1.2 基因工程的基本操作程序
文档属性
| 名称 | 1.2 基因工程的基本操作程序 |  | |
| 格式 | rar | ||
| 文件大小 | 2.4MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 人教版（新课程标准） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2009-03-14 10:14:00 | ||
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文档简介
课件36张PPT。选修3 现代生物科技专题专题1 基因工程DNA重组技术的基本工具
基因工程的基本操作程序
基因工程应用
蛋白质工程的崛起1.2 基因工程的基本操作程序第一步:目的基因的获取 目的基因主要指编码蛋白质的结构基因.目的基因的获取1.从基因文库中获取目的基因基因文库的构建目的基因的获取2.利用PCR技术扩增目的基因 PCR技术的名称叫什么?其原理是什么?其做法包括几步?需要什么条件?3.化学方法人工合成(DNA合成仪)第二步:基因表达载体的构建 构建基因表达载体的目的是什么?基因表达载体的组成包括哪几部分?各有什么作用?第三步:将目的基因导入受体细胞1.将目的基因导入植物细胞
农杆菌转化法（Ti质粒）(双子叶、裸子植物常用）基因枪法(单子叶植物常用)花粉管通道法2.将目的基因导入动物细胞显微注射技术3.将目的基因导入微生物细胞 原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，故早期常作为受体细胞。重组表达载体DNA溶于缓冲液转入第四步：目的基因的检测与鉴定1.检测是否插入了目的基因
(原理:DNA分子杂交技术)
2.检测目的基因是否转录出了mRNA
(原理:DNA-RNA杂交技术)
3.检测目的基因是否翻译成蛋白质
(原理:抗原-抗体杂交技术)
4.个体生物学水平的鉴定 DNA杂交直接鉴定32P标记的DNA分子探针
杂交
放射自显影法 如何从基因文库中获取目的基因实验设计: 请设计一个实验鉴定某一转入抗虫基因的棉花是否具有抗虫性。思考与探究
P151.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？
2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，从理论上说，你应该如何做？思考与探究
P153.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？
4.β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？
1.答：不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：
（1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；
（2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；
（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；
（4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；
（5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。 2.农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中。研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。
利用农杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化时，是需要加上述酚类物质的。
如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点：①要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；②要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。
3. 提示：有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。
4. 提示：基本操作如下：
（1）从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。
（2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。
（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明β-珠蛋白基因已进入其中。
（4）培养进入了β-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取β-珠蛋白。 细胞内总DNA的提取分离与基因组文库的构建 细胞内总DNA的提取分离程序苯酚沉淀蛋白质 紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度 基因组DNA文库的构建
将总DNA经过酶解，经蔗糖梯度离心或琼脂糖凝胶电泳分离不同长短的DNA片段。包含的基因组片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，转染细菌或体外包装到噬菌体颗粒上便构成了该生物的基因组文库。cDNA文库的构建mRNA
反转录
cDNA
(互补DNA）
第二条DNA链 反转录人工合成互补DNA, cDNA构建基因文库获取目的基因存在的问题——
费时费事
内含子序列反转录人工合成互补 DNA方法的优势——
获取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因 聚合酶链式反应（PCR）PCR技术是聚合酶链式反应的缩写。是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。加入4种物质：
（1）作为模板的DNA序列；
（2） DNA引物（20个左右碱基的短DNA单链，与被分离的目的基因两条链各自5’端序列相互补）；
（3）TaqDNA聚合酶；
（4）dNTP（dATP, dTTP, dGTP和dCTP）。
（5）能量ATP 聚合酶链式反应（PCR）变性、退火、延伸三步曲高温变性：双链DNA解链成为单链DNA
低温退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对成双链
适温延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链 聚合酶链式反应（PCR）每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍30轮循环可获得—— 230（1.07×109)个基因片段PCR(多聚酶链式反应) 基因的结构
基因工程的基本操作程序
基因工程应用
蛋白质工程的崛起1.2 基因工程的基本操作程序第一步:目的基因的获取 目的基因主要指编码蛋白质的结构基因.目的基因的获取1.从基因文库中获取目的基因基因文库的构建目的基因的获取2.利用PCR技术扩增目的基因 PCR技术的名称叫什么?其原理是什么?其做法包括几步?需要什么条件?3.化学方法人工合成(DNA合成仪)第二步:基因表达载体的构建 构建基因表达载体的目的是什么?基因表达载体的组成包括哪几部分?各有什么作用?第三步:将目的基因导入受体细胞1.将目的基因导入植物细胞
农杆菌转化法（Ti质粒）(双子叶、裸子植物常用）基因枪法(单子叶植物常用)花粉管通道法2.将目的基因导入动物细胞显微注射技术3.将目的基因导入微生物细胞 原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，故早期常作为受体细胞。重组表达载体DNA溶于缓冲液转入第四步：目的基因的检测与鉴定1.检测是否插入了目的基因
(原理:DNA分子杂交技术)
2.检测目的基因是否转录出了mRNA
(原理:DNA-RNA杂交技术)
3.检测目的基因是否翻译成蛋白质
(原理:抗原-抗体杂交技术)
4.个体生物学水平的鉴定 DNA杂交直接鉴定32P标记的DNA分子探针
杂交
放射自显影法 如何从基因文库中获取目的基因实验设计: 请设计一个实验鉴定某一转入抗虫基因的棉花是否具有抗虫性。思考与探究
P151.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？
2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，从理论上说，你应该如何做？思考与探究
P153.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？
4.β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？
1.答：不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：
（1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；
（2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；
（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；
（4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；
（5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。 2.农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中。研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。
利用农杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化时，是需要加上述酚类物质的。
如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点：①要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；②要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。
3. 提示：有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。
4. 提示：基本操作如下：
（1）从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。
（2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。
（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明β-珠蛋白基因已进入其中。
（4）培养进入了β-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取β-珠蛋白。 细胞内总DNA的提取分离与基因组文库的构建 细胞内总DNA的提取分离程序苯酚沉淀蛋白质 紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度 基因组DNA文库的构建
将总DNA经过酶解，经蔗糖梯度离心或琼脂糖凝胶电泳分离不同长短的DNA片段。包含的基因组片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，转染细菌或体外包装到噬菌体颗粒上便构成了该生物的基因组文库。cDNA文库的构建mRNA
反转录
cDNA
(互补DNA）
第二条DNA链 反转录人工合成互补DNA, cDNA构建基因文库获取目的基因存在的问题——
费时费事
内含子序列反转录人工合成互补 DNA方法的优势——
获取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因 聚合酶链式反应（PCR）PCR技术是聚合酶链式反应的缩写。是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。加入4种物质：
（1）作为模板的DNA序列；
（2） DNA引物（20个左右碱基的短DNA单链，与被分离的目的基因两条链各自5’端序列相互补）；
（3）TaqDNA聚合酶；
（4）dNTP（dATP, dTTP, dGTP和dCTP）。
（5）能量ATP 聚合酶链式反应（PCR）变性、退火、延伸三步曲高温变性：双链DNA解链成为单链DNA
低温退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对成双链
适温延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链 聚合酶链式反应（PCR）每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍30轮循环可获得—— 230（1.07×109)个基因片段PCR(多聚酶链式反应) 基因的结构