课题3 分解纤维素的微生物的分离配套练习

课题3分解纤维素的微生物的分离
◇◇考点要求
1．能简述纤维素酶的种类及作用，
2．能从土壤中分离出分解纤维素的微生物，了解这类微生物的应用。
3．能掌握从土壤中分离某种特定微生物的操作技术。
◇◇双基过关
一、纤维素与纤维素酶
1．纤维素的化学组成： 三种元素，是一种糖 。
2．纤维素的分布： 是自然界中纤维素含量最高的天然产物，此外，木材、作物秸秆等也富含纤维素。
3．纤维素酶的作用：纤维素酶是一种 ，一般认为它至少包括三种组分，即 酶、CX
酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使 分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成 。
二、纤维素分解菌的筛选
1．筛选方法： 染色法。
2．筛选原理：刚果红可以与像纤维素这样的多糖物质形成 ，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。
三、土壤中纤维素分解菌的分离的实验方案
1．土壤取样采集土样时，应选择富含 的环境。
2．选择培养
(1)目的：增加纤维素分解菌的 ，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。
(2)制备选择培养基：参照课本旁栏中的比例配制。
(3)选择培养：称取土样20 g，在无菌条件下加入装有30mL培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在 上，在一定温度下振荡培养1～2 d，直至培养液变 。也可重复选择培养。
3．梯度稀释
参照专题1的稀释操作，依次将培养液稀释101～107倍。
4．将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
(1)制备培养基：参照课本旁栏中的比例。
(2)倒平板操作。
(3)涂布平板：将稀释度为104～106的菌悬液各取0．1 mL涂布在平板培养基上，30℃倒置培养。
5．挑选产生透明圈的菌落
参照课本刚果红染色法，挑选产生 的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。
参考答案：
一、1.C H O 多糖 2.棉花 3.复合酶
C1 菜纤维素 葡萄糖
二 1. 刚果红 2.红色复合物
三 1. 纤维素 2.(1)纯度 (3).摇床 混浊 5.透明圈
◇◇ 典例精析


【例1】纤维素酶可以将下列哪种物质分解…………………………………………( )
A．牛肉片 B．鱼片 C．滤纸条 D．塑料条
解析：纤维素酶只能使纤维素分解，本题中只有C项滤纸条的主要成分是纤维素，所以可以将滤纸条分解。
答案：C
启示：酶具有专一性，纤维素酶只能分解含纤维素的物质。


【例2】在加入刚果红的培养基中出现透明圈的菌落是……………………( )
A．分解尿素的细菌 B．硝化细菌 C．分解纤维素的细菌 D．乳酸菌
解析：分解纤维素的细菌能将纤维素分解，则刚果红一纤维素的复合物就无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。
答案：C
启示：在合纤维素的培养基中加入刚果红时出现的透明圈，一般是以纤维素分解菌为中心。


【例3】本实验关于选择培养目的叙述正确的是…( )
A．可以增加纤维素分解菌的浓度 B．可以减少纤维素分解菌的浓度
C．所用培养基是固体培养基 D．所用培养基是平板培养基
解析：这里选择培养的目的是增加纤维素分解菌的浓度，所用培养基是液体培养基，以便于下一步的稀释涂布操作。
答案：A
启示：掌握选择培养的目的。
◇◇基础自测
一、选择题
1．下列材料中纤维素含量最高的是……( )
A．杨树 B．小麦 C．玉米 D．棉花
2．纤维素酶能够分解……………………( )
A．纤维素的微生物 B．淀粉的微生物 C．纤维素 D．淀粉
3．刚果红能与哪项物质形成红色复合物( )
A．纤维二糖 B．纤维素 C．葡萄糖 D．麦芽糖
4．寻找纤维素分解菌应到………………( )
A．湿润的环境中 B．富含纤维素的环境中
C．富含无机盐的环境中 D．池塘中
5．纤维素分解菌的选择培养基有选择作用，原因在于其含有………………………( )
A．NaNO。 B．KCl C．酵母膏 D．纤维素粉
6．下列哪种生物能产生纤维素酶 …( )
A．纤维素分解菌 B．牛 c．羊 D．兔
7．选择培养时应将锥形瓶固定在………( )
A．桌子上 B．温箱里 C．窗台上 D．摇床上
8．选择培养的结果：培养液变…………( )
A．清澈 B．浑浊 C．红色 D．产生透明圈
9．刚果红染色时，加入刚果红可在……( )
①制备培养基时 ②梯度稀释时 ③倒平板时 ④涂布时 ⑤培养基上长出菌落时
A．①③ B．②⑤ C．③⑤ D．④⑤
10．两种刚果红染色法的结果是………( )
A．均会出现透明圈 B．均不会出现透明圈
C．方法一出现，方法二不出现 D．方法一不出现，方法二出现
二、非选择题
11．纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括 种组分，即 、
和 。
12．当纤维素被 分解后，刚果红一纤维素自合物就无法形成，培养基中会出现以
为中心的透明圈。这样，我们就可以通过是否产生 来筛选纤维素分解菌。
13．为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维分解菌?
14．请分析下面的培养基配方，回答下面的问题：
纤维素分解菌的选择培养基
纤维素粉 5 g
NaN03 1 g
Na2HP04·7H 20 1.2 g
KH2P04 0.9 g
MgS04·7H 20 0.5 g
KCl 0.5 g
酵母膏 0.5 g
水解酪素 0.5 g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000 mL
(1)上述配方是液体培养基还是固体培养基?为什么?

(2)这个培养基对微生物是否具有选择作用?如果具有，又是如何选择的?
(3)如果要证明该培养基的选择培养作用可用　　　　　　　　培养基做　　　实验。
15.请你设计实验来证明纤维素酶的作用。
实验步骤：
(1)取2支20mL的试管,分别放入1cm×6cm的　　　。
(2)再分别加入pH为4.8，物质的量浓度为0.1 mol·L-1的　　　　　　　　缓冲液10mL、11mL。
(3)在加入lOmL缓冲液的试管中加入1mL　　　　　　。
(4)将2支试管固定在摇床上，振荡反应1ｈ。结果：加纤维素酶的滤纸条被分解，另一支中的未分解。则证明： 。
◇◇知识拓展
1．为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物
在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。
2．两种刚果红染色法的比较
刚果红染色法在本课题中我们给出了两种方法：方法一是传统的方法，缺点是操作烦琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊，因为培养基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分。方法二的另一缺点是有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。
参考答案
课题3分解纤维素的微生物的分离
基础自测
一、1．D 2．C 3．B 4．B 5．D 6．A 7．D 8．B 9．C 10．A
二、11．C1酶 CX酶 葡萄糖苷酶
12．纤维素酶 纤维素分解菌 透明圈
13．由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对较高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。
14．(1)是液体培养基，原因是配方中无琼脂。
(2)有选择作用，本配方中的碳源是纤维素，所以能分解纤维素的细菌可以大量繁殖，不能利用纤维素的微生物则难以生存。
(3)　牛肉膏蛋白胨　对照。
15．(1) 滤纸条。
(2) 醋酸—醋酸钠
(3) 纤维素酶。
(4) 纤维素酶有分解纤维素的作用。
◇◇单元重点知识强化
一、微生物技术
1．培养基的制备
计算→称量→ →灭菌→ 。
2．无菌技术
主要指消毒和灭菌。
1)实验室中常用 或化学药物消毒，如用 擦拭双手。
2)灭菌的方法主要有 灭菌、 灭菌和 灭菌。
3)实验操作应在 环境中进行，例如酒精灯火焰旁。
3．倒平板操作
待培养基冷却至 左右时，在酒精灯火焰附近倒平板，严格遵循课本上的操作步骤。
4．平板划线操作：
平板划线法是指通过接种环在琼脂固体培养基表面 的操作，将聚集的菌种逐步稀释 到培养基的表面。
5．稀释涂布平板法：
是先将菌液进行系列 然后涂布平板，在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成 个细胞，从而能在培养基表面形成单个的 。
6．应用选择培养基分离某种特定的微生物
选择培养基是指允许特定种类的微生物生长，同时 或 其他种类微生物生长的培养基。本专题中有选择分解尿素的细菌和纤维素分解菌的两种选择培养基。
二、测定某种微生物的数量
每克样品中的菌落数=(C÷V)×M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均 ，V代表涂布平板时所用的稀释液的 (ml)，M代表 。
三、鉴定微生物的一些方法
1．鉴定分解尿素的细菌的方法：在以 为唯一氮源的培养基中加入 指示剂。指示剂若变 说明该种菌能分解尿素。
2．鉴定纤维素分解菌的方法：利用 染色法，如果培养基中出现 ，则说明很可能含有纤维素解菌。
总之，在实验室培养微生物，一方面需要为培养的微生物提供合适的营养和环境条件，另一方面需要确保无处不在的其他微生物无法混入。
参考答案：
一、1．溶化 倒平板 2．1) 紫外线 酒精 2) 灼烧 干热 高压蒸气 3) 无菌
3. 50℃ 4. 连续划线 分散 5．稀释 单 菌落 6. 抑制 阻止
二、菌落数 体积 稀释倍数
三、1．尿素 酚红 红 2.刚果红 透明圈
◇◇单元提升
一、选择题(每小题2分，共50分)
1．培养基能为微生物的生长繁殖提供…………………………………( )
A．水 B．碳源 C．氮源 D．水、碳源、氮源和无机盐等营养
2．牛肉膏可以为微生物提供……………………………………………( )
A．氮源和维生素 B．氢元素和氧元素 C．碳源、磷酸盐和维生素 D．无机盐
3．下列有关微生物培养的叙述错误的是………………………………( )
A．培养乳酸菌时需要在培养基中添加维生素 B．培养霉菌时需将培养基的pH调至碱性
C．培养细菌时需将pH调至中性或微碱性 D．培养厌氧微生物时则需要提供无氧的条件
4．下列几项需要用到灭菌的是…………………………………………( )
A．实验操作的空间 B．操作者的衣着和手 C．培养基 D．牛奶
5．下列关于进行微生物实验的叙述错误的是…………………………………………( )
A．在实验室中，切不可吃东西、喝水 B．离开实验室时不一定要洗手
C．进行实验操作前一定要对双手消毒 D．使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌
6． 下列部位中不含有微生物的是……………………………………( )
A．洗干净的脸上 B．洗完澡后的皮肤 C．刷完牙后的口腔 D．灼烧之后的灭菌环
7．关于牛肉膏蛋白胨固体培养基的配制需要在火焰旁操作的是………………………( )
A．称量 B．灭菌 C．溶化 D．倒平板
8．将配制好的培养基进行灭菌应用……………………………………( )
A．灼烧灭菌 B．高压蒸气灭菌 C．干热灭菌 D．煮沸灭菌
9．倒平板时需将培养基冷却至…………………………………………( )
A．室温 B．0℃左右 C．50℃左右 D．100℃左右
10．以下操作用到接种环的是…………………………………………( )
A．平板划线操作 B．系列稀释操作 C．涂布平板操作 D．倒平板操作
11．土壤中的细菌能分解尿素，是因为它们能合成…·……………·…………（ ）
A．尿素酶 B．脲酶 C．蛋白酶 D．细菌酶
12．DNA多聚酶链式反应(PCR)是一种在何处将少量DNA大量复制的技术…………( )
A．体内 B．体外 C．细菌体内 D．真菌体内
13．为了保证结果准确，一般选择菌落数为多少的平板进行计数…………………( )
A．30～100 B．30～200 C．30～300 D．30～600
14．在105稀释度下，平板上生长的平均菌落数为50则每克样品中的菌落数是………( )
A．5×107 B．50 C．5×108 D．50×3
15．设置对照的主要目的是排除实验组中什么因素对实验结果的影响……………( )
A．测试因素 B．非测试因素 C．全部因素 D．部分因素
16．细菌适宜在接近何种酸碱度的潮湿土壤中生长………………………………( )
A．酸性 B．碱性 C．中性 D．强碱性
17．土壤取样时应选取什么样的土…………………………………( )
A．表层土 B．距地表约3～8 cm的土壤层
C．距地表约10～20 cm的土壤层 D．距地表20 cm以下的土壤层
18．下列属于菌落特征的是…………………………………………( )
①菌落的形状 ②菌落的大小 ③菌落的多少 ④隆起程度 ⑤颜色 ⑥有无荚膜
A．①②③④ B．①②④⑤ C．②③④⑥ D．①②③④⑤⑥
19．进行系列稀释时，按什么顺序进行………………………………( )
A．稀释度递增 B．稀释度递减 C．不论稀释度大小 D．A、B两项均可
20．能排除培养基是否有杂菌污染的方法是…………………………………( )
A．将未接种的培养基放在实验桌上培养 B．将未接种的培养基放在窗台上培养
c．将未接种的培养基放在恒温箱中培养 D．将已接种的培养基放在恒温箱中培养
21．纤维素酶的组成元素有……………………………………………( )
A．C、H、O B．C、H等 C．C、H、O、P D．C、H、O、N等
22．水溶性的羧甲基纤维素钠是一种…………………………………( )
A．无机盐 B．商品纤维素 C．天然纤维素 D．微晶纤维素
23．刚果红与纤维素结合后可形成什么颜色复合物…………………………………( )
A．红色 B．紫色 C．蓝色 D．黑色
24．下列环境中，纤维素分解菌含量最高的是……………………………………( )
A．热带雨林中土壤 B．寒带森林中士壤 C．花盆中 D．荒漠地区
25．筛选出纤维素分解菌后还需要用什么实验来确定………………………………( )
A．发酵产纤维素酶 B．发酵产纤维素
c．纤维素酶分解滤纸 D．纤维素分解产生葡萄糖
二、非选择题(共50分)
26．(12分)培养基的营养构成中一般含有 、 、 、和无机盐，此外，培养基还需要满足微生物生长对 、 营养物质以及 的要求。
27．(13分)无菌技术主要通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。实验室中常用的消毒方法有
消毒法和 消毒法，此外，实验室里还用 或 进行消毒。常用的灭菌方法有 灭菌、 灭菌和 灭菌。
28．(9分)根据倒平板操作思考下列问题：
(1)培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时。才能用来倒平板，你用什么办法来估计培养基的温度?
(2)为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰?
(3)在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗?为什么?
29．(8分)分析下面培养基的配方，回答问题。
纤维素分解菌的选择培养基
纤维素粉 　　　　　5 g
NaN03 　　　　 1 g
Na2HP04·7H20　　　 1.2 g
KH２P04　　　　　　　 0.9 g
MgS04·7H20　　　　 0.5 g
KCl 　　　　　　　　0.5 g
酵母膏　　　　　　　0.5 g
水解酪素 0.5 g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000 mL。
(1)此培养基配方中为微生物提供碳源和氮源的分别是 、 。
(2)此配方为 培养基。(根据物理状态)
(3)此培养基选择出的微生物主要是 。
30．(8分)简单叙述制备土壤稀释液的步骤。
◇◇探究偿试
1．探究基因运载体——质粒上的标记基因
根据下面实验原理和材料用具，设计实验选择运载体——质粒，探究质粒的抗菌素基因类别。
实验原理：作为运载体的质粒，须有标记基因，抗菌素抗性基因就属标记基因。故有抗菌素抗性的细菌，其质粒可作运载体。’
材料用具：青霉素、四环素的10万单位溶液、菌种试管、灭菌的含细菌培养基的培养皿、酒精灯、接种环、一次性注射器、蒸馏水、恒温箱。
方法步骤：
第一步：取三个含细菌培养基的培养皿并标1、2、3号，在酒精灯旁，用三支注射器，分别注入1 mL蒸馏水、青霉素、四环素液，并使之分布在整个培养基表面。
第二步：将接种环 ，并在酒精灯火焰旁取种，然后对三个培养皿分别接种。
第三步：培养：将接种后的三个培养皿放人37℃的恒温箱中培养24 h。
预期结果分析：
(1)设置1号的目的是 ，出现的现象是 。
(2)若仅2号生存，则说明 。
(3)若2号不存活，3号存活．则说明 。
(4)若2号、3号都存活，则说明 。
解析：该实验设计了两个实验组(加青霉素和加四环素的培养基)，一个对照组(加蒸馏水的培养基)，遵循了实验设计的单一变量原则和对照原则。对实验结果的预期应分三种情况预测：一是仅2号存活，说明细菌质粒中只有抗青霉素的基因，没有抗四环素的基因；二是2号不存活，3号存活。说明细菌质粒中有抗四环素的基因，没有抗青霉素的基因；三是若2号、3号都存活，说明细菌质粒中，两种抗性基因都有。
2．探究影响细菌生长繁殖的因素
某同学的研究性学习课题是“探究影响细菌生长繁殖的因素”。他在培养细菌的过程中，发现了某种细菌(记作R)的周围其他细菌的生长繁殖受到抑制。他把R细菌接种到专门的培养基上进行培养，一段时间后，他除去 R细菌，用该培养基再培养其他细菌，结果其他细菌仍然不能在这个培养基上生长和繁殖。
根据以上材料回答下列问题：
(1)从生态学的角度分析，R细菌与其周围细菌之间的关系，叫做 。
(2)于是，该同学假设了以下“造成R细菌周围的其他细菌不能生长和繁殖”的最可能原因（ ）
A．R细菌占据了其他细菌的生存空间 B．R细菌吞噬了其他细菌
C．R细菌产生了不利于其他细菌生存的物质 D．R细菌更容易吸收培养基中的物质
(3)参照上述题目中给出的有关材料，设计你对第(2)题所作选择的验证实验：
①方法步骤：
②结果结论：
3．探究如何从土壤中分离自生固氮菌与计数
实验原理：农田的表层土壤中，自生固氮菌的含量比较多。将用表土制成的稀泥浆，接种到无氮培养基上进行培养。在这种情况下，只有自生固氮菌才能生长繁殖。用这种方法，可以将自生固氮菌与其他细菌分离开来。
材料用具：农田的表层土壤、无氮培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、盛9 mL无菌水的试管、无菌吸管、无菌涂布器、无菌培养皿、盛90 mL无菌水的锥形瓶、恒温箱。
方法步骤：
(1)倒平板
分别将无氮培养基、牛肉膏蛋白胨培养基倒平板，应在 操作。
(2)制备土壤稀释液
取土样10 g加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。用无菌吸管吸取上清液1 mL，转至9 mL的无菌水的大试管中，依次稀释到107稀释度。
(3)涂布
按照由107～103稀释度的顺序分别吸取0．1 mL进行平板涂布，每个稀释度下，无氮培养基应至少涂布 个平板，牛肉膏蛋白胨培养基涂布 个。
(4)培养
放入恒温箱内，在28～30℃下培养3～4 d。
(5)细菌的计数
当菌落数目稳定时，选取菌落数在 的平板进行计数。如果测试的平均值为50，则每克样品中的菌落数是 。(稀释度是105)
预期结果：
相同稀释度下，牛肉膏蛋白胨平板上的菌落数 (填“多于”或“少于”)无氮培养基上的数目。并说明原因。
探究偿试答案：
1、第二步：在酒精灯火焰上灼烧
第三步：(1)对照作用 细菌正常生长 (2)质粒上有抗青霉素基因，没有抗四环素基因 (3)质粒上有抗四环素基因，没有抗青霉素基因 (4)质粒上有抗四环素基因和抗青霉素基因
试题立意：本题既考查了学生实验设计能力，又考查了学生预期实验结果多层次思维能力。属于分析综合能力的考查。
2、(1)竞争 (2)C
(3)①方法步骤：
第一步：取两个培养皿，按相同的营养成分配制成甲、乙两个培养基。
第二步：在甲培养基上接种R细菌，培养一段时间后，除去R细菌；乙培养基上不接种R细菌，作为对照。
第三步：在这两个培养基上分别接种相同的其他细菌。第四步：在相同条件下(温度等)，让甲、乙两培养基上的细菌生长繁殖。
②结果结论：
甲培养基上的细菌生长受限制，不能繁殖；乙培养基上的细菌能正常生长繁殖。可见，R细菌产生了不利于其他细菌生长、繁殖的物质。
3、步骤：(1)火焰旁 (3)3 1 (5)30～300 5×107
预期结果：多于无氮培养基上能生存繁殖的仅是土壤中的固氮菌，而牛肉膏蛋白胨培养基上几乎允许土壤中所有菌类生存。?
单元提升参考答案
一、1．D 2．C 3．B 4．C 5．B 6．D 7．D 8．B 9．C 10．A 11．B 12．C 13．C 14．A 15．B 16．C 17．B 18．B 19．A 20．C 21．D 22．B 23．A 24．A 25．A
二、26．水 碳源 氮源 Ph 特殊 氧气
27．煮沸 巴氏 紫外线 化学药物 灼烧 干热 高压蒸气
28．(1)用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。(2)灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。(3)不能用。空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
29．(1)纤维素粉 NaNO3 (2)液体 (3)纤维素分解菌
30．步骤如下：(1)土壤取样；(2)称量土壤；(3)制备土壤溶液；(4)梯度稀释。