。
3．PCR技术中需要的两种引物碱基序列相同吗？为什么？
提示：不同。由于DNA两条模板链中碱基序列并不相同，引物需要分别与两条模板链进行碱基互补配对，因此DNA两条模板链在进行扩增时，需要的引物碱基序列是不同的。
1．生物体内的DNA复制与PCR反应的比较
体内DNA复制
PCR反应
不同点
解旋
在解旋酶的作用下，边解旋边复制
加热至90℃以上时，双链全部解开
酶
解旋酶、DNA聚合酶
耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)
引物
一小段RNA
RNA或单链DNA分子片段
合成
子链
一条子链连续合成，另一条子链不连续合成
两条子链都是连续合成
温度
体内温和条件
高温
相同点
①都需提供DNA复制的模板
②都需要四种脱氧核苷酸原料
③都需要分别与两条模板链相结合的两种引物
④子链延伸的方向都是从5′端到3′端
2.PCR的反应过程(如图所示)
PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。在循环之前，常要进行一次预变性，以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。
特别提醒：(1)耐热的DNA聚合酶一般用Taq DNA聚合酶。Taq DNA聚合酶是从水生耐热细菌Taq(发现于美国黄石国家公园的一个热泉中)中分离得到的。耐高温的Taq DNA聚合酶的发现和应用解决了高温使酶失活的问题，大大增加了PCR的效率，使PCR技术趋向自动化。
(2)从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增(例如，若只有一个DNA作为模板，则复制n次后，DNA数目为2n)。
[典题通关]
多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历三十多次下述循环：95 ℃下变性(使模板DNA解旋)→55 ℃下复性(引物与DNA模板链结合)→72 ℃左右延伸(形成新的脱氧核苷酸链)。下列有关PCR过程的叙述中，不正确的是( )
A．在PCR的变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，DNA在人体细胞内复制时可利用解旋酶实现
B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依据碱基互补配对原则完成的
C．延伸过程中需要耐高温的DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸
D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高
C [变性是为了使DNA内部的氢键断裂，双螺旋打开，DNA在人体细胞内复制时借助解旋酶来实现；根据碱基互补配对原则，引物可与DNA模板链结合；延伸是形成新的DNA分子，需要以四种脱氧核苷酸为原料；PCR过程所需温度较高，会导致一般的DNA聚合酶失活，需特定的耐高温的DNA聚合酶。]
(1)DNA的复性过程是不是两条母链重新螺旋化成为双链DNA分子的过程？
(2)某DNA分子通过PCR技术扩增了n次，含某种引物的DNA分子数目是多少？
提示：(1)不是，复性是指温度降低到55 ℃时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合的过程。
(2)一个DNA分子经过n次扩增，共形成2n个DNA分子，其中只有两个DNA分子只含有一个引物(引物Ⅰ和引物Ⅱ)，其余的DNA分子同时含有两种引物，所以含某种引物的DNA分子数目为2n－1。
有关PCR技术的下列叙述，不正确的是( )
A．聚合酶链式反应，是用DNA聚合酶在体外扩增DNA片段的技术
B．在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似
C．PCR反应需在一定的缓冲溶液中进行，只需提供DNA模板以及四种脱氧核苷酸即可
D．PCR一般经历三十多次循环，每次循环均分为变性、复性和延伸三个阶段
C [PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行，需提供DNA模板、分别与两条模板链相结合的两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。]
PCR技术的实验操作
[合作交流]
1．PCR循环过程中，变性温度设置95 ℃，时间设置30 s的原因是什么？
提示：变性温度过低，解旋不完全导致DNA不能扩增，变性温度过高影响酶的活性；在此温度条件下如果处理时间过长，将会导致酶的钝化。
2．在PCR过程中，延伸的温度为什么控制在72 ℃？
提示：在72 ℃左右时，Taq DNA聚合酶活性最高。在TaqDNA聚合酶的作用下，合成新的DNA链。
1．DNA含量的测定
DNA在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA含量有关。可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定，具体方法如下：
—
↓
—
↓
—
↓
—
2．PCR技术的应用
(1)医学上用该技术分析人的精液，对细菌、病毒感染进行早期诊断。
(2)对单细胞中的DNA进行扩增，用于遗传病的基因诊断，并在此基础上进一步制备无突变的DNA片段供遗传病患者基因治疗时使用。
(3)法医学用此技术来鉴别罪犯或进行亲子鉴定。
(4)古生物学用此技术分析古生物化石样品，追溯其生存年代或迁徙踪迹。
(5)在农业生物技术中，可运用此技术检测目的基因是否已经成功导入目标生物等。
[典题通关]
聚合酶链式反应(PCR技术)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由变性、复性及延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，其简要过程如图所示。下列关于PCR技术的叙述，不正确的是( )
A．PCR技术是在实验室中以少量DNA制备大量DNA的技术
B．反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板
C．PCR技术中以核糖核苷酸为原料，以指数方式扩增
D．应用PCR技术与探针杂交技术可以检测基因突变
C [PCR技术是人工合成DNA的方法，原料是脱氧核苷酸而不是核糖核苷酸。]
(1)PCR反应过程中最重要的就是温度控制，DNA变性、复性及延伸分别需要怎样的温度条件？
(2)在教材P62中的PCR反应体系的配方中，除了有模板DNA、原料、引物、聚合酶等外，还要加入缓冲液，加入缓冲液的目的是什么？
提示：(1)变性为95 ℃，复性为55 ℃，延伸为72 ℃。
(2)维持PCR反应所需要的pH。
使用PCR仪的具体实验操作顺序应为( )
①设计好PCR循环程序
②按配方准备好各组分
③用微量移液器向微量离心管中依次加入各组分
④进行PCR反应
⑤离心，使反应物集中在离心管底部
A．②③⑤④① B．①⑤③②④
C．②③⑤①④ D．④②⑤③①
C [PCR反应的操作步骤一般分为准备(包括将配方所需各组分放于实验台上)→移液→混合→离心→反应。因PCR仪是一种能自动控制温度的仪器，设计好循环程序就可以进行反应了。]
[课堂小结]
知 识 网 络 构 建
核 心 语 句 归 纳
1.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链，因此，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。
2．PCR反应需要DNA模板、两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶等条件。
3．PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。
4．PCR每次循环都包括变性、复性和延伸三步，对应的温度分别为95 ℃、55 ℃和72 ℃。
5．DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列。
6．PCR扩增DNA片段可以使目的片段呈指数增长。
1．PCR技术扩增DNA，需要的条件是( )
①目的基因 ②引物 ③四种脱氧核苷酸 ④DNA聚合酶等 ⑤mRNA ⑥核糖体
A．①②③④ B．②③④⑤
C．①③④⑤ D．①②③⑥
A [PCR技术需要目的基因作为扩增的模板，DNA聚合酶催化反应的进行，而引物是满足DNA聚合酶起作用的需要，四种脱氧核苷酸是该过程的原料。]
2．下图中PCR第二轮产物a、b、c、d分别是以PCR第一轮产物的哪一条单链DNA为模板复制产生的( )
A．②①③④ B．①③②④
C．①②④③ D．①②③④
D [因为PCR的反应过程需要引物，在第二轮循环过程中，a、d的引物分别为Ⅰ、Ⅱ，无引物的为模板链(即①、④)，则b、c的模板链分别为②、③。故选D。]
3．下列关于操作过程的叙述，错误的是( )
A．PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌
B．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存
C．PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化
D．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换
C [在冰箱中放置的缓冲液和酶从冰箱中取出后应放在冰块上缓慢融化，而不能迅速融化，即C项错误。故选C。]
4．在遗传病及刑事侦破案件中常需要对样品DNA进行分析，PCR技术能快速扩增DNA片段，在几个小时内复制出上百万份的DNA拷贝，有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。据图回答相关问题：
(1)在相应的横线上写出引物Ⅱ，并在复性这一步骤中将引物Ⅱ置于合适的位置。
(2)在相应的横线上写出循环一次后生成的DNA分子。
(3)若将作为原料的4种脱氧核苷酸用32P标记，请分析循环一次后生成的DNA分子的特点：____________________，循环n次后生成的DNA分子中不含放射性的单链占总单链的比例为________。
(4)PCR反应过程的前提条件是________，PCR技术利
用DNA的________原理解决了这个问题。
(5)在对样品DNA进行分析的过程中发现，DNA掺杂着一些组蛋白，要去除这些组蛋白可加入的物质是________。
[解析] (1)DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链，所以引物就提供了3′端，子链延伸方向为5′→3′，引物Ⅰ与b链部分碱基互补，引物Ⅱ则与a链部分碱基互补，且连接到a链的3′端，故引物Ⅱ的结构为5′—G—A—OH，复性结果为：
HO—A—G—5′
5′—G—G……T—C—3′
(2)经过一次循环后，产生的两个DNA分子分别含有引物Ⅰ和引物Ⅱ。
(3)由于作为原料的4种脱氧核苷酸被32P标记，所以新合成的子链均含有放射性，一次循环后的两个DNA中各有一条链含32P，若复制n次，共产生子链2n×2，其中只有DNA母链不含32P，则其所占比例为2/(2n·2)＝1/2n。
(4)DNA复制是以两条母链为模板，按照碱基互补配对原则进行的。因此，首先要解旋，使两条母链的碱基暴露出来，才能按照碱基互补配对原则把相应的碱基一个个地连接起来。DNA分子在80～100 ℃的温度范围内变性，双链解开成单链，当温度慢慢降低时，又能重新结合形成双链。
(5)DNA中杂质蛋白的去除可利用酶的专一性，加入蛋白酶。
[答案] (1)5′—G—A—OH
HO—A—G—5′
5′—G—G……T—C—3′ 3′—C—C……A—G—5′
72 ℃↓
(2)3′—C—C……A—G—5′ 5′—G—G……T—C—3′ 5′—G—G……T—C—3′ 3′—C—C……A—G—5′
(3)每个DNA分子各有一条链含32P 1/2n
(4)DNA解旋 热变性
(5)蛋白酶
课件64张PPT。专题5 DNA和蛋白质技术课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段解旋 3′ 碱基互补配对 DNA聚合 3′ 引物 DNA连接 双螺旋 多聚酶链式反应 体外 扩增DNA片段 DNA 引物 5′ 3′ 80～100 ℃ 变性 降低 结合成双链 模板 引物 脱氧核苷酸 耐热DNA聚合 缓冲 解旋 碱基互补配对 碱基互补配对 温度 恒温 0.5 微量移液器 混合均匀 离心管底部 PCR仪 高压灭菌 小份 －20 ℃ 更换 260 nm 50×(260 nm的读数) PCR扩增的原理和过程 PCR技术的实验操作 点击右图进入…Thank you for watching !课时分层作业(十三) 多聚酶链式反应扩增DNA片段
(建议用时：35分钟)
[基础达标练]
1．DNA的复制需要引物，主要原因是( )
A．可加快DNA的复制速度
B．引物可与DNA母链通过碱基互补配对结合
C．引物的5′端有助于DNA聚合酶的延伸DNA链
D．DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链
D [DNA聚合酶不能从5′端开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。]
2．下列属于PCR技术的条件的是( )
①单链的脱氧核苷酸序列引物 ②目的基因所在的DNA片段 ③脱氧核苷酸 ④核糖核苷酸 ⑤DNA连接酶 ⑥耐热的DNA聚合酶 ⑦DNA限制性核酸内切酶
A．①②③⑤ B．①②③⑥
C．①②③⑤⑦ D．①②④⑤⑦
B [PCR技术的条件：模板，本题为第②项；引物，本题为第①项；原料，本题为第③项；酶，本题为第⑥项。]
3．下列有关PCR的描述，不正确的是( )
A．是一种酶促反应
B．反应需要引物
C．扩增产量按y＝(1＋x)n计算
D．扩增对象是氨基酸序列
D [PCR是一种需要耐热DNA聚合酶参与的，且需要引物的酶促反应，与细胞内DNA复制不同的是，整个过程中温度是变化的。PCR扩增的对象是DNA序列。故选D。]
4．标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是( )
A．95 ℃、55 ℃、72 ℃ B．72 ℃、50 ℃、92 ℃
C．50 ℃、92 ℃、72 ℃ D．80 ℃、50 ℃、72 ℃
A [当温度上升到90 ℃(90～96 ℃)以上时，双链DNA解聚为单链，称之为变性；当温度下降到50 ℃(40～60 ℃)左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，称为复性；当温度上升到72 ℃(70～75 ℃)时，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在TaqDNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，称为延伸。]
5．PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。下列防止污染的方法中不正确的是( )
A．将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行
B．吸样枪吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，枪头小套、小离心管应一次性使用，以免交叉污染
C．所有PCR试剂都应放置于大瓶分装，以减少重复加样次数，避免污染机会
D．PCR试剂、PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱
C [所有的PCR试剂都应放置于小瓶分装，一次性用完，避免因多次使用造成污染。]
6．下列有关PCR技术的说法中，不正确的是( )
A．PCR技术是在细胞内完成的
B．PCR技术是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术
C．PCR技术的原理与DNA复制的原理相同
D．PCR技术的前提是有一段已知的目的基因的核苷酸序列
A [PCR技术是在生物体外进行DNA复制的技术，其原理与DNA复制的原理相同，但前提是必须要有一段已知的目的基因的核苷酸序列和根据核苷酸序列合成的引物。]
7．PCR实验中使用的微量离心管、缓冲溶液以及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是( )
A．反复洗涤 B．用酒精擦洗
C．高压灭菌 D．在－20 ℃储存
C [为了避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、缓冲溶液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。PCR所用的缓冲溶液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需的试剂从冰箱内拿出，放在冰块上缓慢融化。故选C。]
8．PCR操作过程中，对于温度的控制，应当控制在( )
A．37 ℃
B．室温
C．80 ℃
D．先为95 ℃，然后降至55 ℃，最后调至72 ℃
D [利用PCR技术体外扩增DNA时，不需要解旋酶，而是通过加热破坏双螺旋结构。然后再降温至55 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。]
9．在进行DNA亲子鉴定时，需大量的DNA。PCR技术(多聚酶链式反应)可以使样品DNA扩增，获得大量DNA克隆分子。该技术的原理是利用DNA的半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如下图，图中黑色长方形是引物)。
(1)图中的变性、延伸分别是指______、__________________。
(2)假设PCR反应中的DNA模板为P，第一轮循环的产物2个子代DNA为N1，第二轮的产物4个子代DNA为N2，N1、N2中分别含有模板DNA单链的DNA分别有________个、________个。若继续循环，该DNA片段共经过30次循环后能形成________个DNA片段。
(3)某样品DNA分子中共含3 000个碱基对，碱基数量满足：＝，若经5次循环，至少需要向试管中加入________个腺嘌呤脱氧核苷酸。(不考虑引物所对应的片段)
(4)若下图为第一轮循环产生的产物，请绘出以a链和b链为模板经PCR扩增的产物。
[解析] (1)变性的实质是DNA双链解旋；延伸的实质是以DNA单链为模板，按照碱基互补配对原则合成子链的过程。(2)由于PCR原理为DNA双链复制，其特点是半保留复制，所以无论复制几次，模板链一直存在于2个DNA分子中。DNA复制的数量变化是指数式增长方式。(3)由(A＋T)/(G＋C)＝1/2可知A∶T∶G∶C＝1∶1∶2∶2，所以A的比例为1/6，在一个DNA分子中的数量为3 000×2×(1/6)＝1 000个，5次循环的DNA数为32个，所以以原料合成的DNA数相当于32－1＝31个，至少需腺嘌呤脱氧核苷酸为31×1 000＝31 000个。(4)画图的关键是注意引物A、B的位置和所对应的模板链。
[答案] (1)模板DNA双链解聚形成单链 在DNA聚合酶的作用下，原料脱氧核苷酸聚合形成新的DNA链 (2)2 2 230 (3)31 000 (4)如图
10．如图为细胞内DNA复制过程示意图，该过程在体外也可进行，以获得大量相同的DNA片段，该项技术被称为PCR技术，又称多聚酶链式反应，请分析回答：
(1)PCR过程与细胞内DNA复制相比，主要不同点是：
_____________________________________________________
_____________________________________________________。
(2)PCR技术过程的三个步骤是：________、________、________。
(3)假设PCR过程中，只用一个DNA片段作为模板，30次循环后，理论上反应物中有________个这样的DNA片段。
(4)PCR技术能在几小时内将微量的DNA片段特异性地扩增上百万倍，从而解决了样品中DNA含量低，难以分离的难题，试举两例，说明PCR技术的应用：_____________________________________________________
_____________________________________________________。
[解析] (1)PCR过程与细胞内DNA复制相比，主要不同点是：PCR过程是高温变性解旋，不需要解旋酶。(2)PCR的每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。(3)由于一个DNA片段作为模板，一次循环能产生2个DNA片段，所以30次循环后，反应物中大约有230个这样的DNA片段。(4)PCR技术有广泛的应用，可以用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、亲子鉴定等方面。
[答案] (1)PCR过程是高温变性解旋，不需要解旋酶 (2)变性 复性 延伸 (3)230 (4)刑侦破案、亲子鉴定、疑难疾病的诊断、基因序列分析等
[能力提升练]
11．右图表示DNA变性和复性示意图，相关说法正确的是( )
A．向右的过程为加热(50～60 ℃)变性的过程
B．向左的过程是DNA双链迅速致冷复性
C．变性与在生物体内解旋过程的实质相同
D．图中DNA片段共有8个游离的磷酸基、8个3′端
C [DNA体外的变性同体内的解旋实质是相同的，都是使氢键断裂，DNA双螺旋打开，只是体内需解旋酶，体外是高温条件。]
12．下列有关PCR技术中引物的叙述，正确的是( )
A．引物是一小段DNA分子或双链RNA分子
B．扩增一个DNA分子至少需要的引物数目等于新合成的DNA子链数目
C．两种引物之间能够发生碱基互补配对
D．DNA聚合酶只能从引物的5′端连接脱氧核苷酸
B [引物是一小段单链DNA分子或单链RNA分子；在DNA分子扩增时，需要两种引物，由于新合成的子链都需要引物作为复制的起点，则扩增一个DNA分子至少需要的引物数目等于新合成的DNA子链数目；两种引物分别与DNA母链之间发生碱基互补配对，并不是两种引物之间发生碱基互补配对；DNA聚合酶只能从引物的3′端连接脱氧核苷酸，从而使子链DNA分子的复制方向只能是5′端→3′端。]
13．“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如图2所示，其中第⑤种DNA分子有几个( )
A．2 B．4 C．6 D．8
D [PCR技术扩增时，由两种引物决定所扩增的片段的特定序列，上一次循环的产物为下一次循环的模板。第一次循环形成①和②，第二次循环形成①、②、③、④四个DNA，以此类推4次循环后共形成16个DNA，其中①、②各一个，③、④各三个，⑤共8个。]
14．PCR利用了DNA热变性的原理，PCR仪实际上也是一种能自动调控温度的仪器，对PCR过程中“温度的控制”的说法错误的是( )
A．酶促反应需要高的温度，是为了确保模板是单链
B．延伸的温度必须大于复性温度，而小于变性温度
C．DNA聚合酶具有耐高温的能力
D．DNA解旋酶具有耐高温的能力
D [PCR是体外DNA扩增，DNA双链的解开不需要解旋酶，靠高温使其变性，双链螺旋结构解体，双链分开，在复性后，在耐高温的DNA聚合酶的作用下根据碱基互补配对原则合成新的DNA，因此延伸的温度要大于复性温度而小于变性温度。]
15．请回答PCR技术方面的有关问题：
(1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如图所示)。
图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。
①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为________。
②在第________轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。
(2)设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如图)，请分别说明理由。
①第1组：_____________________________________________________；
②第2组：_____________________________________________________。
(3)PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为____________________________
_____________________________________________________。
[解析] (1)①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为15/16。②在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。(2)某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理，原因①引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效。②引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。(3)DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上。
[答案] (1)①15/16 ②三
(2)①引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效
②引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
(3)DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上
