普通高中课程标准实验教科书—生物选修3 [人教版]
2.2 动物细胞工程
★新课标要求
1．简述动物细胞培养的过程、条件及应用。
2．简述通过动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和应用前景。
3．举例说出动物细胞融合与单克隆抗体的原理和应用。
★教学重点
（1）动物细胞培养的过程及条件。
（2）用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程。
（3）单克隆抗体的制备和应用。
★教学难点
（1） 用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程。
（2） 单克隆抗体的制备过程。
★教学方法
诱思法、分析法、归纳法。
★教学工具
多媒体教学课件
★课时安排
2课时
★教学过程
第1课时
2.2.1动物细胞培养和核移植技术
（一）引入新课
利用植物细胞可以培育成植物体，那么，你利用动物细胞能不能大量繁殖动物体，以提高繁殖率呢？这节课我们来学习动物细胞工程
（二）进行新课
[问题]动物细胞工程的常用技术手段有哪些？最基础的技术手段是什么？
动物细胞培养、动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体等。最基础的技术手段是动物细胞培养。
1．动物细胞培养
1.1概念：从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。
[分析]（1）需分散成单个细胞；（2）需要在培养基上培养；（3）动物细胞培养的实质是细胞增殖。
1.2动物细胞培养的过程：（学生自学总结）
[问题]什么是细胞贴壁？什么是接触抑制？
悬液中分散的细胞很快就贴附在有丝分裂，称为细胞贴壁。当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。
[问题]如何打破接触抑制？
需要重新用胰蛋白酶等处理，然后分别继续培养，让细胞继续增殖。
[问题]细胞传代培养代数有什么特点？
传代培养的细胞一般传至10代后就不易传下去了，一般来说，细胞在传至10～50代左右时，增殖会逐渐缓慢，以至于完全停止，这时部分细胞的细胞核型可能发生变化，当继续传代培养时，少部分细胞会克服细胞寿命的自然极限，获得不死性。所以目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常为10代以内，以保持细胞正常的二倍体核型。
1.3动物细胞培养的条件
（1）无菌、无毒的环境
（2）营养：合成培养基成分包括糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，通常还需加入血清、血浆等一些天然成分。
（3）温度和pH：适宜温度一般与动物的体温相近；pH为7.2～7.4。
（4）气体环境：95％空气和5％CO2混合气体。
[问题]如何保证无菌、无毒环境？
（1）对培养液和所有培养用具进行无菌处理；（2）通常还需要在细胞培养液中添加一定量的抗生素；（3）应定期更换培养液，以便清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害。
1.4动物细胞培养技术的应用
（1）可大规模生产一些有重要价值的生物制品。
（2）培养的动物细胞可作为基因工程中常用的受体细胞。
（3）培养的动物细胞可用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性（根据变异率）。
（4）培养正常或病变细胞，用于生理、病理、药理等方面的研究。
[填表比较]
植物组织培养和动物细胞培养的比较
植物组织培养
动物细胞培养
原理
细胞全能性
细胞增殖
培养基性质
固体培养基
液体培养基
培养基特有成分
蔗糖、植物激素
葡萄糖、动物血清
培养结果
植物体
细胞株、细胞系
培养目的
快速繁殖、培育无病毒植株等
获得细胞或细胞产物
2．动物体细胞核移植技术和克隆动物
[问题]为什么不能直接利用动物细胞培育动物体？
动物细胞的全能性会随着动物细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜能逐渐变弱。因此，需要借助核移植来实现。
2.1概念：是将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体。
[分析]（1）移植的是动物细胞的细胞核；（2）利用去核卵母细胞作为受体细胞；（3）重组细胞需培育成一个新的胚胎。
2.1体细胞核移植的过程：
课件显示过程，讲解。
[讲解]（1）卵母细胞的采集：从屠宰场收集牛卵巢，在体外培养到减数第二次分裂中期。
（2）供体细胞的采集：从供体取体细胞进行培养。
（3）供体的细胞核移入去核卵母细胞中，其实质是将去核卵母细胞与供体细胞进行细胞融合，一般采用电激法使细胞融合，所以子代的细胞质基因来自于两个亲本。
（4）供体核进入受体卵母细胞后，还需要物质或化学方法激活受体细胞，使其完成减数分裂，因为所选用的受体细胞是处于减数第二次分裂中期的卵母细胞，减数分裂还没有进行完。
（5）重组细胞在体外发育成重组胚胎，将早期胚胎移植到受体母牛体内。
（6）代孕母牛生出克隆牛。
[问题]受体细胞为什么选用卵母细胞？
因为卵母细胞体积大，易操作，而且含有促使细胞核表达全能性的某种物质和营养物质。
[思考]教材49页《讨论》。
2. 3体细胞核移植技术的应用前景
[问题]细胞胞核移植技术的意义是什么？
①可以快速繁殖动物；②属于无性繁殖，可保持优良性状。
[讲解]体细胞核移植的应用有以下几个方面：
（1）畜牧业生产中，可加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育。
（2）保护濒危物种
（3）转基因克隆动物可以作为生物反应器
（4）治疗人类疾病
（5）组织器官移植（人的核移植胚胎干细胞）
（6）研究克隆动物和克隆细胞
（7）用克隆动物做疾病模型
2.4体细胞核移植技术存在的问题
（1）体细胞核移植技术的成功率非常低
（2）克隆动物存在着健康问题，许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷等
（三）课堂总结
第2课时
2.2.2 动物细胞融合与单克隆抗体
（一）引入新课
复习动物细胞工程的技术手段，根据2.2.1所学内容提出另两项重要技术手段：动物细胞融合和单克隆抗体。
（二）进行新课
1．动物细胞融合
[自学并思考]植物体细胞杂交和动物细胞融合的区别（学生填下表）
植物体细胞杂交
动物细胞融合
细胞融合原理
细胞膜的流动性
细胞膜的流动性
融合过程
先除去细胞壁
先使细胞分散开
诱导方法
电激、振动、离心、聚乙二醇
电激、灭活的病毒、聚乙二醇
结果
杂种植株
杂交细胞
应用
培育植物新品种
主要用于制备单克隆抗体
意义
突破远缘杂交不亲和的障碍，打破了生殖隔离。
相同点
原生质体融合原理相同；原生质体融合的方法相似
[提问]两者的主要区别是什么？
（1）动物细胞融合不需要去除细胞壁；
（2）动物细胞融合常使用灭活的病毒，而植物细胞融合不用；
（3）植物杂交细胞可以培养成杂种植株，而动物杂交细胞则不可。
[思考]为什么可以使用灭活的病毒促进动物细胞融合？
灭活的病毒可以使细胞膜上的蛋白质分子和脂质重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。两个不同的动物细胞放在一起，用灭活的病毒处理细胞后，它们就先质融合，再核融合，进而形成杂交细胞，这个细胞有丝分裂后仍能形成两个完整的杂交细胞。
[过渡]动物细胞融合技术已经成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段，特别是利用细胞融合技术而发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。
2．单克隆抗体
2.1单克隆抗体制备的原理
[问题]常规抗体制备的方法及特点？
传统的抗体生产方法是向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需要的抗体。这种生产抗体的方法产量和纯度都很低，而且制备的抗体特异性差。
[问题]填写课件内容：
◆ 利用B淋巴细胞产生特异性抗体的功能。
◆ 利用骨髓瘤细胞无限增殖的特性。
◆ 利用动物细胞融合技术将两种细胞融合获得杂交瘤细胞。
◆ 利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞。
2.2单克隆抗体制备的过程
[讲解]单克隆抗体制备的过程
[问题]如何获得B淋巴细胞和骨髓瘤细胞？
要得到能产生所需抗体的B淋巴细胞，必须对小鼠进行免疫处理，即给小鼠皮下或脾内注射特定的抗原，为保证B淋巴细胞的数量和质量，往往需要进行初次免疫、二次免疫和加强免疫，然后取免疫小鼠的脾获得B淋巴细胞。
骨髓瘤细胞应与免疫小鼠属于同一品系，这样杂交融合率高，并且应选择处于对数生长期、活性强的细胞。
[问题] 选择杂交瘤细胞的两步筛选的目的各是什么？
第一步筛选的目的是获得杂交瘤细胞。原因是B淋巴细胞与骨髓瘤细胞混合后用聚乙二醇处理诱导融合，这样处理后的细胞中有以下五种：未融合的B淋巴细胞、未融合的骨髓瘤细胞、B淋巴细胞与B淋巴细胞的融合细胞、骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞、B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合的细胞，其中只有B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞才是我们需要的杂种细胞。筛选的方法是在特定的选择性培养基（HAT选择培养基）中培养，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而融合的杂种细胞具有上述两种酶故可以生长，由此可筛选出杂交瘤细胞。
第二步筛选的目的是获得能产生所需单一抗体的杂交瘤细胞。因为小鼠体内的B淋巴细胞有很多种，因此获得的杂交瘤细胞可能产生不同的抗体，需要从中筛选出能产生我们所需的单一抗体的杂交瘤细胞，筛选的方法是专一抗体检验。
[问题]如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？
融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞，但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用“有限稀释法”来选择。将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔不超过一个细胞，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，那么上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。
2.3单克隆抗体的应用
学生自学，归纳单克隆抗体的应用。
（1）可用于作为诊断试剂：有准确，高效，快速的优点
（2）可用于疾病治疗
（3）可用于运载药物（作为运载对应疾病的药物的“生物导弹”）
[问题]生物导弹的组成及优点
组成：“生物导弹”＝单克隆抗体＋药物＋放射性同位素
优点：疗效高、毒副作用小。
（三）课堂总结
★资料袋
神奇的人造皮肤
医生从冰箱里取出人造皮肤，将它贴在病人受损的皮肤上，就能成功治愈溃疡、烧伤等疾病，这不是科幻大片里的场景，而是事实。
“人造皮肤临床治疗非常简单，只需要在患处贴上人造皮肤就行了。”国家863计划“组织器官工程重大专项·组织工程皮肤”首席科学家、解放军第四军医大学组织工程研发中心主任金岩教授介绍说，人造皮肤的正式名称是组织工程皮肤，在工厂制成并包装好，放在普通冰箱里保存(最长可以保存一个半月)，在需要时再取出来直接贴在病人患处就行。
人造皮肤的生产原料主要来自手术切除后以及其他废弃的健康人体皮肤组织。它不仅具有正常人类皮肤的功能，而且具有良好的修复作用。河北一位年轻患者患糖尿病引发足部深度溃疡，因无法医治而要“锯脚”时，在医院贴上一块人造皮肤后，10天后伤口开始愈合，50天就痊愈。据介绍，目前人造皮肤已经在临床试验中取得成功，北京304医院等4家医院对160例皮肤移植、皮肤溃疡，以及由糖尿病和肿瘤导致的深度皮肤溃疡病例进行了临床治疗，全部取得成功。经过对患者至少半年时间的跟踪调查表明，没有发现术后复发、免疫排斥等现象。
目前我国有350多万名各类患者需要移植皮肤，但以往多数是采用自身皮肤移植，这种方法不仅造成新的创伤和疤痕，而且皮肤来源有限。而采用人造皮肤则不必担心：一块只有米粒大小的皮肤组织，经过培育可以生产出一个足球场大小的人造皮肤。
胚胎干细胞
干细胞就是在生命的成长和发育中起“主干”作用的细胞，主要包括三大类，分别是全能干细胞、多能干细胞和专能干细胞。其中最有价值的是全能干细胞。它具有形成完整个体的分化潜能，可以无限增殖并分化成为全身200多种细胞类型，从而可以进一步形成人体的任何组织器官，最终发育成一个完整的人。胚胎干细胞就属于此类，并被称为“万能细胞”，它的应用研究已被列为国际自然科学六大研究热点之一，而且由于在医学和生物学上具有巨大的潜力，而备受各国的高度重视.用人类细胞克隆胚胎的技术在英国是合法的，但美国正在考虑禁止它。联合国最近推迟了就关于何种克隆技术可以被允许的国际公约的表决。
课件11张PPT。 选修3《现代生物科技专题》 动物细胞工程概念过程原理动物细胞培养分散、培养基、细胞增殖细胞增殖条件应用植物组织培养和动物细胞培养的比较概念过程原理动物体细胞核移植细胞核、去核卵母细胞、动物个体应用细胞核的全能性胚胎
移植动物组织块细胞悬液原代培养传代培养胰蛋白酶处理幼龄动物的器官组织；动物胚胎动物细胞培养植物细胞杂交与动物细胞杂交的比较制备单克隆抗体1、常规抗体获得的方法及其特点
2、单克隆抗体制备的原理◆ 利用 产生特异性抗体的功能。
◆ 利用 无限增殖的特性。
◆ 利用 技术将两种细胞融合获得
杂交瘤细胞。
◆ 利用 技术大量培养杂交瘤细胞。B淋巴细胞骨髓瘤细胞动物细胞融合动物细胞培养3、单克隆抗体的制备
4、单克隆抗体的应用骨髓瘤细胞免疫小鼠（选择培养基）（抗体检测）
