生物：2.1《微生物的实验室培养》学案（1）（新人教版选修1）

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课题1微生物的实验室培养
【课程目标】
了解培养基的基础知识，进行微生物培养和无菌技术的操作。
【课题重点】
无菌技术的操作
【课题难点】
无菌技术的操作
基础知识
一、培养基
1．概念：人们按照微生物对 的不同需求，配制出供其 的营养基质叫培养基。可分为 培养基和 培养基。
2．营养构成：各种培养基一般都含有 、 、 和 ，此外还要满足微生物生长对 、 以及 的要求。
3．培养乳酸杆菌时需在培养基中添加 、培养霉菌时需将培养基PH调至 、培养细菌时需将PH调至 、培养厌氧微生物则需提供 条件。
〖思考1〗从细胞的化学元素组成来看，培养基中为什么都含有这些营养成分？
【补充1】碳源：如CO2、糖类、脂肪酸等有机物，构成微生物的结构物质和分泌物，并提供能量。
氮源：如N2、氨盐、硝酸盐、牛肉膏、蛋白胨等，主要用来合成蛋白质、核酸及含氮代谢物等。含有C、H、O、N的化合物既可以作为碳源，又可以作为氮源，如氨基酸等。
二、无菌技术：阅读“无菌技术”，讨论回答下列问题：
(一)获得纯净培养物的关键是 ，具体操作如下：
1．对实验操作的 、操作者的 和 进行 。
2．将用于微生物培养的 、 和 等器具进行 。
3．为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在 附近进行。
4．实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与 相接触。
(二)消毒和灭菌
1．消毒是指 。常用的方法有 、 、 消毒法。
2．灭菌是指 。常用的方法有： 、 、 灭菌。分别适用于那些用具？
〖思考2〗无菌技术除了防止培养物被污染外，还具有的目的是什么？
〖思考3〗利用干热灭菌箱对玻璃器皿灭菌时物品不能摆得太挤，目的是什么？
〖思考4〗物品装入高压蒸汽灭菌锅灭菌后，要首先打开排气阀，煮沸并排除锅内冷空气，其目的是 ；随后关闭排气阀继续加热，气压升至 ，温度为 ，并维持 min；最后切断热源，使温度自然降温，气压务必降至 时打开锅盖，其目的是防止
实验操作----大肠杆菌的纯化培养：
本实验所用的培养基是 ，本实验可分成 和
两个阶段进行。
一制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
1制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的操作步骤是：
、 、 、 、 。
〖思考5〗在制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的称量操作中，动作要迅速，原因是什么？
溶化操作中需要不断用玻璃棒搅拌的目的是什么？
〖思考6〗牛肉膏和蛋白胨主要为微生物提供什么等营养物质？
2． 倒平板：待培养基冷却至 ℃左右时在酒精灯火焰附近操作进行。
其过程是：
①在火焰旁右手拿 ，左手 ；
②使锥形瓶的瓶口 ；
③左手将培养皿 ，右手 ，立刻盖上皿盖。
④待平板冷却凝固后，将平板 。
〖思考7〗锥形瓶的瓶口通过火焰的目的是什么？
〖思考8〗倒平板的目的是什么？
〖思考9〗若皿盖和皿底之间粘有培养基，则该平板能否培养微生物？为什么？
〖思考10〗配制斜面培养基作用是什么？，试管为什么要加塞棉塞？
二、纯化大肠杆菌
微生物接种：最常用的是 法和 法。另外还有穿刺接种和斜面接种等。
1．平板划线法是 的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
其操作步骤是：①将 在酒精灯火焰上灼烧直至 。②在酒精灯火焰旁冷却接种环，并打开大肠杆菌的菌种试管的棉塞。③将菌种试管口通过火焰达到 的目的。④将冷却的接种环伸入到 。⑤将菌种试管口再次通过火焰后塞上棉塞。⑥将皿盖打开一条缝隙，把接种环 ，盖上皿盖，不要划破培养基。⑦灼烧接种环，冷却后从 划线。重复上述过程，完成三、四、五区域内划线。注意不要将 相连。
⑧将平板 培养。
〖思考11〗取菌种前灼烧接种环的目的是什么？ 为什么除第一次划线外，其余划线前都要灼烧接种环？ 取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，其目的是？
最后灼烧接种环的目的是？ 在第1次划线后都从上次划线末端开始的目的是？
2．稀释涂布平板法则是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将 进行培养。当稀释倍数足够高时，即可获得单个细菌形成的标准菌落。
　系列稀释操作：
①取盛有 mL水的无菌试管6支 ，编号101、102、103、104、105、106。
②用灼烧冷却的移液管吸取 mL菌液注入编号为101试管中，并吹打3次使之混匀。
③从101倍液中吸取 mL菌液注入到编号为102试管内吹打均匀，获得102倍液。依此类推。
〖思考12〗系列稀释操作的注意事项是什么？
〖思考13〗涂布平板操作的步骤是什么？
结果分析与评价
1　培养未接种培养基的作用是什么？，若有菌落形成，说明什么？
2　在肉汤培养基上，大肠杆菌菌落颜色？形态？
3　培养12h和24h后的菌落大小？；菌落分布位置？原因？
〖思考14〗在某培养基上出现了3种特征不同的菌落是什么原因？
〖思考15〗频繁使用的菌种利用什么法保存？长期保存菌种的方法是什么？
典例精析
【例1】下列关于微生物营养的说法，正确的是……………………………………( )
A．同一种物质不可能既作碳源又作氮源 B．凡是碳源都能提供能量
c．除水以外的无机物仅提供无机盐 D．无机氮源也能提供能量
【例2】细菌培养过程中分别采用了高压蒸气、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌………( )
A．接种针、手、培养基 B．高压锅、手、接种针
C．培养基、手、接种针 D．接种针、手、高压锅
【例3】以下关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的叙述错误的是………………………( )
A．操作顺序为计算、称量、溶化、倒平板、灭菌
B．将称好的牛肉膏连同称量纸一同放人烧杯
C．待培养基冷却至50℃左右时进行倒平板
D．待平板冷却凝固约5～10 min后将平板倒过来放置
【例4】下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是
A.防止杂菌污染 B.消灭杂菌
C.培养基和发酵设备都必须灭菌 D.灭菌必须在接种前
◇◇知识拓展
3．消毒与灭菌的区别
消毒是一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒的物体基本无害的措施。例如一些常用的对皮肤、水果、饮用水进行药剂消毒的方法；对啤酒、牛奶、果汁和酱油等进行消毒处理的巴氏消毒法，等等。
灭菌是采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。例如各种高温灭菌措施等。
4．微生物的营养类型
异养微生物生命活动所需要的能源，主要靠有机物氧化分解释放能量，碳源是异养微生物的主要能源物质，碳源对异养微生物来说，不仅可为机体提供构成细胞物质，而且为机体提供完成整个生理活动所需能量。某些异养微生物也可以光能作为能源，例如红螺菌，在环境中没有有机物的条件下，它可以利用光能，把环境中的CO2合成为自身有机物；在有有机物存在的条件下，可以利用有机物进行生长，其代谢类型为兼性营养型细菌。依微生物生长所需碳源的性质以及所需能源，将微生物的营养类型归纳如下：
各类微生物所需碳源和能源的比较
在生产实践和社会生活中，我们可以利用某些微生物碳源的特殊性来解决环境污染、粮食危机等问题。我们可以利用某些细菌、放线菌、酵母菌以石油作为碳源的原理，消除石油污染。运用某些细菌可以分解、利用氰化物、酚等有毒物质的原理处理有毒物质。研究开发以纤维素、石油、CO2等作为碳源和能源的工业微生物，缓解粮食危机。
自养微生物和异养微生物类型的划分，主要依靠能否以CO2作为生长的主要或唯一碳源，而不是决定于氮源。例如异养微生物最常用的氮源是无机氮源中的铵盐和硝酸盐。
【补充】生长因子：某些微生物正常生长代谢过程中必须从培养基中吸收的微量有机小分子，如某些氨基酸、碱基、维生素等。
【补充】培养基的配制原则：
①目的要明确：根据培养的微生物种类、培养的目的等确定培养基的类型和配制量。
②营养要协调：培养基中各种营养物质的浓度和比例要适宜。例如：碳氮比4∶1时，谷氨酸棒状杆菌大量繁殖而产生谷氨酸少；碳氮比为3∶1时，菌体繁殖受抑制而谷氨酸合成量大增。
③pH要适宜：细菌培养基pH中性或偏碱性，霉菌培养基呈酸性。
知识拓展题
为了检测饮用水中是否含有某种细菌，配制如下培养基：
成分 乳糖 蔗糖 磷酸氢钾 伊红Y 美蓝 蒸馏水 PH
含量 5g 5g 2g 0.4g 0.065g 1000g 7.2
（1）该培养基所含的碳源是-----------------，其功能是---------------------------。
（2）该培养基所含的氮源是-----------------，其功能是---------------------------。
（3）该培养基除含碳源、氮源外，还有微生物需要的营养物质是---------------------------。
（4）该细菌在同化作用上的代谢类型是---------------
（5）该培养基用来鉴别的细菌是（ ）
A霉菌 B大肠杆菌 C 酵母菌 D 乳酸菌
基础自测
一、选择题、
1．下列有关培养基的叙述正确的是……( )
A．培养基是为微生物的生长繁殖提供营养的基质
B．培养基只有两类：液体培养基和固体培养基
C．固体培养基中加入少量水即可制成液体培养基
D．微生物在固体培养基上生长时，可以形成肉眼可见的单个细菌
2.不同培养基的具体配方不同，但一般都含( )
A．碳源、磷酸盐和维生素 B．氮源和维生素
C．水、碳源、氮源和无机盐 D．碳元素、氧元素、氢元素、氮元素
3．获得纯净培养物的关键是……………( )
A．将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌 B．接种纯种细菌
C．适宜环境条件下培养 D．防止外来杂菌的入侵
4．下列常用的无菌操作中错误的是……( )
A．用酒精擦拭双手 B．用氯气消毒水源
c．实验操作应在酒精灯火焰附近进行 D．玻璃器皿(吸管、培养皿)可用酒精擦拭
5．制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是( )
A．计算、称量、倒平板、溶化、灭菌 B．计算、称量、溶化、倒平板、灭菌
C．计算、称量、溶化、灭菌、倒平板 D．计算、称量、灭菌、溶化、倒平板
6．有关倒平板的操作错误的是…………( )
A．将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上 B．使打开的锥形瓶瓶口迅速通过火焰
c．将培养皿打开，培养皿盖倒放在桌子上 D．等待平板冷却凝固后需要倒过来放置
7．有关平板划线操作正确的是…………( )
A．使用已灭菌的接种环、培养皿，操作过程中不再灭菌
B．打开含菌种的试管需通过火焰灭菌，取出菌种后需马上塞上棉塞
c．将沾有菌种的接种环迅速伸人平板内，划三至五条平行线即可
D．最后将平板倒置，放人培养箱中培养
8．有关稀释涂布平板法，叙述错误的是…( )
A．首先将菌液进行一系列的梯度稀释
B．然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面
C．再放在适宜条件下培养 D．结果都可在培养基表面形成单个的菌落
9．涂布平板操作需要用到………………( )
A．接种环、滴管、酒精灯 B．接种环、移液管、酒精灯
C．涂布器、移液管、酒精灯 D．涂布器、接种环、酒精灯
10．将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37℃恒温箱的目的是……………( )
A．对比观察培养基有没有被微生物利用 B．对比分析培养基是否被杂菌污染
C．没必要放人未接种的培养基 D．为了下次接种时再使用
11关微生物营养物质的叙述中，正确的是
A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量
C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量
12．作为自养生物唯一碳源的是（ ）
A糖类 B 石油 C 二氧化碳 D 花生粉饼
13．大肠杆菌的代谢类型是（ ）
A 自养需氧 B异氧严格厌氧 C异养需氧 D 异养兼性厌氧
14．菌种保藏应控制的条件是（ ）
（1）湿度 （2） 低温 （3） 干燥 （4） 有光 （5）隔绝空气 （6）适当有氧
A（1）（4）（6） B（2）（3）（6） C（1）（5）（6） D（2）（3）（5）
15．下列物质中，不能用作酵母菌碳源的是（ ）
A含碳有机物 B蛋白胨 C含碳无机物 D花生粉饼等天然物质
16．平板冷却凝后要将平板倒置，其意义是（ ）
A利于大肠杆菌的接种 B防止杂菌污染
C利于培养的冷却 D 防止皿盖冷却水倒流入培养基
17。含C、H、O、N的大分子化合物可以作为（ ）
A异养微生物的氮源、能源 B异养微生物的碳源、氮源
C自养微生物的氮源、能源、碳源 D自养微生物的氮源、能源、碳源
二、非选择题
18．鉴定培养基的制作是否合格的方法是：将制备好的培养基放在 中保温1-2天看有无 ，如果没有 说明制作合格，反之则不合格。
19．请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。
(1)培养细菌用的培养基与培养皿
(2)玻棒、试管、烧瓶和吸管
(3)实验操作者的双手
(1) 、 (2) 、 (3)
20．19世纪中期，关系到法国经济命脉的酿造业曾一度遭受毁灭性的打击。在生产过程中，出现了葡萄酒变酸、变味的怪事。
(1)根据你所掌握的知识分析导致生产失败的根源是什么
(2)由此得出研究和应用微生物的前提是防止
21．在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗 为什么
22．在做第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线
参考答案
基础知识
一、1.营养物质 生长繁殖 液体 固体
2水.碳源 氮源 无机盐 PH 特殊营养物质 氧气
3维生素，酸性，中性或微碱性，无氧
〖思考1〗:C、H、O、N、P、S是构成细胞原生质的基本元素，约占原生质总量的97％以上。
二 （一）杂菌 1.空间 衣着 手，清洁和消毒 2.器皿 接种用具，培养基，灭菌 3. 酒精灯火焰 4.周围的物品
（二）1.略 巴氏消 酒精 2.略 灼烧 干热 高压蒸气
〖思考2〗:防止感染实验操作者 。
〖思考3〗避免妨碍热空气流通。
〖思考4〗有利于锅内温度升高，100k Pa，121℃，15～30，零，容器中的液体暴沸，
实验操作、
一1计算→称量→溶化→灭菌→倒平板
思考5：防止牛肉膏吸收空气中水分。防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。
〖思考6〗糖 维生素 和 有机氮
2：50，锥形瓶，拔出棉塞，迅速通过火焰，打开一条缝隙，将培养基倒入培养皿，倒过来放置
〖思考7〗消灭瓶口的杂菌，防止杂菌感染培养基。
〖思考8〗防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。
〖思考9〗不能。空气中杂菌会在这些粘附培养基上繁殖，并污染皿内培养基。
〖思考10〗增大接种面积，保持通气并防止杂菌感染。
答案。二、平板划线 .稀释涂布平板
1通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线，①接种环，烧红。③，消灭试管口杂菌。
④菌液中取出一环菌种。⑥，伸入平板内划3～5条平行线，⑦，第一区划线末端开始向第二区域内，，第五区的划线与第一区划线，⑧，倒置放在培养箱中
〖思考11〗消灭接种环上的微生物，的目的是消灭接种环上残留菌种，防止高温杀死菌种；防止细菌污染环境和操作者。获得由单个细菌形成的标准菌落。
2不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，
①，9mL，灭菌。②，1。③，1
〖思考12〗操作中试管口和移液管应在离火焰1～2cm处。整个操作过程中使用了1支移液管
结果分析与评价
1对照，培养基灭菌不彻底。2呈白色，为圆形，光滑有光泽，边缘整齐。3大小不同；菌落分布位置相同。原因是时间越长，菌落中细菌繁殖越多，菌落体积越大；菌落的位置不动，但菌落数增多。
〖思考14〗有培养基灭菌不彻底或杂菌感染等。
〖思考15〗临时保藏法和甘油管藏法。前者利用固体斜面培养基培养后，保存在4℃冰箱中，每3～6个月转种培养一次，缺点是保存时间较短，容易发生污染和变异；后者将菌种与无菌体积等量混合后保存在－20℃冷冻箱中。
【例1】解析：此题考查学生对微生物的营养和能源的理解。对异养微生物来说，含C、H、O、N的化合物既是碳源，又是氮源。CO2是光能自养细菌的碳源，但不能提供能量。CO2和N。是无机物，也是微生物的碳源和氮源。硝化细菌所利用的氮源是无机氮源氨，同时氨也为硝化细菌提供用以化能合成作用的能源。答案：D
启示：含C、H、o、N的化合物既是微生物的碳源，又是微生物的氮源；有机碳源能提供能量，无机碳源不能提供能量；无机物也可提供碳源、氮源和能源。
【例2】 解析：此题考查学生对无菌技术的掌握。高压蒸气灭菌锅是灭菌的一个设备，通常用于培养基的灭菌。用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。火焰灼烧，可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物的接种工具，如接种环。 答案：C
启示：微生物培养过程中的无菌操作包括消毒和灭菌两大类，分别又有各种不同的方法。对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒；将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。
【例3】解析：制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是计算、称量、溶化、灭菌、倒平板，不能颠倒。牛肉膏容易吸潮，所以当牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻棒取出称量纸。待培养基冷却至50℃，用手触摸锥形瓶刚刚不烫手，并且培养基处于溶化状态。平板冷却几分钟后还需倒置。答案：A
启示：固体培养基的制作步骤是：“计算→称量→溶化→灭菌→倒平板” 顺序不能颠倒。并且在制作过程特别是倒平板时彻底做到“无菌”。
【例4】解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是正确的；B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。C是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。答案：B
基础自测 一、1．A 2．C 3．D 4．D 5．C 6．C 7．D 8．D 9．C 10．B。11D。。12。C。13。D。14。B。15。C。16。D。17。B。
二、18． 恒温箱 菌落生长，菌落生长 19(1)需要灭菌 (2)需要灭菌 (3)需要消毒
20(1)导致生产失败的根源在于发酵物中混入了杂菌。(2)杂菌入侵，获得纯净的培养物。
21．不能 因空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。
22．因划线后线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，这样最终就能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。w.k.s.5.u.c
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类型一 微生物的营养要素
类型二 无菌技术
素
类型三 制备培养基
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