基因工程原理[下学期]

课件87张PPT。第六章 基因工程原理第一节 基因工程的概念及其主要内容
第二节 基因工程中的工具酶
第三节 基因克隆的质粒载体
第四节 目的基因的分离
第五节 基因与载体的重组与导入受体细胞
第六节 重组体的筛选
第七节 目的基因的表达第一节 基因工程的概念及其主要内容一、基因工程的概念：
利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应形成重组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程.基因工程(gene engineering)常和以下名称混用遗传工程(genetic engineering);
基因克隆(gene cloning);
分子克隆(molecular cloning);
基因操作(gene manipulation);
重组DNA技术(recombination DNA technique)
克隆(clone): 作名词时指含有某目的DNA片段的重组DNA分子或含有该重组分子的无性繁殖系.
作动词时是指基因的分离与重组过程。二、基因工程的主要内容或（步骤）1、从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段。
2、在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。
3、将重组DNA分子转移到适当的受体细胞(亦称寄主细胞)，并与之一起增殖。
4、从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。
5、从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用。
6、将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。三、基因工程技术及其应用转基因植物转基因动物作为生物发生器基因本身也是一个产业Rockfeller 大学将人肥胖基因出售0.2亿美元（1995年3月）
Amgen公司将FKBP神经免疫因子配体转让达3.29亿美元（1997年）
Millennium公司以4.65亿美元向Bayer公司转让225种基因的开发权（1998年9月）蛋白质工程的概念 在基因工程技术对编码蛋白质的基因的了解基础上，对蛋白质的氨基酸序列、结构和功能进行分析，进而通过对蛋白质的结构、氨基酸序列和翻译后的修饰等手段改变甚至创造出新的和更有效的蛋白质。蛋白质工程主要内容主要目标
蛋白质氨基酸序列的分析
蛋白质晶体结构分析
蛋白质功能预测和分析
蛋白质组分析酶工程的概念是酶学与工程学的相互渗透和结合所发展起来以酶为研究对象，改造并应用酶的特异催化功能。目标就是通过工程化技术大规模生产和转化相应原料成为有用物质的技术。
传统的酶工程主要是指天然酶制剂在工业上的大规模生产与应用。随着科学的发展，尤其是基因工程技术的日趋完善，为酶工程赋予了新的内容，特别是利用DNA操作技术，修饰改造酶分子的结构或活性位点、酶与底物作用位点，重组酶的生产，模拟酶的人工设计与合成等成为新的内容。 酶工程的主要内容酶的分离纯化
酶与细胞的固定化技术及反应器
酶制剂的发酵生产
酶分子化学修饰、遗传突变及结构改造
酶抑制剂与激活剂开发与研究
人工设计与合成模拟酶及酶分子发酵工程概念 发酵工程属于生物技术的下游技术，是工业化大规模培养细胞、生产生物制品的一种技术。
传统的发酵工程主要用于微生物。现代生物技术还包括动物、植物细胞和工程菌的发酵培养。 发酵工程技术发酵对象：
传统微生物发酵、基因工程菌发酵、动物细胞培养、植物细胞培养
发酵类型：
液体发酵、固体发酵、固定化培养、流式发酵
发酵技术设备生物技术的应用领域医药： 生物制药；基因治疗；人工器官
农业和畜牧业
转基因植物：抗病虫害新品种、抗逆新品种、 高品质新品种
转基因动物：生产有用蛋白质和高品质的畜产品
生物反应器：利用动植物细胞或组织作为生物反应器，直接生产有用蛋白质
轻工与食品
新型食品；营养食品；保健食品；轻工用酶
环境
污染治理；废物利用；污染物生物降解生物技术产业化生物技术产业：利用细胞和生物分子进行药品、农产品生产开发和环境治理的产业，该产业技术由医药生物技术、农业生物技术和环境生物技术共同组成
医药生物技术重点攻克癌症、艾滋病、老年痴呆症、帕金森病、心脏病、糖尿病等危害人类的顽疾
农业生物技术着眼于提高农产品的产量和质量。
环境生物技术重点用于清除危险废弃物 生物制药产业化特点高技术：高层次人才，高新技术手段，多学科渗透
高投入：在国外，一个生物药品平均要投入1~3亿美元，并随着开发难度的增大,有逐步增高的趋势
长周期：国际上，一个新的生物药品需要6~8年时间
高风险: 一个新药品的开发，经过一系列的程序-研发、中试、动物实验、I~III期临床实验，上市和严格的药政监督管理。每一步都可能失败，而前功尽弃
高回报: 开发成功一个新的生物药品, 回报很高。如美国Amgen公司，首次开发上市的EPO、G-SCF到1997年的销售额分别接近和达到20亿美元基因工程试剂的高回报碱性成纤维细胞生长因子 231元/ug
红细胞生成素 1072元/ug
白细胞介素-2 410元/ug
巨细胞粒细胞集落刺激因子 1960元/ug
胰岛素 10.2元/mg美国生物技术产业发展情况 美国生物制药产品种类及数量（PHRAM）疾病种类 产品数量 疾病种类 产品数量
感染性疾病 39 心脏病 26
神经系统疾病 28 呼吸系统疾病 22
艾滋病及相关疾病 19 自主免疫系统疾病 19
皮肤病 19 移植 13
消化系统疾病 11 遗传疾病 11
血液疾病 9 糖尿病及并发症 7
不育症 5 眼病 3
生长发育不良症 3 骨质疏松 2
妊娠预防 2 肿瘤疾病 175?基因治疗人数情况生物技术产业化—农业领域
已有35个科120多种植物获得转基因植物，一些重要的农作物获得商品化的转基因品种。
种植面积迅猛发展。
采用的基因正在从抗除草剂、抗菌素、抗病虫害基因到抗逆境、高品质方向发展。
由单个质量性状基因向多基因数量性状转变。
植物反应器生产稀有蛋白。世界转基因作物大田释放情况(1987.1-1998.4)转基因作物种植面积生物技术与传统中药中药现代化——核心是建立与现代基因学说相应的现代中药理论
现代中药理论的建立——确立中药与基因表达的关系
中药药靶（基因）或作用位点基因的寻找
中药化学组：中药有效成分包括较单一的成分和多种成分
中药临床药效的科学评价与分析方法
生物技术的应用
中药基因组——利用现代生物技术研究分析中药对人体（细胞）基因表达（蛋白质）的影响。 技术平台：大规模基因表达分析（基因芯片、SAGE、蛋白质组等技术）以及相关信息数据库的建立
中药化学组——利用现代仪器分析技术分析有效成分及其药物代谢、动力学。 技术平台：色谱及色谱-质谱，色谱-波谱，波谱-波谱联用等分析技术与层析、临界萃取等分离技术
中药新剂型第二节 基因工程中的工具酶限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割
DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化
核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割
核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成
核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接
核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰
其它酶类--用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等
一、限制性内切酶（一）、限制修饰系统的种类
（二）、限制性内切酶的定义、命名
（三）、限制酶的特点
（四）、异源同序酶（isoschizomer，同裂酶）
（五）、 限制酶的用途（一）、限制修饰系统的种类1.?I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS（host specificity for DNA restriction modification and specificity）位于染色体上，三个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（５—腺苷甲硫氨酸），无特异切割位点。
2.?II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在Ｅ. coli中这两种基因位于质粒上。
3.?III型：修饰酶与Ｉ型酶相同，hsdＭ与hsdＳ基因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。
上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。（二）、限制性内切酶的定义、命名 1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶； 狭义指II型限制酶。
2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
　例如：HindⅢ　　前三个字母来自于菌种名称H. influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。
EcoRI—Escherichia coli RI
HindⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ
SacI (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)（三）、限制酶的特点 1. 识别顺序和酶切位点
１）识别４-8个相连的核苷酸
MboI NGATCN；AvaII GG(A/T)CC
BamHI GGATCC：PpuMI PuGG(A/T)CCPy
Not I GCGGCCGC；
SfiI GGCC N N N N N GGCC
CCGGN’N’N’N’N’CCGG
Fok I 5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’
3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突起
２）富含ＧＣ ３）对称性—双对称
EcoRI 5’-G A A T T C-3’
3’-C T T A A G-5’
４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外
５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ
2.??末端种类
１）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸
Pst I 5’-CTGCAG-3’ 5’-CTGCA G-3’
3’-GACGTC-5’ 3’-G ACGTC-5’
２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸
EcoRI 5’-GAATTC-3’ 5’-GOH PAATTC-3’
3’-CTTAAG-5’ 3’-CTTAAP HOG-5’
粘性末端能与另一个相同的粘连末端相连接，任何两个具有相同识别位点的DNA分子经限制酶切割后能够重新连接成新的重组DNA分子。在进行DNA重组时，应用限制酶同时切割目的基因和载体DNA，使之产生相对的粘性末端，然后再将二者连接成重组DNA分子 ３）?平齐末端
SmaI 5’-CCCGGG-3’ 5’-CCC GGG-3’
3’-GGGCCC-5’ 3’-GGG CCC-5’
４）非互补的粘性末端
ａ）切点在识别顺序之外的，如：FokI
Fok I 5’-GGATG(Ｎ)9-3’ 5’-GGATG(N)9
3’-CCTAC(Ｎ)13-5’ 3’-CCTAC(N)13
ｂ）能识别简并顺序的，如：AvaI
AvaI 5’-CPyCGPuG-3’
CCCGGG; C TCGGG; CCCGAG; CTCGAG （四）、异源同序酶（isoschizomer，同裂酶） 1. 定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制 酶
2. 特点：1）识别相同顺序
2）切割位点的异同
KpnI GGTAC C Asp718 G GTACC
SstI CCGC GG SacI CCGC GG
（五）、 限制酶的用途 1.???? DNA重组
2.???? 限制酶（物理）图谱绘制
3.???? 突变分析（RFLP分析）
4. 限制酶的部分酶切与完全酶切
附：IIS型限制酶的特点
1.???? 具有特异型核苷酸顺序识别能力，但该顺序不具有对称结构。
2.???? 酶切位点与识别位点不一致，切点常在识别位点的一侧，1-- 20nt。
3.???? 酶切后的末端经补平后又可发生酶切反应。
4.???? 产生粘性末端可以是1--5个核苷酸。
5.???? 均为单体，分子量为47—108 kD。酶切图谱的构建（a）请构建该环状DNA分子的酶切图谱酶切图谱的构建（b）二、DNA甲基化酶（一）、 甲基化酶的种类与识别顺序1.???? 限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶
三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成5’-甲基胞嘧啶和6’-甲基腺嘌呤。
在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。
如：M. EcoRI GA mATTCC EcoRI G AATTC 不同
M．HpaI C mCGG HpaI C CGG 相同2.???? II型甲基化酶对限制酶活性的影响
１） 抑制同种限制酶的活性
M.BamHI GGATmCC—BamHI(G?GATCC)
M.EcoRI GAmATTC—EcoRI(G?AATTC)
２） 抑制不同种限制酶的活性
a. 顺序完全重叠 如：M. ClaI（ATCGmAT）----TaqI（TCGmA）
b. 顺序边界重叠 如：M. BamHI（GGATmCC）----MepI（mCCGG）
３） 抑制不同种限制酶的部分活性
M．TaqI（TCGmA）---HindII（GTPyPuAC）：GTCAAC，GTTAAC，GTCGmAC，GTTGAC
3.???? 甲基化酶的用途
１） 改变某些限制酶识别顺序的特异性，以便重组体的形成
２） 在建立基因文库时，可先使DNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切三、核酸酶（一）、外切酶III（ExoIII） 1. 一般特点： 来自于E.coli，分子量28,000 kD
2. 催化反应类型
1) 外切酶活性：3’→5’，产生5’-单磷酸核苷酸和具各种结构的 ds-DNA，pH 7.6-8.5
2) 核酸酶H活性：除去DNA-RNA杂交分子中的RNA分子，pH 7.6-8.5
3) 3’-磷酸酶活性：除去3’-磷酸基后形成3’-OH端，有利于DNA聚合酶反应，pH 6.8-7.4
4) 内切酶活性：在无嘌呤或无嘧啶处将DNA键切开，pH 7.6-8.5 3.??外切酶活性特点
1) 反应底物：互补ds-DNA
2) 碱基释放速度：C>>A-T>>G
3) 反应产物：5’-单磷酸核苷和具缺口或5’-端突起的ds-DNA，过度反应将导致DNA降解
4.??用途
1)??? 核酸（DNA）标记
2)??? 基因突变----缺失
3)??? DNA序列测定时作顺序缺失
5.??使用注意事项
1)??? 正式使用前，测定在一定条件下酶的反应速度
2)??? 在一定条件下，ExoIII不能作用GC富集区(来自于cDNA加尾)ds-DNA结构: 切口, 缺口, 断口ExoIII的外切酶和RNaseH的作用（二）、Rnase（三）、RNaseH（二）、RNase
大部分用于RNA的核苷酸序列分析或除去DNA样品或蛋白质合成系统中的RNA分子。
1. RNase A 分离自牛胰脏，对热稳定，抗去污剂（100℃加热15min仍具活性）, 用于除去DNA样品中的RNA分子
2. 核酸酶S7，亦称微球菌核酸酶，对RNA敏感，用于除去蛋白质合成系统中的内源mRNA
（三）、RNase H
作用于DNA-RNA杂交分子中的RNA链，用于cDNA文库建立时除去RNA链以便第二条链cDNA链的合成。 （四）、 DNase I1. 特点：具内切酶活性，作用于ds -DNA，但无核苷酸序列特异型，产生5’-P低聚核苷酸; Ca2+ , Mg 2+ 或Ca2+ , Mn2+可使酶活达最大值
当酶浓度很低时，ds -DNA分子上将形成切口，不同类型二价阳离子对两条链上切口位置形成有以下影响：Mg 2+存在时，两条链上的切口独立无关，Mn2+存在时，两条链上的切口几乎在同一位置
2. 用途
1) 切口移位，制备DNA探针
2) 制备RNA样品时除去DNA分子
3) 基因突变时产生切口 四、DNA聚合酶（一）、E.coli DNA聚合酶I（polI）
1. E.coli 的DNA聚合酶系统
Pol I 参与DNA修复, 具3’→5’和5’→3’外切酶活性
pol II 同上 具3’→5’外切酶活性
pol III 参与DNA复制, 具3’→5’和5’→3’外切酶活性
2. E.coli polI的特点
1）具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具5’→3’外切酶活性，大片段具3’→5’外切酶活性(大片段亦称为Klenow片段, polIK)
2） 聚合酶活性，5’→3’, 要求3’-OH引物和模板DNA，其延续性受反应条件的影响
3） 外切酶活性 3. 用途
1） 除去3’-端突起的单链DNA（在无dNTP时）
2） 补齐5’-突起端
3） 合成第二条cDNA
4） 切口移位制备探针 其中用途2) 和3)常用大片段（二）、 T4 DNA聚合酶 1. 特点：
5’→3’聚合酶活性，1500 nt/min, 为pol I的两倍 3’→5’外切酶活性，可作用于ss-DNA和dsDNA, 其切除速度分别为40和 4000nt/min
2.?用途：
制备高比活性探针(1010 cpm/μgDNA); DNA末端修饰---缺失（三）、Taq DNA聚合酶1. 特点：
分离自水生栖热菌，分子量为94,000，最适反应温度75℃， 对95℃高温具良好稳定性，该酶不存在3’→5’外切酶活性
2. 用途：
主要用于DNA的体外扩增，经25次循环后才进入酶的反应稳定期，一个DNA 分子因而可被扩增4×106倍。
DNA扩增技术又称为聚合酶链式反应，它包括以下三个步骤：
DNA模板变性(95℃) → 与DNA引物退火(45℃) → 引物延伸(75℃) Taq Pol 和PCR 五、连接酶（一）、T4 DNA连接酶
1. 特点：
只连接ds -DNA分子，要求3’-羟基和5’-磷酸基
2. 用途：
1) 相同或相容粘性末端的连接
2) 平整末端的相连
DNA平端来源：限制酶作用结果; 限制酶与其它酶共同作用结果 。平端的连接比粘性末端的连接要困难得多，所需的酶量也多
5’-AAGCTT-3’ 5’-AOH PAGCTT-3’ PAGCTT AOH
3’-TTCGAA-5’ 3’-TTCGAP HOA-5’ HOA TTCGAP
退火
5’-AHOPAGCT T AHOPAGCT T-3’
3’-T TCGAPOHA T TCGAPOHA-5’
或

5’-AHOPAGCT T AHOPAGCT T-3’
3’-T TCGAPOHA T TCGAPOHA-5’

T4 DNA连接酶
　　　　　　 5’-AAGCTT AAGCTT-3’
3’-TTCGAA TTCGAA-5’
或
　　 5’-AAGCTT AAGCTT-3’
3’-TTCGAA TTCGAA-5’ T4 DNA连接酶的连接反应(两种插入方向) +第三节 分子克隆的质粒载体 一、质粒的一般生物学特性；
二、质粒DNA的分离与纯化；
三、质粒载体的构建及类型；
四、常用质粒载体举例；一、质粒的一般生物学特性（一）、质粒DNA
1、质粒是细菌染色体外能够自主复制的环形双链的DNA分子。
2、编码抗菌素抗性基因的质粒叫R质粒。R质粒可将其抗性转移到缺乏该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。
2、质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外地游离状态，但在一定地条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体地复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
3、质粒DNA不仅能在细菌中复制，并且在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。
4、环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：共价闭合环状DNA（cccDNA），开环DNA（ocDNA），线性DNA（cDNA），具有不同的电泳迁移率，可在琼脂糖凝胶电泳中分开。（二）、质粒的拷贝数与不亲和性1、质粒的拷贝数是指某种质粒在一个细菌细胞内的数目。
根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-5个）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-200份拷贝）。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。
2、质粒的不亲和性，有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖构成中，其中必然有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质粒称为不亲和质粒。二、质粒DNA的分离与纯化（放在实验中讲）三、质粒载体的构建及类型（一）质粒载体的发展概况；
（二）质粒载体的特点（基本条件）；
（三）遗传标记基因
（四）质粒载体的类型（一）发展概况 1.??第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322 (1977, Bolivar et al)
2.??第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。
3.第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。 （二）载体特点1、 至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。
2、?至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。
3、?至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞。
4、具有较小的分子量和较高的拷贝数。
?注：前三个特点必不可少。（三）遗传标记基因1、 标记基因的作用
1）指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞
这种指示可以是选择性的（Ampr ，Tetr ，Kanr），也可以是非选择性的（如lacZ）
2）指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。
* 这种指示也可以是选择性的（如TcS），也可以是非选择性的（如TcS， lacZα），绝大多数为后者。
**有的遗传标记基因可以完成上述两项作用。当充任第一作用时，最好是选择性标记基因；当完成第二作用时，目前多采用非选择性的—检测性标记基因。有的基因是不能用作选择性标记基因（lacZ等）。2、?标记基因的种类
1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子）
主要是抗生素抗性基因: Ampr ，Tetr ，Cmlr，Kanr，Strr
2）生化标记基因
其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ
3、常用的遗传标记基因及其作用机制
1) 四环素抗性基因（ Tetr ，Tcr）
Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。
2) 氨苄青霉素抗性基因（ Ampr ，Apr）
Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。Apr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，可特异地切割氨苄青霉素的β—内酰胺环，使氨苄青霉素失活。3) 氯霉素抗性基因（ Cmlr ，Cmr）
Chlorophenicol可结合在核糖体50 S亚基上，阻止蛋白质合成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。
4) 卡那霉素(Kanr), 新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因
Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。Kanr等抗性基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞内。5）β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα）
β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为标记基因。
lacZ（lacZα）中含有多克隆位点，当无外源DNA片段插入时，质粒表达β—半乳糖苷酶的α-肽，与缺失突变体宿主菌（不能编码α-肽）表达的lacZ基因产物（ β链）互补，产生有活性的β—半乳糖苷酶，在含有指示剂X-gal和诱导剂IPTG的存在下，菌落呈现兰色；外源基因的插入后，破坏了lacZ α-肽基因的结构，细菌内不能产生β—半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。
β—半乳糖苷酶基因的优点:
a.?酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观
b. lacZα编码5‘-端可容许很大的变化（如加入多克隆位点）而不影响酶活性
c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大LacZ基因的结构与产物（四）、质粒载体的类型1、根据载体的分子生物学特性划分
（1）.?质粒型载体—环状dsDNA分子，自主复制
（2）.?病毒型载体—环状、线状、ss-和ds-DNA分子，形成病毒颗粒
（3）.混合型载体—具质粒和病毒特性，特性的转换依赖于宿主细胞生物学特性
2、根据载体功能划分
（1）. 普通型载体
1) 特点: 至少有一个以上的克隆位点和两个标记基因，其中一 个用于转化体选择，另一个用于重组子检测。
2) 用途: 基因组或cDNA文库的构建;次克隆(subcloning)或限制酶谱分析；外源DNA扩增。
例子: pBR322和pUC载体。
上述两例中的非重组子来源有两个：
a.? 酶切反应时仍未被作用的pBR322或pUC18分子
b. 酶切后的载体分子经自我连接又形成载体分子普通型载体pBR322的结构图pUC18和pUC19载体（2）、表达型载体（expression vector）
1)?特点:
a. 基因的启动子序列和终止子序列；
b. 一般无检测标记基因；
c.? 克隆位点是确定的（即位于启动子序列后）；
d. 重组分子用凝胶电泳检出（依赖于分子量差异）。
2)?结构:
a. 转化单元--宿主细胞转化
b. 表达单元--外源基因表达
3) 类型:
Ⅰ型：转录起始区（调控序列+启动子）+ 终止子
Ⅱ型: 转录起始区终止子 + 翻译起始区（核糖体结合序列和起始密码子）+ 终止子
Ⅲ型: 转录起始区 + 翻译起始区 + 信号肽链编码区 + 终止子（常称之为表达分泌型载体）三种表达型载体结构图 显然, 不同类型载体中所缺少的部分必须由外源基因提供。换言之,被表达的外源基因一旦确定, 表达载体的类型也就确定了。
4) 用途:
a. 表达外源基因以产生大量外源基因产物
b. 用于构建cDNA文库 四、常用质粒载体举例1、pBR322载体
2、pUC载体1、pBR322载体优点：
1、分子量较小，为4363bp，不仅利于自身DNA的纯化，可容纳的外源DNA也较大。
2、具有两种抗菌素抗性基因可供转化子的选择记号。
3、具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增后，每个细胞中可累积1000-3000个拷贝，为重组体DNA的制备提供了极大的方便。利用抗生素抗性基因筛选重组子的过程筛选重组子的示意图2、pUC18和pUC19 pUC系列质粒载体具有三个显著特点：
（1）、分子量更小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大；具有更高的拷贝数（不用氯霉素扩增，每个细胞含500-700个拷贝）。
（2）、含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZα，可利用?-互补原理进行蓝白筛选。
（3）、多克隆位点区（MCS）
由人工合成的多个单一酶切位点构成。每一种限制性内切酶会产生不同的粘性末端，可选用两种内切酶组合在质粒载体和外源DNA上产生相同的末端，进行双粘端连接，既提高克隆的效率，又可以定向克隆。
其MCS区与M13mp噬菌体载体的相同，可使pUC上克隆的目的基因直接转移到M13mp载体，进行DNA测序和体外突变等研究。pUC18和pUC19载体利用菌落颜色筛选重组子分子克隆载体的选择1. 选择克隆载体的几个重要参数
（1）实验对象
（2）实验性质
（3）载体容量
（4）合适克隆位点
（5）载体的稳定性
（6）载体DNA制备的难易
（7）外源基因表达产物产量、产物特点等2.?实验对象（1）供体：遗传背景与DNA特点等，其中包括染色体DNA大小，基因大小与结构，碱基组成，目的基因的产物特点以及遗传物质的传递方式等。
（2）受体：各种中间宿主与终宿主的遗传背景，如遗传物质的传递方式(包括人为的方法)，DNA限制修饰系统，DNA重组基因特点，基因产物修饰系统，即转录与翻译后修饰系统。
如常用于基因工程的宿主菌E.coli，菌株不同，基因型亦不同，不同载体要求不同菌株。如： E.coli DH5、 E.coli DH5α、 E .coliDH5αF’
1）?三者均有限制-修饰系统和重组基因缺陷，外源DNA可存活，且不发生重组
2）?DH5α和 DH5αF’都具有一个可供遗传标记lacZα检测的遗传背景
3）?DH5αF’可供M13mp系列载体配套使用，M13病毒的感染需要 F’的存在3. 实验性质分子克隆的一般程序包括以下几步：
（1）分离供体DNA或RNA（mRNA）和载体DNA
（2）构建基因文库或cDNA文库
（3）目的基因或cDNA 克隆的筛选
（4）目的基因或cDNA片段的鉴定：限制酶谱，次克隆，核苷酸序列分析，基因结构分析等
（5）基因表达与调控机理的研究1) 建立文库用载体 常在E.coli 进行
i.目的基因与供体基因大小
小—质粒载体，操作方便，鉴定简单
大—λ或cos质粒载体, 甚至pYAC载体(为减少文库规模，即使基因组小的也可用λ和cos载体）
ii.筛选方法
ⅰ)互补法：可表达,选一般载体;不表达，选表达载体(外源基因必须表达，表达产物必须具备活性)
ⅱ)免疫法：与上同，但表达产物不一定具生物活性
ⅲ)杂交法：各种载体均可
2) 目的基因的鉴定
次克隆：选用质粒载体，限制酶谱分析，基因结构分析等
定序：定序载体（M13mp系列），其他质粒载体（如pUC系列，pBR322，T3，T7，SP6启动子载体）
3) 基因表达与调控
外源基因可表达—普通载体; 不表达—表达型（分泌）载体 4.?载体容量
M13mp载体 <4 kb
细菌质粒载体 <10kb
λ载体 <23kb
cos质粒载体 <48kb
P1载体 <95 kb
pYAC载体 ∽1000 kb
5.?合适的克隆位点
单克隆位点和多克隆位点