第一节 基因工程概述
第1课时 基因工程的发展历程和工具
1．简述基因工程的发展历程。
2．掌握限制性核酸内切酶和DNA连接酶的作用、特点。(重、难点)
3．掌握质粒的含义、特性及其在基因工程中的作用。(重、难点)
知识点一| 基因工程的发展历程和概念
1．理论与技术基础的发展
1953年：沃森和克里克建立了DNA分子双螺旋结构模型。
↓
1957年：科恩伯格等首次发现DNA聚合酶。
↓
1958年：梅塞尔森和斯塔尔发现DNA半保留复制的机理。克里克提出中心法则。
↓
1961～1966年：尼伦伯格等破译遗传密码。
↓
1967年：罗思和赫林斯基发现运转工具质粒。同年，科学家在大肠杆菌细胞中发现DNA连接酶。
↓
1970年：特明和巴尔的摩各自在RNA病毒中发现逆转录酶。史密斯等人分离到限制性核酸内切酶。
↓
1977年：桑格首次完整基因组的测序工作。
2．重组DNA技术的发展
(1)1972年科学家伯格等实验。
①过程：
②成就：世界上首次DNA分子体外重组。
(2)1973年科学家科恩等实验。
重组DNA分子大肠杆菌―→子代大肠杆菌(双重抗性)
(3)不同物种间DNA重组实验。
①过程：非洲爪蟾核糖体蛋白基因的DNA片段＋大肠杆菌质粒→重组DNA→转入大肠杆菌→转录出相应 mRNA。
②成就：打破了传统的种间遗传物质不能交换的重重壁垒，开创了基因工程。
3．基因工程的概念
方法
在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法
原理
对生物的基因进行改造和重新组合
操作水平
基因水平
目的
产生人类需要的基因产物
使大米拥有某些细菌才具有的抗虫基因能够减少化学杀虫剂的使用量，既高产又环保。
请你结合以上内容探究下列问题。
探讨：你知道拥有某些细菌抗虫基因的大米是通过何种技术培育出来的吗？
提示：基因工程。
探讨：通过分析基因工程的概念，讨论基因工程的原理是什么？与有性杂交育种有何区别？
提示：原理：基因重组。
区别：打破物种限制，实现不同物种间的基因交流。
探讨：将人的胰岛素基因导入大肠杆菌体内，通过大肠杆菌能大量生产人胰岛素。请分析人胰岛素基因能在大肠杆菌体内表达的理论基础是什么？
提示：生物共用一套遗传密码。
1．基因重组的三种主要类型
(1)交叉互换：减数第一次分裂四分体时期，同源染色体上的非姐妹染色单体间的交叉互换。
(2)自由组合：减数第一次分裂后期，非同源染色体上的非等位基因随着非同源染色体的自由组合而组合。
(3)基因工程：转基因生物因外源基因导入而获得的新性状是可以遗传的。
2．基因工程的理论基础
(1)拼接的基础：
①基本组成单位相同：不同生物的DNA分子都是由脱氧核苷酸构成的。
②空间结构相同：不同生物的DNA分子一般都是由两条反向平行的脱氧核苷酸长链形成的规则的双螺旋结构。
③碱基配对方式相同：不同生物的DNA分子中两条链之间的碱基配对方式均是A与T配对，G与C配对。
(2)表达的基础：生物界共用一套遗传密码，相同的遗传信息在不同生物体内可表达出相同的蛋白质。
1．干扰素是治疗癌症的重要药物，它必须从血液中提取，每升人血中只能提取0.5 μg，所以价格昂贵。美国加利福尼亚的某生物制品公司用如下方法生产干扰素。如图所示，可以看出该公司生产干扰素运用的方法是( )
A．个体间的杂交 B．基因工程
C．细胞融合 D．器官移植
【解析】 从图中可以看出整个过程为将人的淋巴细胞中控制干扰素合成的基因与质粒结合后导入酵母菌，并从酵母菌产物中提取干扰素，这项技术为基因工程。
【答案】 B
2．下列对基因工程的理解，正确的是( )
①它是一种按照人们的意愿，定向改造生物遗传特性的工程 ②可对基因随意进行人为改造 ③是体外进行的人为的基因重组 ④在实验室内，利用相关的酶和原料合成DNA ⑤主要技术为体外DNA重组技术和转基因技术 ⑥在DNA分子水平上进行操作 ⑦一旦成功，便可遗传
A．①②③④⑤⑥ B．①③④⑤⑥⑦
C．①③⑤⑥⑦ D．①②③⑤⑥⑦
【解析】 基因工程可以对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物，而不是对基因进行人为改造。
【答案】 C
知识点二| 基因工程的工具——酶与载体
1．限制性核酸内切酶(也称“限制酶”)
(1)来源：主要来自于原核生物。
(2)特点：具有专一性。
①识别双链DNA分子的某种特定的脱氧核苷酸序列。
②切割特定脱氧核苷酸序列中的特定位点。
(3)作用：断开每一条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。
(4)结果：产生黏性末端或平口末端。
2．DNA连接酶——“分子针线”
(1)作用：将双链DNA片段“缝合”，恢复被限制性核酸内切酶切开的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。
(2)结果：形成重组DNA分子。
3．载体——运载工具
(1)功能：将外源基因导入受体细胞。
(2)种类：质粒、λ噬菌体的衍生物以及一些动、植物病毒。
(3)质粒
①本质：来自细菌细胞中的一种很小的环状DNA分子，是最早应用的载体。
②组成：最简单的质粒载体必须包括复制区、标记基因、目的基因插入位点。
我国科学家已成功将与植物花青素代谢有关的基因导入花卉植物矮牵牛中，转基因矮牵牛呈现出自然界没有的颜色变异，大大提高了花卉的观赏价值。
请你依据以上材料探究下列问题：
探讨：科学家进行转基因技术操作时，需要用到哪些基本的工具？
提示：限制性核酸内切酶、DNA连接酶和载体。
探讨：结合DNA复制的过程分析，限制性核酸内切酶和DNA解旋酶的作用部位有何不同？
提示：限制性核酸内切酶作用于磷酸和脱氧核糖之间的磷酸二酯键，DNA解旋酶作用于碱基对之间的氢键。
探讨：下图所示过程是哪类酶作用的结果？该酶识别的碱基序列及切点是什么？这体现了该类酶具有什么特性？
提示：限制性核酸内切酶。识别的碱基序列为GAATTC，切点在G和A之间。特异性。
探讨：质粒的化学本质是什么？来源于何类生物？
提示：化学本质：环状DNA分子。来源：细菌、酵母菌。
1．限制性核酸内切酶与DNA连接酶的比较
(1)区别：
作用
应用
限制性核酸内切酶
使特定部位的磷酸二酯键断开
用于提取目的基因和切割载体
DNA连接酶
在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键
用于基因表达载体的构建
(2)两者的关系可表示为：
2．DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
项目
DNA连接酶
DNA聚合酶
相同点
催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键
不同点
模板
不需要模板
需要DNA的一条链为模板
作用对象
游离的DNA片段
单个的脱氧核苷酸
作用结果
形成完整的DNA分子
形成DNA的一条链
用途
基因工程
DNA复制
[特别提醒]
(1)不同DNA分子用同一种限制性核酸内切酶切割形成的黏性末端都相同；同一个DNA分子用不同的限制性核酸内切酶切割，产生的黏性末端一般不相同。
(2)DNA连接酶无识别的特异性，DNA连接酶对于黏性末端或平口末端都能催化其“缝合”，重新形成DNA分子。
3．载体的作用、条件、种类及质粒的相关知识
作用
将外源基因送入受体细胞
条件
①能在宿主细胞内复制并稳定地保存
②具有多个限制性核酸内切酶切点
③具有某些标记基因
种类
常用的载体有质粒、λ噬菌体、动植物病毒
质粒
①质粒是最早应用的载体
②结构：细菌细胞中的很小的环状DNA分子
③特性：质粒的存在对宿主细胞无影响
④重组质粒的形成：用同一种限制性核酸内切酶切割质粒和外源DNA分子，并通过DNA连接酶的连接，就能将质粒和外源DNA分子组成一个重组质粒(重组DNA分子)
[特别提醒]
(1)一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们常根据不同的目的和需要，对某些天然的载体进行人工改造。
(2)常见的标记基因有抗生素抗性基因、产生特定颜色的表达产物基因、发光基因等。
(3)注意与细胞膜上载体的区别，两者的化学本质和作用都不相同。
(4)质粒能自我复制，其复制场所既可是自身细胞、受体细胞内，也可以是体外。
1．基因的运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由是( )
A．能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因
B．具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达
C．具有某些标记基因，以便为目的基因的表达提供条件
D．能够在宿主细胞中复制并稳定保存，以便于进行筛选
【解析】 载体作为目的基因的运输工具，能将目的基因导入受体细胞。作为载体必须具备三个条件：①能够在宿主细胞中稳定地保存，并能够复制，以便提供大量的目的基因；②有一个至多个限制酶切割位点，便于与外源基因结合；③具有标记基因，便于进行检测和筛选。
【答案】 A
2．目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如下图所示。
(1)构建人工质粒时要有抗性基因，以便于_________________。
(2) pBR322质粒中有单个EcoR Ⅰ限制酶作用位点，EcoR Ⅰ只能识别序列—GAATTC—，并只能在G和A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoR Ⅰ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoR Ⅰ切割后所形成的黏性末端：__________________________。
(3)pBR322质粒中另有单个的Bam HⅠ 限制酶作用位点，现将经Bam HⅠ 处理后的质粒与用另一种限制酶Bgl Ⅱ处理得到的目的基因，通过DNA连接酶作用恢复________键，成功获得了重组质粒，说明__________________________。
(4)为了检测上述重组质粒是否导入原本无ampR和tetR的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)，与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是___________________________________，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是______________________________________。
【解析】 (1)质粒作为基因表达载体的条件之一是要有抗性基因，以便于鉴别目的基因是否导入受体细胞或筛选导入目的基因的受体细胞。
(2)同一限制酶切割DNA分子产生的黏性末端相同，根据题意可知：该目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端为：
目的基因
—G AATTC—……—G AATTC—
—CTTAA G—……—CTTAA G—
(3)DNA连接酶催化两个DNA片段形成磷酸二酯键；而通过DNA连接酶作用能将两个DNA分子片段连接，表明经两种限制酶(BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ)切割得到的DNA片段，其黏性末端相同。
(4)由题意知：由于与图三空圈相对应的大肠杆菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长，而不能在含四环素的培养基上生长，故可推知与图三空圈相对应的图二中的菌落能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素。由图二、图三结果显示，多数大肠杆菌都能抗氨苄青霉素，而经限制酶BamH Ⅰ 作用后，标记基因tetR被破坏，故导入目的基因的大肠杆菌不能抗四环素，即多数大肠杆菌导入的是pBR322质粒。
【答案】 (1)鉴别目的基因是否导入受体细胞或筛选导入目的基因的受体细胞
(2)如下所示：
目的基因
—G AATTC—……—G AATTC—
—CTTAA G—……—CTTAA G—
(3)磷酸二酯 两种限制酶(BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ)切割得到的黏性末端相同
(4)能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素 pBR322质粒
[课堂小结]
知识网络构建
核心语句归纳
1.基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
2.基因工程的原理是基因重组，处理对象是DNA或基因。
3.限制性核酸内切酶是能够识别和切割DNA分子的酶，又叫限制酶。DNA连接酶能将被限制性核酸内切酶切开的磷酸二酯键重新形成。
4.载体的作用是与含有外源基因(目的基因)的DNA片段结合，将外源基因送入受体细胞中。
1．基因工程是一种新兴生物技术，实施该工程的最终目的是( )
A．定向提取生物体DNA分子
B．定向对DNA分子进行人工“剪切”
C．在生物体外对DNA分子进行改造
D．定向改造生物的遗传性状
【解析】 基因工程也称DNA重组技术，它是按照人类的意愿，将某种基因有计划地转移到另一种生物中的新技术，故实施该工程的最终目的是定向改造生物的遗传性状。
【答案】 D
2．限制性内切酶的作用实际上就是把DNA上某些化学键打断，一种能对GAATTC专一识别的限制酶，打断的化学键是( )
A．G与A之间的键
B．G与C之间的键
C．A与T之间的键
D．磷酸与脱氧核糖之间的键
【解析】 限制酶主要从原核生物中分离、纯化出来，它能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。限制酶的作用部位是磷酸和脱氧核糖之间的磷酸二酯键，而一条链中相邻两个碱基之间的化学键为—脱氧核糖—磷酸—脱氧核糖—。
【答案】 D
3．如下图，两个核酸片段在适宜条件下，经X酶的催化作用，发生下述变化，则X酶是( )
A．DNA连接酶 B．RNA聚合酶
C．DNA聚合酶 D．限制性核酸内切酶
【解析】 DNA连接酶的作用是将两个黏性末端的磷酸和脱氧核糖连接在一起；RNA聚合酶是在RNA复制或转录过程中，把核糖核苷酸连接在一起；DNA聚合酶是在DNA复制过程催化脱氧核苷酸的聚合反应；限制性核酸内切酶是在获取目的基因时识别特定的碱基序列，切出黏性末端或平口末端。图示为将两个黏性末端的磷酸和脱氧核糖连接在一起。
【答案】 A
4．下列四条DNA片段，可能是由同一种限制酶切割而成的是( )
A．①② B．②③ C．③④ D．②④
【解析】 只有②和④的黏性末端的碱基都是互补的，它们可能是由同一种限制酶切割而成的。
【答案】 D
5．下列关于限制性核酸内切酶识别序列和切开部位的特点的叙述，错误的是( )
A．所识别的序列都可以找到一条中轴线
B．中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列
C．只识别和切断特定的脱氧核苷酸序列的
D．在任何部位都能将DNA切开
【解析】 一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。
【答案】 D
课件64张PPT。第一章 基本工程第一节 基因工程概述
第1课时 基因工程的发展历程和工具23基因工程的发展历程和概念4DNA分子双螺旋 DNA聚合酶 5DNA半保留复制 中心法则 遗传密码 6质粒 DNA连接酶 逆转录 限制性核酸内切 7杂种 DNA 体外重组 8重组DNA分子 大肠杆菌 9mRNA 基因工程 10剪切 拼接 重新组合 基因 基因产物 111213141516171819202122基因工程的工具——酶与载体23原核生物 特定的脱氧核苷酸序列 24特定部位 磷酸二酯键 黏性末端 平口末端 25重组DNA分子 26外源基因 λ噬菌体的衍生物 动、植物病毒 细菌 环状DNA 标记基因 27282930313233343536373839404142434445464748495051525354555657585960616263点击右图进入…Thank you for watching !第2课时 基因工程的实施过程
1．简述基因工程的一般过程。
2．理解获取目的基因的方法。(重、难点)
3．掌握将目的基因导入受体细胞的方法。(重点)
4．掌握目的基因的检测和鉴定方法。(重点)
知识点一| 获取目的基因和构建基因表达载体
1．获取目的基因
(1)通过基因文库获取目的基因：
①基因文库的含义：将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片段，分别与载体连接起来，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。这个受体菌群体就被称为基因文库。
②种类：
a．基因组文库：含有一种生物所有的基因。
b．部分基因文库：含有一种生物的一部分基因。
(2)利用PCR技术扩增目的基因：
①原理：DNA分子半保留复制。
②场所：生物体外(PCR仪)。
③优点：操作简单、容易掌握、结果可靠、能在较短时间内大量扩增。
④发明家：美国科学家穆里斯。
(3)通过化学方法直接人工合成目的基因：
①仪器：DNA合成仪。
②基因特点：比较小、脱氧核苷酸序列已知。
2．构建基因表达载体
(1)目的：使目的基因进入受体细胞并有效表达，能稳定存在且遗传给后代。
(2)组成：一个基因表达载体除了目的基因外，还应包括启动子、终止子和标记基因等。
基因表达载体的构建是基因工程的核心，下面图1为基因表达载体的构建过程图，图2为基因表达载体模式图。请据图分析：
图2
探讨：图1中的①是什么物质？切割目的基因和载体要选用同一种①吗？为什么？
提示：图1中①是限制性核酸内切酶。要，因为：选用同一种限制性核酸内切酶切割会产生相同的黏性末端，可以在DNA连接酶的作用下将切割的目的基因和载体连接起来。
探讨：图1中②是什么物质？试探讨用②连接目的基因和载体DNA时产生几种可能的连接方式？哪一种是符合要求的连接方式。
提示：图1中②是DNA连接酶。可能有3种连接方式，即目的基因和目的基因相连、载体DNA和载体DNA相连、目的基因和载体DNA相连。其中符合要求的是目的基因和载体DNA相连形成的重组DNA分子。
探讨：图2中的抗生素抗性基因属于什么基因？能否将目的基因插入该基因中？为什么？
提示：标记基因。不能。标记基因用于鉴定受体细胞是否成功导入目的基因，以便将含目的基因的细胞筛选出来，若有目的基因插入，则标记基因被破坏，无法进一步筛选。
1．获取目的基因
(1)来源。
目的基因可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以用人工方法合成。
(2)具体方法。
①从已有的物种中分离：从基因文库中提取目的基因。
②化学合成法：对于比较小，核苷酸序列已知的目的基因一般用人工合成的方法。如已知氨基酸序列，合成DNA。
③反转录法：它是以目的基因的mRNA为模板，合成碱基互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA。
④利用PCR技术扩增目的基因。
a．PCR的含义：一项在生物体外通过酶促反应有选择地大量扩增目的基因或DNA序列的技术。
b．目的：短时间内大量扩增目的基因或DNA序列。
c．原理：DNA分子半保留复制。
d．特点：操作简单、易掌握、结果可靠，能在短时间内大量复制目的基因或DNA序列。
e．步骤：第一步，向离心管加入模板、原料、引物及Taq DNA聚合酶。
第二步，加热至94 ℃，双链DNA解旋为单链DNA。
第三步，冷却至55 ℃，引物与两条单链DNA上的特定部位相互配对。
第四步，加热至72 ℃，热稳定DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)从引物起始进行互补链的合成。
如此重复循环多次。
f．特点：指数形式扩增。
2．PCR技术扩增目的基因与DNA复制的比较
PCR技术
DNA复制
相同点
原则
碱基互补配对
原料
四种脱氧核苷酸
条件
模板、ATP、酶
不同点
解旋方式
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
场所
体外复制
细胞核内
酶
热稳定的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)
细胞内含有的DNA聚合酶
结果
在短时间内形成大量的DNA片段
形成整个DNA分子
[特别提醒]
提取目的基因的三种方法的应用情况
(1)如果不知道目的基因的核苷酸序列，可以通过构建基因文库的方法，即通过用受体菌储存并扩增目的基因后，从基因文库中获取目的基因。
(2)如果知道目的基因的核苷酸序列，而且基因比较小，可以通过DNA合成仪利用化学方法人工合成。
(3)如果知道扩增目的基因及两端的核苷酸序列，而且基因又比较大，则可以通过PCR技术扩增目的基因。
3．构建基因表达载体
(1)基因表达载体结构
(2)分析
①启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于目的基因上游的一段核苷酸序列，是RNA聚合酶识别和结合的部位。
②目的基因：编码相关蛋白质，并形成基因工程产品或产生新的生物性状。
③终止子：一段有特殊结构的DNA片段，位于目的基因的尾端，作用是使转录在所需要的地方停止。
④标记基因：一般为抗生素抗性基因或荧光蛋白基因等，其作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因(或目的基因是否导入成功)。
(3)基因表达载体的功能
将目的基因导入受体细胞并使之有效表达。
(4)基因表达载体的构建步骤
①用同一种限制酶切割目的基因和质粒，使其产生相同末端。
②将切下的目的基因片段与切开的质粒混合，再加入适量DNA连接酶，使目的基因插入质粒的切口处，形成一个重组DNA分子(重组质粒)。
[特别提醒]
启动子和终止子、起始密码子与终止密码子的区别
(1)启动子和终止子都在DNA上，在遗传信息转录时起作用。启动子是启动转录的开始，终止子是DNA分子上决定转录停止的一段DNA序列，其组成单位都是脱氧核苷酸。
(2)起始密码子和终止密码子都是mRNA上的三个相邻碱基。起始密码子决定翻译的开始，终止密码子决定翻译的停止。
1．下列属于获取目的基因的方法的是( )
①利用mRNA反转录形成 ②从基因文库中提取 ③从受体细胞中提取 ④利用PCR技术 ⑤利用DNA转录 ⑥人工合成
A．①②③⑤ B．①②⑤⑥
C．①②③④ D．①②④⑥
【解析】 获取目的基因的方法包括从基因文库中获取目的基因、利用PCR技术扩增目的基因和利用DNA合成仪用化学方法直接人工合成。目的基因属于外源基因，不能从受体细胞中提取，利用DNA转录合成的是RNA，不是目的基因。
【答案】 D
2．下图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ的酶切位点， ampr为青霉素抗性基因，tetr为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoR Ⅰ，BamH Ⅰ在内的多种酶的酶切位点。据图回答：
(1)将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoR Ⅰ酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有___________________、____________、____________三种。
(2)用上述三种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物有____________；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物有____________。
(3)目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是____________，其合成的产物是____________。
(4)在上述实验中，为了防止目的基因和质粒在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是__________________。
【解析】 (1)将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoR Ⅰ酶切，所产生的黏性末端相同，用DNA连接酶处理后，不同的片段随机结合，可形成3种不同的连接物：目的基因——目的基因、目的基因——载体、载体——载体。(2)在上述三种产物中，插入目的基因的都不能在四环素培养基上生长，只有载体——载体连接产物才能在含四环素的培养基上生长。(3)启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，可启动转录过程，合成mRNA。(4)由图示和题目中提供的信息可知，同时运用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ进行酶切可有效防止酶切后产生的末端发生任意连接。
【答案】 (1)目的基因——载体连接物 载体——载体连接物 目的基因——目的基因连接物
(2)载体——载体连接物 目的基因——载体连接物、载体——载体连接物
(3)启动子 mRNA (4)EcoR Ⅰ和BamHⅠ
知识点二| 目的基因的导入、检测和鉴定
1．导入目的基因
(1)将目的基因导入植物细胞最常用的是农杆菌转化法。
(2)将目的基因导入动物细胞常用的是显微注射法。
(3)将目的基因导入微生物细胞常用的方法是Ca2＋处理法。
2．检测和鉴定目的基因
(1)从DNA水平检测：DNA分子杂交法。
(2)从RNA水平检测重组体：分子杂交技术。
(3)从蛋白质水平检测：抗原—抗体杂交。
(4)从个体水平对其生物学特定性状进行检测。
将苏云金芽孢杆菌(图一)的毒蛋白基因提取出来导入普通棉花(图二)细胞可培育成转基因抗虫棉(图三)。请依据以上内容探究下列问题。
探讨：为什么植物的体细胞可以作为受体细胞，而动物的体细胞不能作为受体细胞？
提示：植物细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程成为完整植物体，因此受体细胞可以是受精卵也可以是体细胞；动物体细胞全能性受到限制，不能发育为一个新个体，因此动物基因工程中的受体细胞一般是受精卵。
探讨：从细胞器的功能上分析，若通过基因工程生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌作受体细胞吗？
提示：不可以。糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加工完成的，而内质网和高尔基体存在于真核细胞中，大肠杆菌是原核生物，细胞中不含有这两种细胞器。
探讨：检测棉花中导入的抗虫基因是否表达的最简便的方法是什么？
提示：用叶片饲养棉铃虫，观察棉铃虫是否死亡。
探讨：DNA分子杂交的原理是什么？有哪些应用？
提示：碱基互补配对原则。可用于亲子鉴定、刑事侦查、生物亲缘关系鉴定等。
1．导入目的基因
目的基因导入受体细胞的方法。
细胞类型
方法
转化过程
特点
植物细胞
农杆菌转化法
目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→插入植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达
经济、有效，适用于双子叶植物和裸子植物
动物细胞
显微注射法
目的基因表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
最为有效的将目的基因导入动物细胞的方法
微生物细胞
Ca2＋处理法
Ca2＋处理微生物细胞→感受态细胞→将基因表达载体与感受态细胞混合在缓冲液中→一定温度下促使感受态细胞吸收DNA分子
简便、经济、有效
[特别提醒]
(1)将目的基因导入植物细胞培育转基因植物时，受体细胞可以是体细胞和受精卵，因为植物体细胞具有全能性。
(2)将目的基因导入动物细胞培育转基因动物时，受体细胞是受精卵，不能用体细胞，因为高度分化的动物体细胞的全能性受到限制。
(3)微生物细胞作为受体细胞具有繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等优点。
(4)将基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌的常用方法是Ca2＋处理法。Ca2＋(CaCl2溶液)对微生物细胞的作用是增加细胞壁的通透性。
2．检测和鉴定目的基因
检测水平
检测内容
方法
结果显示
分子水平的检测
检测转基因生物的染色体上是否插入了目的基因
DNA分子杂交技术(基因探针＋转基因生物的DNA)
是否显示出杂交带
检测目的基因是否转录
分子杂交技术(基因探针＋转基因生物的mRNA)
是否显示出杂交带
检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗原—抗体杂交
是否显示出杂交带
个体水平的检测
包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性及抗性程度；基因工程产品需要与天然产品进行活性比较等
[特别提醒]
不同分子检测的原理、场所、探针的异同
(1)进行转录水平的检测原理与复制水平的检测原理是相似的，只是被检测的物质不再是转基因生物的基因组DNA，而是转基因生物的细胞内的mRNA；进行翻译水平的检测，则是利用抗原与抗体特异性结合的原理。
(2)不论是复制水平、转录水平还是翻译水平的检测，都是在体外进行的。
(3)在DNA分子，mRNA分子上检测目的基因是否插入、目的基因是否转录时，用的探针都是放射性同位素等标记的含有目的基因的DNA片段。
1．基因工程中科学家常采用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，主要原因是( )
A．结构简单，操作方便 B．繁殖速度快
C．遗传物质含量少 D．性状稳定，变异少
【解析】 目的基因导入受体细胞后，随着受体细胞的繁殖而复制，由于细菌等微生物繁殖速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。因此，基因工程常用的受体细胞有细菌、真菌等。
【答案】 B
2．科学家通过基因工程方法，将苏云金芽孢杆菌的Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内，并成功实现了表达，从而培育出了能抗棉铃虫的棉花植株——抗虫棉。其过程大致如图所示。根据题意，回答下列问题。
(1)基因工程操作程序的一般步骤是____________、____________、____________、________。
(2)Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，其上有T-DNA，把目的基因插入Ti质粒的T-DNA中是利用T-DNA的______________的特点。
(3)将目的基因导入受体细胞的方法有很多种，该题中涉及的是______________。
(4)若目的基因能在棉株体内稳定维持和表达，主要是因为_____________，分子水平检测目的基因是否表达的方法是______________。
【解析】 本题以抗虫棉的培育为背景，考查了运用基因工程技术培育转基因作物的步骤、方法。农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞的常用方法，利用它能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，以及其Ti质粒上的T-DNA能转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体DNA上的特点，可以把目的基因插入其Ti质粒的T-DNA中，借助其作用使目的的基因成功导入受体细胞。
【答案】 (1)获取目的基因 构建基因表达载体 导入目的基因 检测和鉴定目的基因
(2)可转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上
(3)农杆菌转化法
(4)目的基因插入了受体细胞的染色体DNA中 抗原—抗体杂交
[课堂小结]
知识网络构建
核心语句归纳
1.基因工程的操作步骤：获取目的基因→构建基因表达载体→目的基因的导入→目的基因的检测与鉴定
2.获取目的基因的三种方法：基因文库直接获得、PCR扩增、人工合成。
3.基因表达载体的构成：目的基因、启动子、终止子、标记基因等。
4.导入目的基因的方法有：农杆菌转化法、显微注射法、Ca2＋处理法。
5.检测目的基因的方法：DNA分子杂交法、DNA—RNA分子杂交、抗原—抗体杂交、个体水平检测。
1．下列不属于获取目的基因的方法的是( )
A．利用DNA连接酶复制目的基因
B．化学方法直接合成
C．从基因文库中获取目的基因
D．利用PCR技术扩增目的基因
【解析】 本题考查目的基因的获取方法及DNA聚合酶和DNA连接酶的区别。对目的基因(DNA片段)进行复制需利用DNA聚合酶而不是DNA连接酶。
【答案】 A
2．基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的是( )
A．目的基因与载体的结合
B．将目的基因导入受体细胞
C．目的基因的表达
D．目的基因的人工合成
【解析】 合成目的基因及其与载体的结合都有碱基互补配对过程，而将目的基因导入受体细胞是通过载体的运输作用进入的，不存在碱基互补配对过程。
【答案】 B
3．要检测目的基因是否成功地插入受体DNA中，需要用核酸探针，核酸探针是指( )
A．用于检测疾病的医疗器械
B．用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子
C．合成β-球蛋白的DNA
D．合成苯丙羟化酶的DNA片段
【解析】 核酸探针是指已知核苷酸序列的DNA片段(实际上是单链)，为了便于对杂交结果进行检测，需要对其做放射性同位素或荧光分子标记。
【答案】 B
4．下列关于基因工程的叙述，错误的是( )
A．目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物
B．限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶
C．人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性
D．载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达
【解析】 基因工程中目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物；常用的工具酶是限制性核酸内切酶和DNA连接酶；人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性，只有经过一定的物质激活以后，才有生物活性；载体上的抗性基因主要是有利于筛选含重组DNA的细胞，不能促进目的基因的表达。所以D错误。
【答案】 D
5．(2019·全国卷Ⅰ)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括________和________。
(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是________________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。
(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是_______________________________________________________________
________________________________________________________________。
【答案】 (1)基因组文库 cDNA文库
(2)解旋酶 加热至90～95 ℃ 氢键
(3)Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
课件75张PPT。第一章 基本工程第一节 基因工程概述
第2课时 基因工程的实施过程23获取目的基因和构建基因表达载体4载体 受体菌 受体菌 5基因组文库 部分基因文库 6扩增 DNA分子半保留复制 生物体外 PCR 简单 可靠 短 穆里斯 7化学方法 DNA合成仪 小 脱氧核苷酸 8受体细胞 表达 稳定 遗传 目的基因 启动子 910111213141516171819202122232425262728293031323334353637目的基因的导入、检测和鉴定38农杆菌转化法 显微注射法 Ca2＋处理法 39DNA分子 分子 抗原—抗体 个体 4041424344454647484950515253545556575859606162636465666768697071727374点击右图进入…Thank you for watching !课时分层作业(一)
(建议用时：45分钟)
[基础达标练]
1．下列有关基因工程叙述错误的是( )
A．最常用的载体是大肠杆菌的质粒
B．工具酶主要有限制性核酸内切酶和DNA连接酶
C．该技术人为地增加了生物变异的范围，实现种间遗传物质的交换
D．基本原理是基因突变
【解析】 基因工程的基本原理是基因重组，不同生物的DNA具有相同的结构以及遗传信息传递和表达方式相同是基因工程赖以完成的基础；基因工程中的工具酶是限制性核酸内切酶和DNA连接酶，最常用的载体是大肠杆菌质粒。该技术可克服生殖隔离现象，实现种间遗传物质交换，按照人的意愿使生物发生变异。
【答案】 D
2．下列实践活动包含基因工程技术的是( )
A．水稻F1花药经培养和染色体加倍，获得基因型纯合新品种
B．抗虫小麦与矮秆小麦杂交，通过基因重组获得抗虫矮秆小麦
C．将含抗病基因的重组DNA导入玉米细胞，经组织培养获得抗病植株
D．用射线照射大豆使其基因结构发生改变，获得种子性状发生变异的大豆
【解析】 A项属于单倍体育种，原理是染色体变异；B项属于杂交育种，原理是基因重组；C项属于基因工程育种，原理是基因重组；D项属于诱变育种，原理是基因突变。
【答案】 C
3．下列有关基因工程技术的叙述，正确的是( )
A．重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶和载体
B．所有的限制酶都只能识别同一种特定的脱氧核苷酸序列
C．一般选用细菌的质粒作为基因进入受体细胞的载体
D．细菌体内的质粒可以直接作为基因工程中的载体
【解析】 此题考查基因工程的基本工具及相关知识。解答此类题目须明确以下知识：(1)基因操作的工具酶有限制性核酸内切酶(简称限制酶)和DNA连接酶。(2)一种限制酶只能识别特定的脱氧核苷酸序列，并从特定的位点切开，不同的限制酶识别的脱氧核苷酸序列是不同的。(3)载体是基因的运载工具，一般选用细菌的质粒作为载体，它既可以携带外源基因进入受体细胞，或独立复制或整合到受体细胞的DNA上，又有特殊的遗传标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。但在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
【答案】 C
4．下列说法中不正确的有( )
①限制性核酸内切酶全部是从真核生物中分离纯化而来的 ②DNA连接酶全部是从原核生物中分离得到的 ③所有限制性核酸内切酶识别的脱氧核苷酸序列均由6个核苷酸组成 ④不同限制性核酸内切酶切割DNA的位点不同 ⑤有的质粒是单链DNA
A．①②④⑤ B．①②③⑤
C．②③④⑤ D．①③④⑤
【解析】 限制性核酸内切酶主要是从原核生物中分离得到的，所以①错误；DNA连接酶中的一类是从原核生物大肠杆菌中分离得到的，另一类是从T4噬菌体中得到的，所以②错误；不同的限制性核酸内切酶识别的脱氧核苷酸序列不同，不一定都是6个核苷酸，所以③错误；质粒都是双链环状DNA分子，所以⑤错误。
【答案】 B
5．下列关于DNA连接酶作用的叙述，正确的是( )
A．将单个核苷酸加到某DNA片段末端，形成磷酸二酯键
B．将断开的两个DNA片段的骨架连接起来，重新形成磷酸二酯键
C．连接两条DNA链上碱基之间的氢键
D．只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，而不能将双链DNA片段平口末端之间进行连接
【解析】 DNA连接酶和DNA聚合酶都是催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键。DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，将两个DNA片段连接成重组DNA分子。DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已存在的核酸片段上形成磷酸二酯键，合成新的DNA分子。
【答案】 B
6．据图判断，有关工具酶功能的叙述错误的是( )
A．限制性核酸内切酶可以切断a处
B．DNA聚合酶可以连接a处
C．解旋酶可以使b处解开
D．DNA连接酶可以连接c处
【解析】 a处指的是两个相邻脱氧核苷酸之间的脱氧核糖与磷酸之间的磷酸二酯键，而c处指的是同一个脱氧核苷酸内的脱氧核糖和磷酸之间的化学键，DNA连接酶不能连接此化学键。
【答案】 D
7．作为基因工程中的“分子运输车”——载体，应具备的条件是( )
①必须有一个或多个限制性核酸内切酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上 ②载体必须具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制 ③必须带有标记基因，以便进行重组后的筛选 ④必须是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去 ⑤大小应合适，太大则不易操作
A．①②③④ B．①②③⑤
C．①③④⑤ D．①②③④⑤
【解析】 基因操作中运输目的基因的载体必须有一个或多个限制性核酸内切酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上；载体必须具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制；必须带有标记基因，以便进行重组后的筛选；必须是安全的；大小应合适，太大则不易操作。
【答案】 D
8．下图表示限制性核酸内切酶切割某DNA分子的过程，下列有关叙述，不正确的是( )
A．该限制酶能识别的碱基序列是GAATTC，切点在G和A之间
B．用此酶切割含有目的基因的片段时，必须用相应的限制性核酸内切酶切割载体，产生与目的基因相同的黏性末端
C．要把目的基因与载体“缝合”起来，要用到基因工程的另一个工具——DNA聚合酶
D．限制酶切割DNA分子时，是破坏了同一条链上相邻脱氧核苷酸之间的化学键，而不是两条链上互补配对的碱基之间的氢键
【解析】 由图示可知，该限制酶识别的碱基序列是GAATTC，切点在G和A之间；要获得重组DNA分子，必须用限制性核酸内切酶切割载体和目的基因，得到相同的黏性末端；将目的基因与载体“缝合”起来的是DNA连接酶，而不是DNA聚合酶；限制性核酸内切酶切割的是同一条链上相邻脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。
【答案】 C
9．限制酶是一种核酸切割酶，可识别并切割DNA分子上特定的核苷酸序列。下图为四种限制酶BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ以及Bgl Ⅱ的识别序列。箭头表示每一种限制酶的特定切割部位，其中哪两种限制酶所切割出来的DNA片段末端可以互补黏合？其正确的末端互补序列是什么( )
A．BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ 末端互补序列为AATT—
B．BamH Ⅰ和Hind Ⅲ 末端互补序列为GATC—
C．EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ 末端互补序列为AATT—
D．BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ 末端互补序列为GATC—
【解析】 图中四种限制酶切割DNA分子所形成的黏性末端分别是
可知BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ切割DNA分子产生的末端的碱基是互补的。
【答案】 D
10．科学家通过基因工程，需要从苏云金芽孢杆菌中提取抗虫基因，放入棉花细胞中发挥作用，回答有关问题：
(1)从苏云金芽孢杆菌中切割抗虫基因所用的工具是________________。此工具主要存在于___________中，其特点是_______________________________
_____________________________________________________________。
(2)将抗虫基因导入棉花细胞需要的运输工具具有的特点是
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________，
最常用的载体是________，除了它还有________、________。
【答案】 (1)限制性核酸内切酶 细菌 一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的位点切割 (2)有一个至多个限制性核酸内切酶切割位点，在受体细胞中可进行自我复制，具标记基因 质粒 λ噬菌体的衍生物 动植物病毒
[能力提升练]
11．下面是四种不同质粒的示意图，其中ori为复制必需的序列，amp为氨苄青霉素抗性基因，tet为四环素抗性基因，箭头表示一种限制性核酸内切酶的酶切位点。若要得到一个能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长的含重组DNA的细胞，应选用的质粒是( )
【解析】 A项破坏了复制必需的序列。B项氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因都完好，在四环素培养基上和氨苄青霉素培养基上都能生长。C项氨苄青霉素抗性基因被破坏，四环素抗性基因完好，能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长。D项氨苄青霉素抗性基因完好，四环素抗性基因被破坏。
【答案】 C
12．下图表示一项重要的生物技术，对图中物质a、b、c、d的描述，正确的是( )
A．a的基本骨架是磷酸和核糖交替连接而成的结构
B．要获得相同的黏性末端，要用相同的b去切割a和d
C．c连接双链间的氢键，使黏性末端处碱基互补配对
D．若要获得未知序列的d，可到基因文库中去寻找
【解析】 a是载体质粒，b是限制性核酸内切酶切割质粒，c是DNA连接酶，连接质粒和目的基因，d是目的基因。质粒是环状DNA，其基本骨架是磷酸和脱氧核糖交替连接而成的。要想获得同一种黏性末端要用同一种限制性核酸内切酶。DNA连接酶连接的是磷酸和脱氧核糖之间的键，不是氢键。对于未知序列的目的基因是无法从基因文库中获取的。
【答案】 B
13．现有一长度为3 000碱基对(bp)的线性DNA分子，用限制性核酸内切酶酶切后，进行凝胶电泳，使降解产物分开。用酶H单独酶切，结果如图1。用酶B单独酶切，结果如图2。用酶H和酶B同时酶切，结果如图3。该DNA分子的结构及其酶切图谱是( )
【解析】 从图中所示的结果看，酶H单独酶切时会将DNA切割成两种长度(分别为2000bp、1000bp)，可以排除D选项；酶B单独酶切时使DNA切割成三种长度(分别为2000bp、600bp、400bp)，由此可排除BC选项。
【答案】 A
14．根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)限制性核酸内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有________和________。
(2)质粒运载体用EcoR Ⅰ切割后产生的片段如下：
AATTC……G
G……CTTAA
为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoR Ⅰ切割外，还可用另一种限制性核酸内切酶切割，该酶必须具有的特点是___________
______________________________________________________。
(3)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即________DNA连接酶和________DNA连接酶。
(4)基因工程中除质粒外，________和________也可作为运载体。
(5)请画出质粒被切割形成黏性末端的过程图。
【解析】 当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的则是平口末端。为使运载体与目的基因相连，用另一种限制酶切割后形成的黏性末端必须与EcoR Ⅰ切割形成的黏性末端相同。根据酶的来源不同，可以将DNA连接酶分为两类：一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为大肠杆菌DNA连接酶；另一类是从T4噬菌体中分离出来的，称为T4DNA连接酶。基因工程中除质粒外，还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等也可作为运载体。
【答案】 (1)黏性末端 平口末端 (2)切割产生的DNA片段末端与EcoR Ⅰ切割产生的相同 (3)大肠杆菌 T4 (4)λ噬菌体的衍生物 动植物病毒
(5)―→＋
15．基因工程又叫做基因拼接技术。该技术能够通过对生物的基因进行改造和重新组合，产生出人类所需要的基因产物。自20世纪70年代基因工程发展起来以后，人们开始采用高新技术生产各种基因产品。下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1和图2表示基因工程部分操作过程：
限制酶
BamH Ⅰ
Hind Ⅰ
EcoR Ⅰ
Sma Ⅰ
识别序列及切割位点
G↓GATC C
C CTAG↑G
A↓AGCT T
T TCGA↑A
G↓AATT C
C TTAA↑G
CCC↓GGG
GGG↑CCC
(1)从表中四种酶的切割位点看，可以切出平口末端的酶是________。
(2)将目的基因与质粒DNA缝合时，两条链上的磷酸、脱氧核糖在________酶的作用下连接起来，形成磷酸二酯键；两条链间的碱基对通过______连接起来。
(3)图2中的质粒分子可被表中________酶切割，切割后的质粒含有________个游离的磷酸基团。
(4)若对图中质粒进行改造，插入的Sma Ⅰ 酶切位点越多，质粒的热稳定性越________。
(5)在相关酶的作用下，甲与乙能否拼接起来？并说明理由：
_______________________________________________________________
______________________________________________________________。
【解析】 (1)由表格中四种限制酶切割位置可知，Sma Ⅰ可切出平口末端。(2)目的基因与质粒缝合时用DNA连接酶进行连接，形成磷酸二酯键，两条链之间的碱基通过碱基互补配对原则形成氢键。(3)根据质粒的碱基序列可知，质粒分子可被EcoR Ⅰ酶切割，切割后形成链状DNA，有2个游离的磷酸基团。(4)热稳定性越高的DNA分子中C-G配对越多，可知，Sma Ⅰ酶切割的序列中碱基对都是C-G，所以Sma Ⅰ酶切位点越多，质粒的热稳定性越高。(5)由图可知，甲和乙的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下可以拼接起来。
【答案】 (1)Sma Ⅰ酶 (2)DNA连接 氢键
(3)EcoR Ⅰ 2 (4)高 (5)能；二者具有相同的黏性末端
课时分层作业(二)
(建议用时：45分钟)
[基础达标练]
1．下列关于基因表达载体导入微生物细胞的叙述中，不正确的是( )
A．常用原核生物作为受体细胞，是因为原核生物繁殖快，且多为单细胞，遗传物质相对较少
B．受体细胞所处的一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态称为感受态
C．感受态细胞吸收DNA分子需要适宜的温度和酸碱度
D．感受态细胞吸收重组表达载体DNA分子的液体只要调节为适宜的pH即可，没必要用缓冲液
【解析】 将基因表达载体导入微生物细胞时，需在一定条件(如适宜的温度、pH等)下，将基因表达载体和感受态的微生物细胞混合培养，在培养过程中，可能会影响pH的变化，因此要加入缓冲液，以保持适宜的pH。
【答案】 D
2．在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中，下列操作错误的是( )
A．用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸
B．用DNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体
C．将重组DNA分子导入烟草原生质体
D．用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞
【解析】 限制酶一般只切断DNA分子双链，而烟草花叶病毒是RNA病毒，DNA连接酶是连接目的基因和运载体，将重组DNA分子导入烟草原生质体是利用农杆菌转化法，根据能在含除草剂的培养基上能生长的是转基因烟草细胞，所以选A。
【答案】 A
3．利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列各项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是( )
A．棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因
B．大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNA
C．山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列
D．酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白
【解析】 基因的表达即控制蛋白质的合成，只有合成了相应的蛋白质才能证明目的基因完成了在受体细胞中的表达。
【答案】 D
4．下列有关基因工程技术的正确叙述是( )
A．重组DNA技术所用的工具酶是限制性核酸内切酶、连接酶、载体
B．为育成抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体细胞
C．选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快
D．只要目的基因进入了受体细胞就能成功表达
【解析】 A项中的载体不是酶；B项中的受体细胞常用受精卵，但有时也可用植物体细胞；D项中，目的基因进入受体细胞并不一定能成功表达。
【答案】 C
5．下列获取目的基因的方法中需要模板链的是( )
①从基因文库中获取目的基因
②利用PCR技术扩增目的基因
③逆转录法
④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成
A．①②③④ B．①②③
C．②③④ D．②③
【解析】 PCR利用的是DNA双链复制原理，即将双链DNA之间的氢键打开，变成单链DNA，作为聚合反应的模板。逆转录法则是以目的基因转录成的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，先逆转录形成互补的单链DNA，再合成双链的DNA。①④则均不需要模板。
【答案】 D
6．关于基因工程，下列说法正确的是( )
A．基因工程的设计和施工都是在细胞水平上进行的
B．质粒是基因工程中唯一的运载体
C．基因工程的核心是将重组DNA分子导入受体细胞中
D．运载体必须具备的条件之一是：具有一个至多个限制酶切点，以便与外源基因连接
【解析】 基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，A错误；运载体常用的是质粒，其次还可以用λ噬菌体的衍生物、动植物病毒，B错误；基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，C错误；作为运载体应该具备一个至多个限制酶切点，以便与外源基因连接，D正确。
【答案】 D
7．下图表示基因工程中获取水稻某目的基因的不同方法。下列相关叙述中正确的是( )
A．三种方法都需酶并均在体外进行
B．①②③碱基对的排列顺序均相同
C．三种方法均属人工合成法
D．方法a不遵循中心法则
【解析】 这三种方法都是在体外进行的，且都用到酶(方法a需要逆转录酶和DNA聚合酶、方法b需要限制酶、方法c需要DNA聚合酶)，A正确；方法a得到的目的基因不含有内含子，方法c得到的目的基因的碱基序列可能有多种，因此①②③碱基对的排列顺序不都相同，B错误；图示a和c属于人工合成法，而b是从供体细胞的DNA中直接分离基因的方法，C错误；方法a遵循碱基互补配对原则，D错误。
【答案】 A
8．下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述，正确的是( )
A．表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA反转录获得
B．表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原(起)点
C．借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来
D．启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用
【解析】 A项，胰岛素基因只能在胰岛B细胞中表达，不能在肝细胞中表达，因而不能通过人体肝细胞mRNA反转录获得。B项，复制原点是表达载体复制的起点，胰岛素基因表达的起点是启动子。C项，基因表达载体中一般以抗生素抗性基因为标记基因，因此可借助抗生素抗性基因将含有胰岛素基因的受体细胞筛选出来。D项，终止密码子是翻译终止的信号，不是转录终止的信号。
【答案】 C
9．(多选)小鼠杂交瘤细胞表达的单克隆抗体用于人体试验时易引起过敏反应，为了克服这个缺陷，可选择性扩增抗体的可变区基因(目的基因)后再重组表达。下列相关叙述正确的是( )
A．设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列
B．用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列
C．PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶
D．一定要根据目的基因编码产物的特性选择合适的受体细胞
【解析】 设计引物时应当考虑由此扩增的目的基因与载体两端的序列进行互补配对；PCR体系中应用耐高温的DNA聚合酶，而不是从受体细胞中提取的普通DNA聚合酶。
【答案】 BD
10．(2018·全国卷Ⅰ)回答下列问题：
(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了________________________________________________(答出两点即可)。
(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的________方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与________组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是________。
(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用____________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加________的抑制剂。
【解析】 (1)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达，说明体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达。
(2)噬菌体属于细菌病毒，宿主细胞只能是细菌，所以在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是细菌。
(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解，为防止蛋白质被降解，选择的大肠杆菌体内应该没有可以降解蛋白质的酶，所以选择蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加蛋白酶的抑制剂。
【答案】 (1)体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达
(2)转化 外壳蛋白(或答噬菌体蛋白) 细菌
(3)蛋白酶缺陷型 蛋白酶
[能力提升练]
11．采用基因工程技术将人凝血因子基因导入山羊受精卵，培育出了转基因羊。但是，人凝血因子只存在于该转基因羊的乳汁中。以下有关叙述，正确的是( )
A．人体细胞中凝血因子基因编码区的碱基对数目，等于凝血因子氨基酸数目的3倍
B．可用显微注射技术将含有人凝血因子基因的重组DNA分子导入羊的受精卵中
C．在该转基因羊中，人凝血因子基因存在于乳腺细胞，而不存在于其他体细胞中
D．人凝血因子基因开始转录后，DNA连接酶以DNA分子的一条链为模板合成mRNA
【解析】 人体细胞是真核细胞，其基因中含有内含子，其碱基对数大于氨基酸数的三倍；山羊的受精卵中导入人凝血因子基因，长成的山羊每个体细胞中都含有这种基因；DNA连接酶是把两条DNA链末端之间的缝隙“缝合”起来，而不是参与转录。基因工程外源基因的导入多采用人工的方法，使体外重组的DNA分子转移到受体细胞，在本题中可采用显微注射法。
【答案】 B
12．人们试图利用基因工程的方法，用乙种生物生产甲种生物的一种蛋白质。生产流程是：甲生物的蛋白质→mRNA目的基因与质粒DNA重组导入乙细胞获得甲生物的蛋白质，下列说法正确的是( )
A．①过程需要的酶是逆转录酶，原料是A、U、G、C
B．②要用限制性核酸内切酶切断质粒DNA，再用DNA连接酶将目的基因与质粒连接在—起
C．如果受体细胞是细菌，可以选用枯草杆菌、炭疽杆菌等
D．④过程中用的原料不含有A、U、G、C
【解析】 ①过程是逆转录，利用逆转录酶合成DNA片段，所需要的原料含有A、T、G、C；②是目的基因与质粒DNA重组阶段，需要用限制性核酸内切酶切断质粒DNA，再用DNA连接酶将目的基因与质粒连接在一起；③如果受体细胞是细菌，则不应该用致病菌，而炭疽杆菌是致病菌；④过程是基因的表达过程，原料中含有A、U、G、C。
【答案】 B
13．(双选)利用基因工程技术生产羧酸酯酶(CarE)制剂的流程如下图所示，下列叙述正确的是( )
A．过程①需使用逆转录酶
B．过程②需使用解旋酶和PCR获取目的基因
C．过程③使用的感受态细胞可用NaCl溶液制备
D．过程④可利用DNA分子杂交鉴定目的基因是否已导入受体细胞
【解析】 ①过程是逆转录过程，需要逆转录酶催化；从cDNA文库中获取所需要的目的基因，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置或基因翻译产物蛋白质等特性来获取，不需要用解旋酶，也不需要PCR；用CaCl2溶液处理大肠杆菌，可使其成为感受态细胞；鉴别目的基因是否导入受体细胞可利用DNA分子杂交技术。
【答案】 AD
14．如图是从酵母菌获取某植物需要的某种酶基因的流程，结合所学知识及相关信息回答下列问题：
(1)图中cDNA文库________基因组文库(填“大于”“等于”或“小于”)。
(2)①过程提取的DNA需要________的切割，B过程是________。
(3)为在短时间内大量获得目的基因，可用________扩增的方法。目的基因获取之后，需要进行____________，其组成必须有________________________以及标记基因等，此步骤是基因工程的核心。
(4)将该目的基因导入某双子叶植物细胞，常采用的方法是________________，其能否在此植物体内稳定遗传可以用________技术进行检测。
【解析】 (1)cDNA文库小于基因组文库。(2)提取目的基因需要限制酶，逆转录法获得目的基因需要逆转录酶。(3)短时间内大量获得目的基因，可用PCR技术扩增的方法。基因表达载体的组成必须有目的基因、标记基因、启动子和终止子，基因表达载体的构建是基因工程的核心。(4)将目的基因导入某双子叶植物细胞常采用的方法是农杆菌转化法，目的基因只有整合到植物细胞的染色体上才能在植物体内稳定遗传，可通过DNA分子杂交的方法对目的基因是否整合到染色体上进行检测。
【答案】 (1)小于 (2)限制酶 反转录(或逆转录) (3)PCR技术 基因表达载体的构建 启动子、终止子、目的基因 (4)农杆菌转化法 DNA分子杂交
15．科研人员研究发现，一种植物激素——油菜素内酯能促进农药在植物体内的降解和代谢。研究人员发现，用油菜素内酚处理后，许多参与农药降解的基因(如P450)的表达和酶活性都得到提高，在这些基因的“指导”下合成的蛋白酶能把农药逐渐转化为水溶性物质或低毒无毒物质，有的则被直接排出体外。某课题组进一步进行了如下图所示的实验操作，请据图回答：
(1)获得油菜素内酯基因的方法有______________、________________(举两种即可)。第①步用PCR技术扩增基因时用到的耐高温的酶通常是指______________。步骤②用到的酶有________________。
(2)图中导入重组质粒的方法是________。在导入之前应用________处理。
(3)导入重组质粒以后，往往还需要进行检测和筛选，可用________________制成探针，检测是否导入了重组基因；在培养基中加入________可将含有目的基因的细胞筛选出来。
(4)请你为该课题命名：___________________________。
【解析】 进行基因工程操作时，首先要获取目的基因，其方法有多种：从基因文库中获取、人工合成或PCR合成等。在构建基因表达载体的过程中，用到的工具酶有限制酶和DNA连接酶。图中的受体细胞是细菌，故可用转化法导入表达载体，导入后，需检测和筛选。从图中可以看出，最终是通过对照实验来检测转基因细菌对土壤中残留农药的分解能力。
【答案】 (1)从基因文库中获取 人工合成或PCR合成 耐热的DNA聚合酶(或TaqDNA聚合酶) 限制酶和DNA连接酶
(2)转化法 氯化钙溶液
(3)红霉素抗性基因 红霉素
(4)油菜素内酯能否促进土壤中农药的分解
