生物三轮体系实验复习：dna的粗提取与鉴定

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实验十七　DNA的粗提取与鉴定　　选修1
一、实验原理
1．血细胞在蒸馏水中易吸水而导致细胞膜和细胞核膜的破裂。利用此特性可得到含有核DNA的溶液。
2．DNA在NaCL溶液中的溶解浓度随NaCL溶液的浓度不同而变化。当NaCL的质量浓度为0．14moL／L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCL溶液中的DNA析出。
3．DNA不溶于酒精溶液，可是细胞中的多数物质可溶于酒精溶液，因而可进、步提取含杂质较少的DNA。
4．DNA遇二苯胺（沸水浴）被染成蓝色，所以二苯胺可用作鉴定DNA存在的试剂。
二、方法步骤
提取细胞核物质→溶解核内的DNA→析出DNA黏稠物→滤取DNA黏稠物→DNA黏稠物再溶解→过滤含DNA的氯化钠溶液→提取含杂质较少的DNA→DNA的鉴定。
三、要点点拨
1．血细胞液加蒸馏水以后，必须充分搅拌，不应少于5min，否则血细胞核不会充分破碎，释放出的DNA就会减少。过滤时采用单层纱布。
2．当NaCL溶液加入到血细胞液中之后，必须充分晃动烧杯，使二者混合均匀。这样可以加速核蛋白解聚，游离出DNA，并使DNA充分溶解于浓NaCL溶液中；
3．“析出DNA”的步骤中，必须充分加水，才能稀释NaCL溶液，使DNA溶解度变小，蛋白质溶解度增大，二者分离。同时，应用玻璃樟不停地缓缓搅动，使DNA聚集（玻璃有吸附DNA的作用）。如果在此步骤中，再增加离心或过滤（多层纱布过滤），则可得较粘稠的丝状物（含DNA）
4．在“析出的DNA再溶解”的步骤中，加入浓NaCI溶液之后，必须充分搅拌，使DNA充分溶解。
5．用冷酒精浓缩和沉淀DNA时，所用的95％酒精必须经过充分预冷后才能使用。二者的体积比为1：2，即将1份含DNA的NaCI溶液加入到2份的冷酒精中。卷起DNA丝状物的方法是，缓缓旋转玻璃棒。如果用冷酒精处理后，悬浮于溶液中的丝状物较少，可将混合液放人冰箱中再冷却几分钟，然后再用玻璃棒卷起丝状物。
6．提取鸡血中的DNA时，为什么要除去血液中的上清液？
〖解答〗因为上清液是血浆，不含血细胞，而沉于试管底部的鸡血细胞的细胞核中才有DNA，所以提取鸡血细胞中的DNA时，要除去血液中的上清液。
7．步骤1和步骤3中都需要加入蒸馏水，两次加入的作用相同吗？为什么？
〖解答〗不同。步骤1中加入蒸馏水是为了得到浓度低于血细胞内部浓度的溶液。这样水分子会大量渗入血细胞中使血细胞胀破而得到DNA。步骤3中加入蒸馏水是为了使氯化钠的物质的量浓度达到DNA溶解度最低点0．14moL／L这时，DNA分子就可以从氯化钠溶液中析出。
8．DNA的直径约为2nm，实验中出现的丝状物的粗细是否表示一个DNA分子直径的大小？
〖解答〗实验中出现的丝状物是肉眼可以观察到的，这种丝状物的直径要比DNA分子的直径2nm大许多倍，所以实验中出现的丝状物的粗细并不表示一个DNA分子直径的大小。
9．实验中有3次过滤作用及使用的纱布层数有何区别？
〖解答〗步骤1中的过滤是为了过滤鸡血细胞液得到含DNA的滤液，使用的纱布为1～2层。
步骤4中的过滤是为了得到从低浓度的氯化钠溶液中析出的附在纱布上的含DNA的黏稠物，所以所用的纱布为多层。
第三次过滤在步骤6中，目的是得到再溶解后的DNA滤液，所以只要用两层纱布即可。
10．实验中有6次搅拌，搅拌时应注意些什么？
〖解答〗除最后一次搅拌外，前5次搅拌均要朝向一个方向，并且在析出DNA、DNA再溶解和提取中各步搅拌都要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，防止DNA断裂。
11．实验中两次使用蒸馏水的目的分别是什么？
〖解答〗第一次使用蒸馏水是在第一步，加水是为了使血细胞吸水膨胀破裂，加水后必须充分搅拌，不应少于5min，使血细胞充分破裂；第二次加蒸馏水是在第三步，加水是为了稀释NaC|溶液，使DNA从NaCI溶液中析出。
12．实验中有3次加NaCL溶液，目的分别是什么？
〖解答〗在步骤2中，当加入NaCI后，必须充分晃动烧杯，使两者混合均匀，加速染色质中DNA与蛋白质分离，使DNA充分游离并溶解在NaCI溶液中。在步骤5中，NaCL溶液是为了DNA的再溶解，不过这时溶液中蛋白质含量已很少。在步骤8中，加的NaCI溶液的浓度比前2次低得多，但还是为溶解DNA。
13．影响实验效果的因素有哪些？
〖解答〗（1）提取该物质时，搅拌充分与否，会影响细胞破裂程度进而影响到提取的DNA的量。
（2）沉淀DNA时，必须用冷酒精，在冰箱内15℃以下至少存放24小时。
（3）用玻璃棒搅拌时，玻璃棒不要直接插入烧杯底部，搅拌要轻缓，以便获得完整的DNA分子。
14．盛放鸡血细胞液的容器和实验中的烧杯和试管最好也是塑料制的原因是什么？
〖解答〗盛放鸡血细胞液的容器最好是塑料容器的原因是：鸡血细胞破碎后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，用塑料容器可减少提取过程中DNA的损失。
四、注意事项
1．制备鸡血细胞液时，要在去新鲜鸡血的同时加入抗凝剂，使血液分层，取下层血细胞沉淀。另外，此实验的材料不能用哺乳动物（如人、狗）的血替代。
2．获取较多DNA的关键是向鸡血细胞液加入足量的蒸馏水，以便使细胞膜和核膜破裂，核内物质释放出来。
3．特别要注意实验中的3次过滤：第一次过滤的目的是为了除去血细胞破裂后残余的膜碎片以及细胞器碎片，第二次过滤（加水稀释NaCL）是为了初步将DNA与溶解在NaCL溶液中的蛋白质等有机物以及其他杂质分离，第三次过滤 （用酒精）是为了进一不除去蛋白质等有机物，从而得到较纯净的DNA. 第一、三次过滤要用滤液，使用的纱布为1～2层；第二次过滤要用滤出的粘稠物，使用的纱布是多层。
4．实验中有6次搅拌，除最后一次搅拌外，前5次搅拌均要朝向一个方向，并且在析出DNA,DNA再溶解和提取中，各步搅拌都要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，防止DNA分子断裂。
5．特别注意实验中有两次使用蒸馏水：一次在第1步，加水是为了使血细胞洗水膨胀破裂，加水后必须充分的搅拌，不应少于5min，使血细胞充分破裂；第二次加蒸馏水是在第3步，加水是为了喜事氯化钠溶液。
6．实验中有三次加氯化钠溶液。在步骤2中，当加入氯化钠后，必须充分晃动烧杯，使二者混合均匀，加速染色质中DNA与蛋白质分离，使DNA充分游离并溶解在氯化钠溶液中。在步骤5中，加氯化钠溶液也是为了DNA的再度溶解，不过这时溶液中蛋白质含量已很少。在步骤8中，加的氯化钠溶液的浓度比前2次低的多，但还是为溶解DNA。
7．在步骤7中，必须使用冷的酒精。
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