课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
学习目标：1.明确用培养基对微生物进行选择的原理。(重点) 2.学会统计微生物数量的方法。(重点) 3.能进行实验设计与操作，并对实验结果进行分析和评价。(难点)
1．研究思路
(1)筛选菌株的思路
①自然界中目的菌株的筛选
ⅰ依据：根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
ⅱ实例：PCR技术过程中用到的耐高温的TaqDNA聚合酶，就是从热泉中筛选出来的Taq细菌中提取出来的。
②实验室中目的菌株的筛选
ⅰ原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
ⅱ方法：利用选择培养基分离。
a．选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时阻止或抑制其他种类微生物生长的培养基。
b．实例：选择分解尿素的细菌的培养基，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。
(2)统计菌落数目
①常用方法：稀释涂布平板法。
ⅰ原理
ⅱ计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M。
C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数。
V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)。
M：代表稀释倍数。
ⅲ注意事项
a．为了保证结果准确，一般设置三个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值。
b．统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
c．设置对照：主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。
②其他方法：利用显微镜直接计数。
2．实验设计及操作提示
(1)实验设计
①土壤取样
从富含有机质、酸碱度接近中性且潮湿的土壤取样。先铲去表层土，在距地表约3～8 cm的土壤层取样。
②样品的稀释
ⅰ稀释原因：样品的稀释度直接影响平板上生长的菌落数目。
ⅱ稀释标准：选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证获得菌落数在30～300之间，便于计数。
ⅲ微生物的培养与观察
a．培养：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。
b．观察：每隔24_h统计一次菌落数目，最后选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
(2)操作提示
①无菌操作
ⅰ取土样的用具在使用前都需要灭菌。
ⅱ应在火焰旁称取土壤，并在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。
ⅲ在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。
②做好标记：本实验使用的平板和试管比较多。为避免混淆，最好使用前就做好标记。
③制定计划：对于耗时较长的生物实验，要事先制定计划，以便提高工作效率。
(3)菌种鉴定
①原理：分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，使培养基的碱性增强。
②方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。
1．判断对错
(1)因为土壤中各类微生物的数量不同，所以，为获得不同类型的微生物要按不同的稀释倍数进行分离。 ( )
(2)测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围不同。 ( )
(3)如果得到了两个或两个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。 ( )
(4)牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显少于选择培养基上的菌落数目，说明选择培养基已筛选出一些菌种。 ( )
提示：(1)√ (2)√ (3)√ (4)× 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显大于选择培养基上的菌落数目，才说明选择培养基具有筛选作用。
2．产生每个标准菌落的细菌的最初数目和培养基分别是( )
A．一个细菌，液体培养基
B．许多细菌，液体培养基
C．一个细菌，固体培养基
D．许多细菌，固体培养基
C [在微生物的培养中产生每个标准菌落的细菌的最初数目是一个细菌，使用的培养基为固体培养基。]
微生物的筛选与计算
[合作交流]
1．根据选择培养基的原理，如何筛选出耐酸菌？
提示：可将培养基的pH调至酸性，再接种培养。
2．如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？
提示：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板上菌落数的平均值，然后按照公式进行计算。
3．稀释涂布平板法和显微计数法对微生物计数产生的实验误差如何？试分析原因。
提示：稀释涂布平板法计数的值比实际值偏小，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落；显微计数法计数的结果比实际值偏大，原因是显微镜下无法区分细胞的死活，计数时包括了死细胞。
1．选择培养基的选择作用
(1)原理：根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。
(2)方法：
①在培养基中加入某种化学物质。例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。
②改变培养基中的营养成分。例如，缺乏氮源时可以分离固氮微生物；石油作为唯一碳源时，可以分离出能消除石油污染的微生物；用含无机碳源的培养基分离自养型微生物。
③改变微生物的培养条件。例如，将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物；用普通培养基在无氧条件下分离厌氧型和兼性厌氧型微生物。
2．统计菌落数目的方法
微生物生长量的测定有计数法、重量法、生理指标法等方法，但是一般使用计数法，计数法可分为直接计数法和间接计数法。二者的比较如下表所示：
项目
直接计数法
间接计数法
原理
利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌
主要用具
显微镜、细菌计数板
培养基
计数数据
菌体本身
培养基上菌落数
优点
计数方便、操作简单
计数的是活菌
缺点
死菌、活菌都计算在内
操作较复杂，有一定误差
计算公式
每毫升原液含菌数＝每小格平均菌体数×400×10 000×稀释倍数
每毫升原液含菌数＝培养基上平均菌落数×稀释倍数÷涂布液体积
特别提醒：能在选择培养基上生长的不一定是所需要的目的菌
原则上选择培养基只能允许特定种类的微生物生长，但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能在选择培养基上生长的微生物不一定都是所需的微生物，还需进一步的鉴定。
[典题通关]
自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。步骤如下：
①制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。
②为了得到更加准确的结果，应选用________法接种样品。
③适宜温度下培养。
结果分析：
(1)测定大肠杆菌数时，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，与事实更加接近的是________。
A．一个平板，统计的菌落数是230
B．两个平板，统计的菌落数是220和260，取平均值240
C．三个平板，统计的菌落数分别是400、212和256，取平均值289
D．四个平板，统计的菌落数分别是210、260、240和250，取平均值240
(2)一同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上菌落数的平均值为212，那么每毫升样品中的菌落数约是(涂布平板时所用的稀释液体积为0.2 mL)________。
(3)用这种方法测定菌体密度时，实际活菌数量要比测得的数量________(填“多”或“少”)，因为
_____________________________________________________
_____________________________________________________。
[技巧点拨] (1)因为题中操作的目的需要对大肠杆菌进行数量的测定，所以接种的方法是稀释涂布平板法。
(2)测定活菌数量时，选择的平板越多误差越小，且选择的平板要能形成30～300个菌落。
(3)所做的多个平板中，如果其中一个平板中菌落的数目明显多于或少于其他几个平板，则说明该平板不符合要求，应重做或舍弃。
[解析] 若对大肠杆菌进行计数，则需要用稀释涂布平板法接种样品。(1)应选取多个菌落数相差不大的平板进行计数，取其平均值。(2)212÷0.2×106＝1.06×109(个)。(3)因为一个菌落可能由两个或多个细菌连在一起生长而成，所以实际活菌数量要比测得的数量多。
[答案] 步骤②：稀释涂布平板
结果分析：(1)D (2)1.06×109个 (3)多 当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
(1)如果某同学的稀释倍数仅为104，则测定的数值要比题中操作的数值高还是低？为什么？
(2)第(1)小题C项中菌落数为400的平板不符合要求，试分析该平板中菌落数目多于其他平板的可能的原因。
提示：(1)低，因为稀释倍数太低，则大部分菌落是多个细菌繁殖而成，所以观察到的菌落的数值要低于由单一细菌形成的菌落数值。
(2)①培养基被污染，一些菌落是由杂菌繁殖而成的；②接种过程中由于操作不当感染了杂菌；③取菌液时没有摇晃，所取菌液中细菌个体浓度偏大等。
1．分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是( )
①加尿素 ②不加尿素 ③加琼脂 ④不加琼脂 ⑤加葡萄糖 ⑥不加葡萄糖 ⑦加硝酸盐 ⑧不加硝酸盐
A．①③⑤⑦ B．②④⑥⑧ C．①③⑤⑧ D．①④⑥⑦
C [要分离土壤中分解尿素的细菌，培养基中尿素应是唯一的氮源，不能加硝酸盐；在固体培养基上形成菌落，要加琼脂作凝固剂；分解尿素的细菌是异养生物，要加有机碳源(如葡萄糖)。]
2．某同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为234，那么每毫升样品中菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL)( )
A．2.34×108个 B．2.34×109个
C．234个 D．23.4个
B [平板上菌落的平均数×稀释倍数÷体积＝每毫升样品中的菌落数，即234×10×106＝2.34×109个。]
实验设计与操作
[合作交流]
1．为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？当测定时为什么要将稀释的范围放宽一些？
提示：这是因为土壤中各类微生物的数量(单位：株/kg)是不同的；为确保能从中选择出菌落数在30～300之间的平板进行计数。
2．在稀释涂布平板法中，为何需涂布3个平板？
提示：作为重复实验，统计时取平均值，以减少偶然因素对实验结果的影响，增强实验结果的说服力。
3．统计菌落数目的理论依据是什么？
提示：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
4．为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果？
提示：尽量缩小统计的菌落数与实际活菌数的差值，因为繁殖慢的菌体开始看不出明显的菌落。
1．实验流程
稀释度
104
105
106
1
2
3
平均值
1
2
3
平均值
1
2
3
平均值
菌落数/平板
菌数/克土壤
2.实验设计原则
(1)设立重复组：统计某一稀释度下平板上的菌落数时，要至少涂布3个平板作重复组，以增强实验结果的说服力与准确性。
(2)设立两种对照组：
①判断培养基中是否有杂菌污染，需同时将未接种的选择培养基进行培养。
②判断选择培养基是否具有筛选作用，需同时设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上的菌落数目，进行对比得出结论。
3．结果分析与评价
内容
结果分析
有无杂菌污染的判断
对照的培养皿中无菌落生长―→未被杂菌污染
培养基中菌落数偏高―→被杂菌污染
菌落形态多样，菌落数偏高―→培养物中混入其他杂菌
选择培养基的筛选作用
牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目大于选择培养基的数目―→选择培养基具有筛选作用
样品的稀释操作
得到2个或2个以上菌落数目在30～300的平板―→操作成功
重复组的结果
若选取同一种土样，统计结果应接近
[典题通关]
尿素是一种重要的氮肥，农作物不能将其直接吸收利用，而是通过土壤中的细菌将其分解为氨和CO2后才能被农作物利用。请回答下列问题：
(1)土壤中的某些细菌能分解尿素是因为该种细菌能合成________。
(2)为筛选尿素分解菌而制备的培养基中含有的营养物质除尿素外，还包括水、碳源________等，该培养基能筛选出目的菌株的原因是________________________________________。
(3)一般依据尿素分解菌菌落的________、隆起程度和颜色等特征来统计菌落数目。现将10 mL尿素分解菌悬液进行梯度稀释，分别取0.1 mL稀释倍数为106的样液接种到3个培养基上，培养一段时间后，统计菌落数分别为39、42、45，则1 mL悬液中活细菌数量为________个。上述过程采用的接种方法是______________。
(4)为检验培养基及培养皿灭菌是否合格，可采取的措施是______________________________。
[解析] (1)分解尿素的细菌中含有脲酶，能将尿素分解。(2)微生物的培养基中需含有水、无机盐、碳源和氮源，尿素作为氮源。因为只有含有脲酶的细菌才能利用尿素作为氮源生长，因此该培养基能筛选出分解尿素的细菌。(3)一个菌落为一个细菌繁殖的后代，不同的微生物的菌落不同，菌落的特征包括形状、大小、隆起程度，据此来统计菌落的数目。微生物计数的方法采用稀释涂布平板法接种，1 m悬液中细菌的数目为(39＋42＋45)÷3÷0.1×106＝4.2×108个。(4)单独设置一个灭菌后不接种样液的含培养基的培养皿进行培养，观察该培养基上是否出现菌落，从而判断灭菌是否合格。
[答案] (1)脲酶
(2)无机盐 只有以尿素作为唯一氮源的细菌才能在该培养基上生长
(3)形态、大小 4.2×108 稀释涂布平板法
(4)单独设置一个灭菌后不接种样液的培养皿(含培养基)进行培养
下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是( )
A．用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板
B．取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上
C．将实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培养24～48 h
D．确定对照组无菌后，选择菌落数在300 以上的实验组平板进行计数
D [检测细菌总数，用蒸馏水配制培养基，常用高压蒸汽灭菌法灭菌后，取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上，将实验组和对照组放置在适宜条件下培养，在确定对照组无菌后，选择菌落在30～300的平板为代表进行计数，D错误。A是培养基的灭菌方法，B设置了一系列对照实验，C是细菌的培养方法，A、B、C三个选项均是正确的。故选D。]
[课堂小结]
知 识 网 络 构 建
核 心 语 句 归 纳
1.选择培养基是指允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
2.设置对照的主要目的是排除实验中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。
3.在标记培养皿时，应注明培养基种类、培养日期以及平板上培养样品的稀释度等。
4.为确保结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板上进行计数。
5.只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素为唯一氮源的选择培养基分离能分解尿素的细菌。
6.鉴定分解尿素细菌的方法是在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，根据是否变红进行判断。
1．土壤中的细菌能分解尿素，是因为它们能合成一种( )
A．尿素酶 B．脲酶
C．蛋白酶 D．肽酶
B [能够分解利用尿素的细菌，其细胞内含有脲酶，可以把尿素分解成氨，然后进一步利用。]
2．分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是( )
选项
尿素
琼脂
葡萄糖
硝酸盐
A
＋
＋
＋
＋
B
－
－
－
－
C
＋
＋
＋
－
D
＋
－
－
＋
注：“＋”表示加入，“－”表示不加。
C [分离土壤中分解尿素的细菌，培养基中要有碳源，且以尿素作为唯一的氮源，故不能添加硝酸盐。]
3．可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是( )
A．以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂
B．以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂
C．以尿素为唯一氮源的培养基中加入苏丹Ⅲ试剂
D．以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂
A [在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，则我们可确定该种细菌能够分解尿素。故正确答案为A。]
4．(2019·全国卷Ⅰ)已知一种有机物X(仅含有C、H两种元素)不易降解，会造成环境污染。某小组用三种培养基筛选土壤中能高效降解X的细菌(目标菌)。
Ⅰ号培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入X(5 g/L)。
Ⅱ号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(15 g/L)。
Ⅲ号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(45 g/L)。
回答下列问题。
(1)在Ⅰ号培养基中，为微生物提供氮源的是________。Ⅱ、Ⅲ号培养基中为微生物提供碳源的有机物是________。
(2)若将土壤悬浮液接种在Ⅱ号液体培养基中，培养一段时间后，不能降解X的细菌比例会__________，其原因是________。
(3)Ⅱ号培养基加入琼脂后可以制成固体培养基，若要以该固体培养基培养目标菌并对菌落进行计数，接种时，应采用的方法是________________。
(4)假设从Ⅲ号培养基中得到了能高效降解X的细菌，且该菌能将X代谢为丙酮酸，则在有氧条件下，丙酮酸可为该菌的生长提供________和________。
[答案] (1)牛肉膏、蛋白胨 X
(2)下降 不能降解X的细菌因缺乏碳源不能增殖，而能降解X的细菌能够增殖
(3)稀释涂布平板法
(4)能量 合成其他物质的原料
课件64张PPT。专题2 微生物的培养与应用课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数生存环境 TaqDNA聚合酶 目的菌株 抑制或阻止 特定种类 阻止或抑制 尿素 脲酶 稀释涂布平板 稀释度 活菌 菌落数 (C÷V)×M 平均菌落数 体积(mL) 稀释倍数 三 30～300 平均值 低 一个菌落 菌落数 活菌数 非测试因素 显微镜 3～8 稀释度 菌落数目 30～300 温度 时间 24 h 菌落 稳定 灭菌 火焰 棉塞 火焰 标记 制定计划 氨 碱性 尿素 酚红 红 微生物的筛选与计算 实验设计与操作 点击右图进入…Thank you for watching !课时分层作业(五) 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
(建议用时：35分钟)
[基础达标练]
1．下列关于土壤取样的叙述错误的是( )
A．土壤取样，应选取肥沃、湿润的土壤
B．先铲去表层土3 cm左右，再取样
C．取样用的小铁铲和信封在使用前不用灭菌
D．应在火焰旁称取土壤
C [微生物的培养要注意无菌操作，土壤取样用的小铁铲和信封在使用前需灭菌，后续稀释等操作均需在火焰旁进行。]
2．用以尿素为唯一氮源加入酚红指示剂的培养基，培养细菌后，指示剂将( )
A．变蓝色 B．变红色
C．变黑色 D．变棕色
B [细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，会使培养基的碱性增强，pH升高，加入酚红指示剂将变红。]
3．用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是( )
A．未接种的选择培养基
B．未接种的牛肉膏蛋白胨(全营养)培养基
C．接种了的牛肉膏蛋白胨(全营养)培养基
D．接种了的选择培养基
C [将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此可用接种了的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照。本实验的变量是培养基种类，其他方面如接种、培养条件等应相同。]
4．下列属于菌落特征的是( )
①菌落的形状 ②菌落的大小 ③菌落的多少 ④隆起程度 ⑤颜色 ⑥有无荚膜
A．①②③④ B．①②④⑤
C．②③④⑥ D．①②③④⑤⑥
B [不同种类的细菌所形成的菌落大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一定特征，所以，每种细菌在一定条件下所形成的菌落，可以作为鉴定的重要依据。单个细菌用肉眼是看不见的，故细菌的个体特征不能作为菌种鉴定的依据。]
5．某同学对101、102、103倍稀释液计数的平均菌落数分别是2 760、295和16，则菌落总数为(所用稀释液体积为0.1 mL)( )
A．2.76×104个/mL
B．2.95×105个/mL
C．4.6×104个/mL
D．3.775×104个/mL
B [为保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数，因此只有295符合要求。其稀度倍数为102，所用稀释液体积为0.1 mL，代入计算公式得菌落总数为2.95×105个/mL。]
6．产生标准形态菌落的细菌的最初数目和培养基分别是( )
A．一个细菌、液体培养基
B．许多细菌、液体培养基
C．一个细菌、固体培养基
D．许多细菌、固体培养基
C [在液体培养基中生活的细菌，无论是一个还是许多，肉眼都是看不见的。在固体培养基上的细菌，当数目较少时也是看不见的。当固体培养基上有许多细菌并且集中在较小范围内时，肉眼可见。而菌落是一个细菌或几个细菌的子细胞群体，形成于固体培养基上，有一定的形态结构，所以肉眼可见。同种细菌形成的菌落，形态结构是相同的。如果有许多细菌形成的菌落，就不可能有比较标准的形态，因为许多细菌的话，第一不可能是同一种细菌，第二不可能在培养基的同一个点上。]
7．下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是( )
A．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、蒸馏水
B．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、琼脂、蒸馏水
C．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、尿素、琼脂、蒸馏水
D．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、蒸馏水
A [在A项的培养基中既有尿素作为唯一氮源，又有其他各种成分，可以选择出分解尿素的细菌；而C项中缺少碳源，B项中无尿素作氮源，D项中有牛肉膏可提供氮源的成分。]
8．欲从土壤中分离出能分解尿素的细菌，下列实验操作不正确的是( )
A．将土壤用无菌水进行一系列的梯度稀释
B．同一浓度的土壤稀释液应至少涂布三个平板
C．可将未接种的培养基在相同条件下培养作为对照
D．用加入刚果红指示剂的培养基可筛选出分解尿素的细菌
D [在以尿素为唯一氮源的培养基中应加入酚红作为指示剂，指示剂变红说明该菌种能分解尿素。]
9．尿素是一种重要的农业肥料，但若不经细菌的分解，就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物种类、数量繁多，某生物小组试图探究土壤中微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能高效降解尿素的细菌(目的菌)。培养基成分如下表所示，实验步骤如下图所示。请分析回答：
KH2PO4
Na2HPO4
MgSO4·7H2O
葡萄糖
尿素
琼脂
1.4 g
2.1 g
0.2 g
10 g
1 g
15 g
(1)培养基中加入尿素的目的是筛选________，这种培养基属于________培养基。
(2)“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的________和________，实验中需要振荡培养，目的是____________________。
(3)转到固体培养基上时，常采用________法接种，获得单个菌落后继续筛选。
(4)下列材料或用具中，需要灭菌的是________；需要消毒的是________。(填序号)
①培养细菌用的培养基与培养皿 ②玻璃棒、试管、锥形瓶和吸管 ③实验操作者的双手
(5)简述土壤中可分解尿素细菌的鉴定方法及原理：
_____________________________________________________
_____________________________________________________
_____________________________________________________
_____________________________________________________。
[解析] (1)培养基中加入尿素为唯一氮源能够筛选出能分解尿素的细菌，此培养基属于选择培养基。(2)尿素为“目的菌”提供氮源，葡萄糖为“目的菌”提供碳源。振荡培养基可融入氧气，为培养的目的菌提供必需的氧气。(5)见答案。
[答案] (1)目的菌 选择 (2)尿素 葡萄糖 为目的菌提供氧气 (3)稀释涂布平板(或平板划线) (4)①② ③ (5)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂；细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，使培养基的碱性增强，pH增高，使酚红指示剂变红
10．从自然界微生物中筛选某菌种的一般步骤是：采集菌样―→富集培养―→纯种分离―→性能测定。
(1)不同微生物的生存环境不同，获得理想微生物的第一步是从合适的环境采集菌样，然后再按一定的方法分离、纯化。例如，培养噬盐菌的菌样应从____________环境中采集。
(2)富集培养指创设仅适合待分离微生物旺盛生长的特定环境条件，使其数量大大增加，从而分离出所需微生物的培养方法。对产耐高温淀粉酶微生物的富集培养应选择________________的培养基，并在________条件下培养。
(3)接种前要对培养基进行____________处理。在整个微生物的分离和培养中，一定要注意在________条件下进行。
(4)如图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图，请分析接种的具体方法。
获得图A效果的接种方法是______________________，
获得图B效果的接种方法是____________________________。
一同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是_____________________________________________________应当怎样操作才可避免此种现象？___________________________________________。
(5)如果探究温度对纤维素酶活性的影响，自变量是________，应该保持______________等不变(至少答两项)。
[解析] (1)筛选菌种应从适于目的菌种生长、繁殖的环境中寻找，故培养噬盐菌应从高盐环境中采集。(2)富集培养时培养基及培养条件应能促进目的菌的生长、繁殖。(3)微生物的分离及培养中必须保证无菌，包括培养基的灭菌和操作过程的灭菌等。(4)纯化培养中接种方法有稀释涂布平板法和平板划线法，前一种方法形成的菌落分布较均匀，后一种方法形成的菌落分布不均匀，先划线的部分菌落密集甚至相连，后划线的部分菌落分布稀疏。(5)探究温度对酶活性的影响时，温度为自变量，酶活性为因变量，其他变量如底物和酶的用量、pH、反应时间等均为无关变量。
[答案] (1)海滩等高盐 (2)以淀粉为唯一碳源 高温 (3)高压蒸汽灭菌 无菌 (4)稀释涂布平板法 平板划线法 菌液浓度过高 增大稀释倍数(或培养过程被杂菌污染 严格无菌操作；或用接种环划下一区域前接种环没有灭菌 每划一个新区域前都要对接种环进行灭菌处理)(原因与操作要对应) (5)温度 纤维素的量与浓度、反应时间、pH
[能力提升练]
11．选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物，通过不含有机物的培养基、缺氮培养基、含尿素(不含其他氮源)的培养基，可从土壤中分离出的微生物依次是( )
A．硝化细菌、放线菌、根瘤菌
B．根瘤菌、青霉菌、固氮菌
C．异养型细菌、放线菌、硝化细菌
D．自养型细菌、固氮菌、分解尿素的细菌
D [选择培养基是根据不同微生物的代谢特点，通过改变培养基的成分，以达到选择某种微生物的目的。不含有机物的培养基可以选择自养型微生物，缺少氮元素的培养基可以培养固氮微生物，含尿素(不含其他氮源)的培养基可以选择能分解尿素的微生物。]
12．用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是( )
A．涂布了1个平板，统计的菌落数是230
B．涂布了2个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238
C．涂布了3个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163
D．涂布了3个平板，统计的菌落数分别是210、240和250，取平均值233
D [在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性，所以A、B两项不正确；C项虽涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另两个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误；因此，不能简单地用3个平板的计数值求平均值。]
13．实验测定链霉素对3种细菌的抗生素效应，用3种细菌在事先准备好的琼脂平板上面3条等长的平行线(3条线均与图中的链霉素带接触)，将平板置于37 ℃条件下恒温培养3天，结果如图所示。从实验结果分析，以下叙述不正确的是( )
A．链霉素能阻止结核杆菌的生长
B．链霉素对结核杆菌比对霍乱菌更有效
C．链霉素对结核杆菌比对伤寒菌更有效
D．链霉素可以用于治疗伤寒病人
D [从图中可以看出，这是含有链霉素的选择培养基，接种的三种细菌中，霍乱菌和结核杆菌都可以被杀灭，并且链霉素对结核杆菌杀灭的有效程度大于霍乱菌，而伤寒菌照常生长不受影响，所以选项D错误。]
14．下列利用选择培养基筛选微生物的方法，不正确的是( )
A．根据微生物对碳源需求的差别，使用含不同碳源的培养基
B．根据微生物缺乏的特殊营养物质的种类，在培养基中增减不同的特殊营养物质
C．根据微生物遗传组成的差异，在培养基中加入不同比例的核酸
D．根据微生物对抗生素敏感性的差异，在培养基中加入不同的抗生素
C [由于不同的微生物对碳源、氮源、无机盐、特殊营养物质的需求不同和对不同抑菌物质敏感性不同，因此，可以根据微生物的生长需求来配制特殊的培养基以获得单一菌种，也可以根据其对抗生素等抑菌物质的敏感性不同，加入不同的抗生素来获得单一菌种。微生物不能直接利用加入培养基中的核酸，因此向培养基中加入不同比例的核酸对分离、纯化菌种是无用的。]
15．在探究培养液中酵母菌种群数量变化的实验中，需利用计数板对微生物细胞进行直接计数。如图所示，计数板是一个特制的可在显微镜下观察的玻片，样品就滴在计数室内。计数室由25×16＝400个小室组成，容纳液体总体积为0.1 mm3。某同学操作时将1 mL酵母菌样品加99 mL无菌水稀释，用无菌吸管吸取少许使其自行渗入计数室，盖上盖玻片并用滤纸吸去多余菌液，进行观察计数。
(1)在实验中，某同学的部分实验操作过程是这样的：①从静置试管中吸取酵母菌培养液加入计数板进行计数，并记录数据；②把酵母菌培养液放置在冰箱中；③第七天再取样计数，记录数据，统计分析绘成曲线。
请纠正该同学实验操作中的3处错误：
①_____________________________________________________；
②_____________________________________________________；
③_____________________________________________________。
(2)在实验前应该对计数板、吸管等器具进行____________处理。
(3)如果一个小方格内酵母菌过多，难以数清，应采取的措施是________。
(4)如果观察到a、b、c、d、e 5个大格共80个小室内共有酵母菌48个，则上述1 mL酵母菌样品中约有酵母菌________个，要获得较为准确的数值，减少误差，你认为该怎么做？________________。
[解析] (1)在从试管中吸取酵母菌培养液之前，应将试管轻轻振荡几下，目的是使酵母菌在培养液中均匀分布。酵母菌的培养液应置于适宜条件下，并且每隔24小时就要统计一次菌落数目。(2)为了避免杂菌污染，实验中所用吸管、计数板等器具需进行灭菌处理。(3)、(4)题解答时要注意以下两点：①统一单位；②注意体积的变化。400个小室共容纳液体总体积为0.1 mm3，则80个小室容纳液体的体积为：2×10－2mm3，含酵母菌48个，又因酵母菌培养液总体积为100 mL，统一单位后即可求出酵母菌的个数。
[答案] (1)①应将试管轻轻振荡几下再吸取酵母菌培养液进行计数 ②应将酵母菌培养液放置在适宜温度下培养 ③应连续七天，每天观察、取样计数并记录数据 (2)灭菌 (3)适当稀释 (4)2.4×108 多次计数，求平均值
