课题3 血红蛋白的提取和分离
学习目标：1.了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。(重点) 2.体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程与方法。(难点)
1．蛋白质分离的原理和方法
(1)分离蛋白质的原理
蛋白质特性的差异
(2)分离蛋白质的方法
①凝胶色谱法：
ⅰ概念：也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。
ⅱ凝胶
ⅲ原理：相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内部的通道，通过的路程较长，移动速度较慢，因此可将各种相对分子质量不同的蛋白质分离。
②电泳：
ⅰ概念：指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
ⅱ原理：
a．许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。
b．在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
c．电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
ⅲ方法：常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
(3)缓冲溶液
①作用：在一定范围内，抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。
②配制：由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成，通过调节缓冲剂的使用比例就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。
2．蛋白质提取和分离的实验操作
(1)样品处理
①红细胞的洗涤：
ⅰ目的：去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。
ⅱ方法：
②血红蛋白的释放：
ⅰ目的：使红细胞破裂释放血红蛋白。
ⅱ过程：
③分离血红蛋白溶液：
将混合液离心→将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶沉淀层→于分液漏斗中静置片刻→分离出下层的红色透明液体。
(2)粗分离——透析
①过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将其放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12 h。
②目的：将相对分子质量较小(填“大”或“小”)的杂质除去。
③原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。
(3)纯化——凝胶色谱操作
①凝胶色谱柱的制作：
ⅰ取长40 cm，内径为1.6 cm的玻璃管，两端需用砂纸磨平。
ⅱ柱底制作：打孔→挖凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。
ⅲ柱顶制作：打孔→安装玻璃管。
ⅳ组装：将上述三者按相应位置组装，并在下端出口连接带开关的尼龙管，尼龙管放入收集器。
②凝胶色谱柱的装填：
ⅰ色谱柱固定于支架上。
ⅱ干凝胶的计算和称量。
ⅲ溶胀：干凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。
ⅳ装填：打开下端出口，将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内。
ⅴ洗涤平衡：装填完后，立即连接洗脱瓶，用20 mmol/L的磷酸缓冲液洗涤平衡凝胶12 h。
③样品的加入和洗脱：
调整缓冲液面：与凝胶面平齐
↓
滴加透析样品：用量为1 mL
↓
样品渗入凝胶床：样品完全进入凝胶层
↓
洗脱：打开下端出口，用磷酸缓冲液洗脱
↓
收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集
(4)纯度鉴定
在鉴定的方法中，使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。
1．判断对错
(1)可用蒸馏水涨破细胞的方法从猪的红细胞中提取到DNA和蛋白质。 ( )
(2)用不同浓度的NaCl溶液反复溶解与析出DNA可除去部分杂质。 ( )
(3)透析法分离蛋白质的依据是蛋白质不能通过半透膜。 ( )
(4)凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小来分离蛋白质的有效方法。 ( )
提示：(1)× 猪是哺乳动物，哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核和线粒体，不能从其红细胞中提取出DNA。
(2)√ (3)√ (4)√
2．下列各项中，不是电泳使样品中各种分子分离的原因的是( )
A．带电性质差异 B．分子的大小
C．分子的形状 D．分子的变性温度
D [电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。带电性质不同、分子的大小和形状不同都会影响带电粒子在电场中的迁移速度，而迁移速度与分子的变性温度无关。]
3．蛋白质提取和分离的一般步骤是( )
①样品处理 ②凝胶色谱操作 ③粗分离 ④SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 ⑤纯化 ⑥纯度鉴定
A．①②③④⑤⑥ B．①③⑤⑥
C．③④⑤⑥ D．①③④⑤
B [蛋白质的提取和分离分为样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定四步。凝胶色谱操作及SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳为实验操作过程中的技术。]
蛋白质提取与分离的原理和方法
[合作交流]
1．凝胶色谱法分离过程是怎样的？
提示：蛋白质混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→先收集大分子→后收集小分子。
2．凝胶的成分是什么？凝胶有何特点？
提示：成分：大多数是多糖类化合物构成的一些微小的多孔球体，如葡聚糖或琼脂糖。特点：小球体内部有许多贯穿的通道，可以分离不同相对分子质量的蛋白质。
1．蛋白质分离的依据
蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，可以用来分离不同种类的蛋白质。
2．蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析
相对分子质量大
相对分子质量小
直径大小
大于凝胶颗粒空隙直径
小于凝胶颗粒空隙直径
运动方式
垂直向下运动
无规则的扩散运动
运动速度
较快
较慢
运动路程
较短
较长
洗脱顺序
先从凝胶柱中洗脱出来
后从凝胶柱中洗脱出来
3.电泳
琼脂糖凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳
由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子在电场中迁移速率决定于所带电荷性质的差异及分子的大小、形状的不同
在凝胶中加入SDS，使蛋白质解聚成单链，与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，使其迁移速率完全取决于分子的大小
[典题通关]
如图表示对某蛋白质溶液进行SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果(类似于纸层析法分离色素)，下列相关叙述不正确的是( )
A．蛋白质上某些基团解离后可使蛋白质带电，电场中带电的蛋白质分子(或多肽)会向着与其所带电荷相反的电极移动
B．蛋白质在SDS－聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度完全取决于其所带净电荷多少
C．蛋白质在SDS－聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度取决于其相对分子质量的大小
D．电泳结果表明溶液中的蛋白质可能有两种，也可能只有一种
B [蛋白质的氨基与羧基可发生解离，使其带正电或负电，在电场中发生迁移。SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳中所加的SDS可完全掩盖蛋白质本身所带的电荷，故其移动速度与本身所带电荷多少无关，而由其分子大小决定。SDS可使蛋白质变性形成肽链，故结果所示可能是一种蛋白质(有两种肽链)，也可能是两种蛋白质。]
(1)图中的两个分子所带的电荷是正电荷还是负电荷？为什么？
(2)除了本题中的聚丙烯酰胺凝胶电泳外，常用的电泳方法还有哪种？
提示：(1)负电荷，因为它们移向了阳极一端。
(2)琼脂糖凝胶电泳法。
1．利用凝胶色谱法先洗脱出来的蛋白质是( )
A．相对分子质量大的
B．溶解度高的
C．相对分子质量小的
D．所带电荷多的
A [相对分子质量较小的蛋白质能进入凝胶内部通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量大的蛋白质，路程较短，移动速度较快，首先洗脱出来。]
2．下列有关缓冲溶液的说法，不正确的是( )
A．缓冲溶液能够抵制外界任何酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变
B．缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成
C．调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲溶液
D．生物体内的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的
A [缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲溶液。在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变，超过一定范围，缓冲溶液就起不到这样的作用了。]
血红蛋白的提取和分离实验操作
[合作交流]
1．洗涤红细胞时能否用蒸馏水代替生理盐水？
提示：不能。生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定而不至于破裂，在未洗净血浆中的杂质蛋白前，红细胞如果提前破裂，就可能使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大了分离的难度。
2．在血红蛋白释放过程中，加入蒸馏水和甲苯的目的是什么？
提示：(1)加入蒸馏水使红细胞吸水涨破。
(2)细胞膜的主要成分为磷脂，易溶于甲苯等有机溶剂，加入甲苯能加速红细胞破裂并释放出血红蛋白。
3．血红蛋白呈现红色，这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？
提示：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断收集洗脱液的时机。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。
1．样品处理、分离与纯化的目的不同
目的
红细胞洗涤
去除杂质，如血浆蛋白
血红蛋白释放
使红细胞破裂，释放血红蛋白
分离血红蛋白溶液
经过离心使血红蛋白与其他杂质分离开
透析
除去样品中相对分子质量较小的杂质
纯化
除去相对分子质量较大的蛋白质
2.结果分析与评价
项目
分析
血液样品的处理
①分层明显―→样品处理完成；
②分层不明显的原因：a.洗涤次数少，未能除去血浆蛋白；b.离心速度过高或时间过长
凝胶色谱柱的装填
凝胶颗粒填充紧密、均匀，无气泡―→装填成功
血红蛋白的分离
①血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随洗脱液缓慢流出―→分离成功；
②血红蛋白的红色区带歪曲、散乱、变宽―→分离效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关
[典题通关]
如图是用除去DNA的滤液进行血红蛋白的提取和分离实验的装置，下列有关叙述不正确的是( )
A．首先用图甲装置对滤液进行处理，其目的是去除相对分子质量较小的杂质
B．图乙装置的试管中收集到的液体中最先出现的是相对分子质量较小的蛋白质
C．用图乙装置分离血红蛋白时，待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每管收集5 mL，连续收集
D．图丙装置中电泳法分离提纯血红蛋白的原理是血红蛋白带有一定量的电荷，在电场的作用下向一极移动
B [用图甲装置对滤液进行处理，其目的是去除相对分子质量较小的杂质。图乙装置表示通过凝胶色谱法分离蛋白质的过程。蛋白质的相对分子质量较大，被排阻在凝胶颗粒的外面，在颗粒之间迅速通过。]
(1)在凝胶色谱操作前，获得的血红蛋白溶液中的杂质应尽量除去，哪些操作是为了达到这一目的？
(2)丙图中决定蛋白质运动方向和速度的因素有哪些？
提示：(1)①用生理盐水对红细胞进行洗涤，目的是洗去红细胞表面上的杂蛋白；②离心分层，目的是除去一些脂溶性物质；③透析，目的是除去一些小分子的杂质。
(2)蛋白质所带电荷的性质、分子的大小和形态等。
在蛋白质的提取和分离中，关于对样品的处理，分析正确的是( )
A．洗涤红细胞的目的是除去血浆中的葡萄糖、无机盐
B．洗涤时离心速度过慢，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果
C．洗涤过程选用质量分数为0.1%的NaCl溶液
D．透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质
D [本题主要考查了血红蛋白提取和分离中的样品处理。洗涤红细胞的目的主要是除去血浆中的蛋白质；洗涤时离心速度过快，时间过长，会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果；洗涤过程用到的是质量分数为0.9%的NaCl溶液。故正确答案为D。]
[课堂小结]
知 识 网 络 构 建
核 心 语 句 归 纳
1.凝胶色谱法分离蛋白质取决于相对分子质量的大小，相对分子质量大的路程较短，移动速度快；相对分子质量较小的，路程较长，移动速度慢。
2.缓冲液能在一定范围内抵制外界酸、碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。
3.电泳时，带电分子会向其所带电荷相反的电极移动。
4.蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。
5.在电泳中，待分离样品中分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状都会影响分子的迁移速度。
6.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移率完全取决于分子的大小。
1．下列关于样品的加入和洗脱的操作不正确的是( )
A．加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面
B．加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内
C．等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口
D．用吸管小心地将1 mL透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面
A [加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐。]
2．相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的分离过程可表示为下列哪一项( )
B [相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子可以进入凝胶颗粒内部，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量较小的蛋白质后流出。]
3．凝胶柱制作的顺序一般是( )
①橡皮塞打孔 ②挖凹穴 ③装玻璃管 ④盖尼龙网 ⑤盖尼龙纱 ⑥将橡皮塞插入玻璃管 ⑦接尼龙管、装螺旋夹 ⑧柱顶插入安装玻璃管的橡皮塞
A．①③④⑤⑥⑧⑦② B．①②③④⑤⑥⑦⑧
C．①②③④⑥⑤⑧⑦ D．①②③⑦⑥⑤⑧④
B [凝胶柱制作的一般流程是：选择玻璃管→选择合适的橡皮塞→打孔→挖凹穴→盖尼龙网→盖尼龙纱→将橡皮塞插到玻璃管→接尼龙管→装螺旋夹→柱顶插入安装玻璃管的橡皮管。]
4．PCR技术是把某一DNA片段在实验条件下，合成许许多多相同片段的一种方法，利用这种技术能快速而特异地扩增任何要求的目的基因或者DNA分子片段，“人类基因组计划”的研究中常用到这种技术。请结合有关知识，回答有关此技术的一些问题：
(1)PCR技术能把某一DNA片段进行扩增，依据的原理是_____________________________________________________。
(2)在实验条件下，DNA分子进行扩增，除了所要扩增的DNA片段外，还需要____________、____________和____________等条件。
(3)某DNA片段有160个碱基，其中有腺嘌呤35个，若让该DNA分子扩增3次(复制3次)至少需要腺嘌呤脱氧核苷酸和鸟嘌呤脱氧核苷酸的数目分别是________和________个。
[解析] (1)DNA分子具有双螺旋结构，扩增时DNA分子双链之间的氢键断裂，两条链彼此分开，各自吸收细胞内的脱氧核苷酸，按照碱基互补配对原则合成一条新链，然后新旧链联系起来，各自形成一个完整的DNA分子。
(2)PCR反应的条件：①稳定的缓冲液环境，②DNA模板；③分别与模板DNA 2条模板链相结合的2种引物；④A、T、G、C 4种脱氧核苷酸；⑤耐热的DNA聚合酶，一般用TaqDNA聚合酶；⑥能严格控制温度变化的温控设备。
(3)在DNA片段中，有腺嘌呤35个，可求出鸟嘌呤为＝45个，DNA分子扩增3次需要腺嘌呤脱氧核苷酸35×(23－1)＝245个，鸟嘌呤脱氧核苷酸45×(23－1)＝315个。
[答案] (1)DNA分子具有双螺旋结构和DNA分子中碱基的互补配对
(2)4种脱氧核苷酸 引物 耐热的DNA聚合酶
(3)245 315
课件63张PPT。专题5 DNA和蛋白质技术课题3 血红蛋白的提取和分离形状和大小 电荷 亲和力 分配色谱法 相对分子质量的大小 多孔球体 多糖类化合物 贯穿的通道 不能 较短 较慢 带电粒子 迁移 可解离的基团 正电 负电 相反 带电性质的差异 大小 形状 迁移速度 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 酸和碱 缓冲剂 使用比例 杂蛋白 生理盐水蒸馏水甲苯血红蛋白 离心 滤纸 脂溶沉淀层分液漏斗 红色透明液体 血红蛋白 透析袋 磷酸缓冲液 小 大分子 移液管头部 凝胶悬浮液 下端出口 凝胶面 磷酸缓冲液 底端 SDS—聚丙烯酰胺凝胶 蛋白质提取与分离的原理和方法 血红蛋白的提取和分离实验操作 点击右图进入…Thank you for watching !课时分层作业(十四) 血红蛋白的提取和分离
(建议用时：35分钟)
[基础达标练]
1．蛋白质的分离与纯化技术是蛋白质研究的重要技术。下列有关叙述不正确的是( )
A．根据蛋白质分子不能透过半透膜的特性，可将样品中各种不同的蛋白质分离
B．根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小等，可通过电泳分离蛋白质
C．可通过凝胶色谱法分离蛋白质
D．根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法分离蛋白质
A [蛋白质分子不能透过半透膜，而溶液中的小分子物质则可以透过半透膜，因此透析可以将蛋白质和溶液中的小分子物质分离。]
2．下列有关凝胶色谱法的叙述，不正确的是( )
A．凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法
B．目前经常使用的凝胶有交联葡聚糖、聚丙烯酰胺和琼脂糖等
C．大分子物质后被洗脱出来，小分子物质先被洗脱出来
D．凝胶色谱法的原理是不同大小的分子所经的路径不同而得以分离
C [相对分子质量较小的蛋白质由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而使其所经过的路程较长；相对分子质量较大的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。因此，大分子物质先被洗脱出来，小分子物质后被洗脱出来。]
3．凝胶色谱法分离蛋白质的原理是( )
A．根据蛋白质分子与凝胶的亲和力的大小
B．根据蛋白质相对分子质量的大小
C．根据蛋白质所带电荷的多少
D．根据蛋白质溶解度的大小
B [凝胶色谱法所用的凝胶实际上是一些微小多孔的球体，在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量较大的蛋白质只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快，从而使相对分子质量不同的蛋白质分子得以分离。故选B。]
4．洗涤红细胞时，离心所采用的方法是( )
A．低速长时间离心
B．低速短时间离心
C．高速长时间离心
D．高速短时间离心
B [高速或长时间离心，会导致白细胞和淋巴细胞一同沉淀，得不到纯净的红细胞，而影响后面血红蛋白的提取纯度。]
5．对在凝胶柱上加入样品和洗脱的操作，不正确的是( )
A．加样前要使柱内凝胶面上的缓冲液下降到与凝胶面平齐
B．让吸管管口沿管壁环绕移动，贴壁加样至色谱柱顶端，不要破坏凝胶面
C．打开下端出口，待样品完全进入凝胶层后，直接连接缓冲液洗脱瓶，开始洗脱
D．待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集流出液
C [打开下端出口，待样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口，再用同样的方法小心加入适量的20 mmol/L的磷酸缓冲液到适当高度，然后连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，开始洗脱。]
6．取1 mL血红蛋白溶液装入透析袋中进行透析，相关说法不正确的是( )
A．透析液为300 mL 20 mmol/L的磷酸缓冲液
B．透析时间至少为1～2 h，时间过长血红蛋白也会渗漏出去
C．缓冲液量远多于血红蛋白溶液量有利于杂质分子充分地向外扩散
D．透析时也可更换样品的缓冲液
B [透析过程除去了相对分子质量较小的杂质，实现了粗分离，更换样品的缓冲液可加强透析的结果；透析时烧杯中加入300 mL 20 mmol/L的磷酸缓冲液，透析时间为12 h，这样可使小分子杂质与血红蛋白充分分离。]
7．有关“血红蛋白的提取和分离”的叙述，正确的是( )
A．用蒸馏水进行红细胞的洗涤，其目的是去除细胞表面杂蛋白
B．将血红蛋白溶液进行透析，其目的是去除相对分子质量较大的杂质
C．血红蛋白释放时要加入有机溶剂，其目的是使血红蛋白溶于有机溶剂
D．整个过程不断用磷酸缓冲液处理，是为了维持血红蛋白的结构
D [用质量分数为0.9%的NaCl溶液进行红细胞的洗涤，其目的是去除血浆蛋白等杂质，有利于后续步骤的分离纯化；将血红蛋白溶液进行透析，其目的是去除相对分子质量较小的杂质；血红蛋白释放时要加入有机溶剂，其目的是溶解细胞膜；整个过程不断用磷酸缓冲液处理，是为了维持血红蛋白的结构。]
8．凝胶色谱法是分离蛋白质分子的一种常用方法，但并非所有的蛋白质都可以用此方法进行分离，能分离的蛋白质分子之间必须( )
A．具有相同的相对分子质量
B．相对分子质量不同，但都是相对分子质量较大的分子
C．相对分子质量不同，但都是相对分子质量较小的分子
D．具有不同的相对分子质量
C [若在每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内的各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的，分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶。]
9．对蛋白质进行研究和应用，首先需要获得高纯度的蛋白质。请回答下列问题：
(1)蛋白质的提取和分离一般分为四步：________、________、________和纯度鉴定。
(2)在血红蛋白的提取与分离实验中，采集新鲜血液前要在采血容器中加入柠檬酸钠溶液的目的是______________。
(3)样品的处理过程又可以细分为：红细胞的洗涤、________和分离血红蛋白溶液。其中分离血红蛋白溶液时需要用到________(仪器)分出下层红色透明液体。
(4)收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析进行粗分离。
①透析的目的是________________；
②透析的原理是________________________________________。
(5)装填凝胶色谱柱时，要注意色谱柱内不能有气泡，一旦发现有气泡必须重新装填。这是因为_____________________________________________
_____________________________________________________。
(6)然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。
①样品纯化的目的是_________________________________________；
②血红蛋白的特点是___________________________________________；
这一特点对分离蛋白质的意义：
_____________________________________________________
_____________________________________________________
_____________________________________________________。
[解析] 透析袋能使小分子物质自由进出，而大分子物质被保留在袋内，所以透析可以除去相对分子质量较小的杂质；样品纯化的目的是通过凝胶色谱法将相对分子质量不同的杂蛋白除去；血红蛋白呈现红色，在用凝胶色谱法分离时可以通过观察颜色来判断收集洗脱液的时机；同时，通过观察颜色，使血红蛋白的分离过程更直观，大大简化了实验操作。
[答案] (1)样品处理 粗分离 纯化 (2)防止血液凝固 (3)血红蛋白的释放 分液漏斗 (4)①去除相对分子质量较小的杂质 ②透析袋能使小分子自由进出，而大分子则被留在袋内 (5)气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果 (6)①通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂蛋白除去 ②呈现红色 在用凝胶色谱法分离血红蛋白时，可以通过观察颜色来判断什么时期应该收集洗脱液，这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作
10．下列是有关血红蛋白的提取与分离的问题，请回答下列问题。
(1)人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白，其原因是
_____________________________________________________
_____________________________________________________
_____________________________________________________。
(2)凝胶色谱法是根据____________________分离蛋白质的有效方法。所用的凝胶实际上是一些______________。
(3)蛋白质的提取和分离实验中，首先要用____________________(填写溶液名称)洗涤红细胞，其目的是去除________。
(4)在________和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。用________法可分离出血红蛋白。
(5)取血红蛋白溶液装入透析袋，再将透析袋放入pH为7.0的________中，透析12 h。
[解析] 哺乳动物的红细胞退化，没有细胞核和细胞器，没有DNA，血红蛋白含量丰富；而鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，可以用于提取DNA。凝胶色谱法也叫做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，使用的洗涤液是生理盐水，要重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，不能用清水或蒸馏水洗涤，因为生理盐水可以使红细胞维持正常的形态。释放出的血红蛋白用离心的方法进行分离。为避免破坏蛋白质的空间结构，要用磷酸缓冲液进行透析，以保证pH的相对稳定。
[答案] (1)鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，适合用于提取DNA；人的红细胞无细胞核，且血红蛋白含量丰富，适合用于提取血红蛋白 (2)相对分子质量的大小 微小的多孔球体 (3)生理盐水 杂蛋白 (4)蒸馏水 离心 (5)(磷酸)缓冲液
[能力提升练]
11．凝胶色谱法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共同点是( )
A．改变蛋白质分子通过凝胶时的路径
B．吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度
C．将酶或细胞固定在凝胶中
D．与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度
A [凝胶的种类较多，但每种凝胶内部都有孔隙。相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质分子可以进入凝胶内部，通过的路程较长，洗脱时从凝胶柱中出来的较晚，相对分子质量较大的蛋白质分子则可以较早地洗脱出来，从而达到分离蛋白质的目的。]
12．使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量时，可选用一组已知相对分子质量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知相对分子质量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和相对分子质量的对数作标准曲线，可以测出未知蛋白的相对分子质量。下列说法不正确的是( )
A．SDS能与蛋白质形成复合物而掩盖不同蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率取决于分子的大小
B．与已知相对分子质量的标准蛋白的电泳带相比，只能大概估计出待测蛋白质的相对分子质量
C．SDS在引发剂和催化剂的作用下参与构成聚丙烯酰胺凝胶
D．如果只是分离混合物而不需测定蛋白质的相对分子质量时，就无需加入SDS，此时蛋白质的电泳迁移率取决于所带电荷和分子的大小
C [聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N，N′—亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。]
13．将处理破裂后的红细胞混合液以2 000 r/min的速度离心10 min后，离心管中的溶液分为四层，从上到下的顺序依次是( )
A．血红蛋白、甲苯层、脂质物质层、红细胞破碎物沉淀层
B．甲苯层、红细胞破碎物沉淀层、血红蛋白、脂质物质层
C．脂质物质层、血红蛋白、甲苯层、红细胞破碎物沉淀层
D．甲苯层、脂质物质层、血红蛋白、红细胞破碎物沉淀层
D [混合液经离心后按密度大小排列，在离心管中从上到下的顺序依次是：第1层为无色透明的甲苯层，第2层白色薄层固体是脂溶性物质沉淀层，第3层红色透明液体是血红蛋白水溶液，第4层暗红色沉淀物主要是红细胞破碎物沉淀。]
14.已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种物质，其分子大小、电荷的性质和数量情况如图所示。下列叙述正确的是( )
A．将样品装入透析袋中透析12 h，若分子乙保留在袋内，则分子甲也保留在袋内
B．若五种物质为蛋白质，则用凝胶色谱柱分离时，甲的移动速度最快
C．将样品以2 000 r/min的速度离心10 min，若分子戊存在于沉淀中，则分子丙也存在于沉淀中
D．若五种物质为蛋白质，用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白质分子，则分子甲和分子戊形成的电泳带相距最近
C [透析的原理是相对分子质量小的物质能透过半透膜，相对分子质量大的物质不能透过，乙保留在袋内，甲则不一定保留在袋内；凝胶色谱柱分离时，相对分子质量小的物质路程长、移动慢；离心时相对分子质量大的物质先沉淀，戊沉淀，则乙、丁、丙均已沉淀；用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质时，电泳迁移率主要取决于分子大小。]
15．血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2和部分CO2的运输。请根据血红蛋白的提取和分离流程图回答问题：
(1)将实验流程补充完整。
(2)凝胶色谱法的基本原理是根据______________分离蛋白质。
(3)洗涤红细胞的目的是去除________，洗涤干净的标志是_____________。
(4)下图1是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品的加入示意图，正确的加样顺序是____________。如果红色区带______________，说明色谱柱制作成功。
图1
(5)图2、图3分别是同学甲、乙利用同一种样品分离得到的结果，则图3中与图2中蛋白质P对应的是________。
[解析] (1)样品处理包括：红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液。凝胶色谱操作包括：凝胶色谱柱的制作、凝胶色谱柱的装填、样品的加入和洗脱。(2)凝胶色谱法的基本原理是根据相对分子质量的大小分离蛋白质。(3)洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，洗涤干净的标志是上清液中没有黄色。(4)加样顺序是：调整缓冲液面、滴加透析样品、样品渗入凝胶床、再调整缓冲液面。如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。(5)SDS凝胶电泳装置是垂直的装置，此种电泳方法主要取决于蛋白质相对分子质量的大小，与电荷无关，同时加样在“－”极，通电后，样品蛋白质向“＋”极移动，相对分子质量小的，移动距离大，因此从图2的电泳结果分析，P比N、M移向“＋”距离大，说明P的相对分子质量比较小，因此洗脱出来的时间比较长，符合图3中的丙。
[答案] (1)血红蛋白的释放 凝胶色谱柱的装填 (2)相对分子质量的大小 (3)杂蛋白(或血浆蛋白) 离心后的上清液中没有黄色 (4)④①②③ 均匀一致地移动 (5)丙
