专题二 课题1
一、选择题
1．固体培养基中需要加入琼脂的目的是( D )
A．为菌体提供碳源 B．为菌体提供氮源
C．使培养基保持水分 D．使培养基凝固
[解析] 加入琼脂的主要目的是使培养基凝固。
2．现有菌液10 mL，按下图进行系列稀释，在最后一个试管中测得细菌数为20个，则未稀释前的试管中有细菌( C )
A．600个 B．1 200个
C．2×107个 D．2×106个
[解析] 从本题的图中可看出，每次都是稀释10倍，总共稀释6次，即稀释106倍，最后一个试管中有细菌20个，即原来菌液中应该有细菌2×107个，C正确。
3．下列有关平板划线接种法的操作错误的是( D )
A．将接种环放在火焰上灼烧
B．将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环液
C．蘸取菌液和划线要在火焰旁进行
D．划线时要将最后一区的划线与第一区的划线相连
[解析] 将微生物的接种工具，如接种环、接种针或其他的金属用具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌，故A正确；接种环必须冷却后，才可以伸入菌液中蘸取一环液，否则会烧伤或烧死微生物，故B正确；蘸取菌液和划线要在火焰旁进行，防止空气中的杂菌，故C正确；划线时要避免最后一区的划线与第一区划线连，因为最后一区是细菌最稀少的，而第一区是细菌最致密的，如果连在一起则有可能影响单个菌落的分离效果，故D错误。故选D。
4．下列关于灭菌的说法中，错误的是( A )
A．灭菌是指杀死一定环境中所有微生物的细胞，不包括芽孢和孢子
B．对不同的生物材料，应当采取不同的灭菌方法
C．培养基一般采取高压蒸汽灭菌法
D．高压蒸汽灭菌法最终使菌体蛋白质凝固变性
[解析] 灭菌是一种严格的使所有微生物(包括胞体、孢子、芽孢等)均死亡的措施。
5．利用稀释涂布平板法纯化的大肠杆菌，经培养后发现培养基上出现了多种菌落，不可能的原因是( D )
A．培养基制备过程中被杂菌污染
B．接种过程中，无菌操作不符合要求
C．系列稀释时，无菌操作不符合要求
D．大肠杆菌的种类不同
[解析] 大肠杆菌培养基中出现了多种菌落，说明污染了杂菌，杂菌可能来自培养基，也可能是因为操作过程中无菌操作不符合要求。
二、非选择题
6．某种产脂肪酶菌常被用作饲料添加剂。下表是从土壤中初筛该菌的培养基配方，请回答下列问题：
(NH4)2SO4
NaCl
MgSO4·
7H2O
K2HPO4
1%
橄榄油
蒸馏水
pH
0.1 g
0.05 g
0.01 g
10 g
4 mL
定容至
100 mL
7.0
(1)在上述培养基中，橄榄油能为产脂肪酶菌提供__碳源__。为增大产脂肪酶菌的浓度，需用该培养基进行富集培养，富集培养基宜选用液体培养基的原因是__液体培养基能增大菌体与培养基的接触面积，为菌株的生长和繁殖提供更多营养和空间__。
(2)用涂布平板法分离产脂肪酶菌时，在上述培养基的基础上，还应加入__琼脂__和溴甲酚紫(碱性条件下呈紫色，在酸性条件下为黄色)。在平板生产脂肪酶菌落的周围会出现黄色圈，原理是__脂肪酶将脂肪水解为甘油和脂肪酸，脂肪酸使溴甲酚紫变为黄色__。筛选时常选择菌落大、黄色圈直径大的菌落，二者分别说明__菌体繁殖能力强、脂肪酶活性高(产脂肪酶能力强)__。
(3)菌落是指由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。在平板上，有的菌落较小，呈乳白色，表面光滑，无丝状物，这些菌落可能为__细菌__(填“细菌”或“霉菌”)。有的菌落连成一片，形成原因最可能是__接种菌液的浓度过高__。
(4)研究发现，在饲料中添加产脂肪酶菌剂后，动物的体重明显增加，这说明__脂肪酶菌剂能提高饲料转化率(利用率)__。
[解析] (1)橄榄油是本培养基中的唯一碳源，能为产脂肪酶菌提供碳源。由于液体培养基能增大菌体与培养基的接触面积，为菌株的生长和繁殖提供更多的营养和空间，所以进行富集培养时宜选用液体培养基。(2)用涂布平板法分离产脂肪酶菌时所用的培养基为固体培养基，所以在上述培养基的基础上，还应加入琼脂。脂肪酶将脂肪水解为甘油和脂肪酸，脂肪酸呈酸性，能使溴甲酚紫变为黄色，因此在平板生产脂肪酶菌落的周围会出现黄色圈。菌落大，说明菌体繁殖能力强；黄色圈直径大，说明所产脂肪酶的活性高或产脂肪酶能力强。(3)菌落较小，呈乳白色，表面光滑，无丝状物，这些特征与细菌的菌落特征相符。平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。如果接种菌液的浓度过高，则会导致菌落在平板上连成一片。(4)在饲料中添加产脂肪酶菌剂后，因脂肪酶能催化脂肪水解，有利于脂肪的吸收，即脂肪酶菌剂能提高饲料转化率(利用率)，导致动物的体重明显增加。
专题二 课题1
一、选择题
1．菌种鉴定的重要依据是( B )
A．细菌的大小、形状和颜色 B．菌落的大小、形状、颜色
C．有无鞭毛 D．培养基的不同
[解析] 不同种类的细菌所形成的菌落在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一定特征，所以，每种细菌在一定条件下所形成的菌落，可以作为菌种鉴定的重要依据。单个的细菌用肉眼是看不见的，故细菌的个体特征不能作菌种鉴定的依据。
2．用平板划线法或稀释涂布平板法都可以纯化大肠杆菌，二者的共同点有几项( B )
①可以用相同的培养基 ②都要使用接种环进行接种 ③都需要在火焰旁边进行接种 ④都可以用来计数活菌
A．一项 B．二项
C．三项 D．四项
[解析] 平板划线法或稀释涂布平板法都使用固体培养基，①正确；平板划线法采用接种针进行操作，而稀释涂布平板法采用涂布器进行操作，②错误；纯化时，要进行无菌操作，需要在火焰旁接种，避免空气中的微生物混入培养基，③正确；平板划线法一般用于分离而不能用于计数，④错误。故选B。
3．下列关于平菇培养的操作程序，正确的是( D )
A．配制牛肉膏蛋白胨培养基，接种，高压蒸汽灭菌，培养
B．配制牛肉膏蛋白胨培养基，高压蒸汽灭菌，接种，培养
C．配制棉籽壳培养基，接种，高压蒸汽灭菌，培养
D．配制棉子壳培养基，高压蒸汽灭菌，接种，培养
[解析] 平菇的代谢类型属于异养型，需要提供现成的有机物才能生长。在题目给出的选项中，B选项是实验中培养细菌等的方法，D选项则是人们常用的培养平菇的方法，为了避免杂菌污染，应在接种前先进行灭菌处理。
4．如图是微生物平板划线示意图。划线的顺序为1,2,3,4,5。下列操作方法正确的是( D )
A．操作前要将接种环放在火焰边灼烧灭菌
B．划线操作必须在火焰上进行
C．最可能得到所需菌落的区域是1
D．在1,2,3,4,5区域中划线前后都要对接种环灭菌
[解析] 操作前要将接种环放在火焰上灼烧灭菌；划线操作必须在火焰旁进行，而不是火焰上；最可能得到所需菌落的区域是5。
5．制备各种牛肉膏蛋白胨固体培养基，关于倒平板的具体描述正确的是( C )
①待培养基冷却至40℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板
②将灭过菌的培养皿放在桌面上，左手拔出棉塞
③右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰
④用左手的拇指和食指完全打开皿盖
⑤右手将锥形瓶中培养基倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖
⑥等待平板冷却5～10s，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上
A．①③④⑤ B．④⑤⑥
C．③⑤ D．①②④⑥
[解析] 琼脂是一种多糖，在98℃以上可溶解于水，在45℃以下凝固，倒平板时高于50℃则会烫手，低于50℃时若不能及时操作，琼脂会凝固。无菌操作应贯穿于操作的全过程，皿盖全打开则空气中的微生物会进入培养基。
6．做“微生物的分离与培养”实验时，下列叙述正确的是( D )
A．任何培养基都必须含有碳源、氮源、水、无机盐
B．倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上
C．为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落
D．进行系列稀释操作时，用移液管吸取相应的菌液注入试管后，还要用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀
[解析] 培养基不一定都含有碳源、氮源等物质，如培养自养型微生物的培养基中不需要加入碳源，分离自生固氮菌的培养基中不需要加入氮源，A错误；倒平板时，用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基(约10～20 mL)倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖，B错误；接种环经火焰灼烧灭菌后应在火焰旁冷却后再挑取菌落，以防将菌种烫死，C错误；进行系列稀释操作时，用移液管吸取相应的菌液注入试管后，还要用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀，D正确。
7．下列关于四种生物的能源、碳源、氮源和代谢类型的描述，其中正确的一组是( D )
硝化细菌
乳酸菌
酵母菌
衣藻
能源
氧化NH3
分解乳酸
固定N2
利用光能
碳源
CO2
糖类
糖类
CO2
氮源
NH3
N2
N2
NO
代谢类型
自养需氧型
异养需氧型
异养需氧型
自养需氧型
A．硝化细菌、乳酸菌 B．乳酸菌、酵母菌
C．酵母菌、衣藻 D．硝化细菌、衣藻
[解析] 本题考查的知识有：①各种微生物的代谢类型，②微生物所需的能源、碳源和氮源的不同。解答此题时应明确：硝化细菌、乳酸菌属于细菌，酵母菌属于真菌，衣藻属于真核生物。微生物所需的能源、碳源、氮源因其代谢类型的不同而不同。
8．如图表示培养和纯化X细菌的部分操作步骤，下列相关叙述正确的是( C )
A．对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行灭菌处理
B．步骤①倒平板操作时倒好后应立即将其倒过来放置，防止水蒸气落在培养基上造成污染
C．步骤③应多个方向划线，使接种物逐渐稀释，培养后出现单个菌落
D．步骤④划线结束后在皿盖上做好标注
[解析] 对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒处理，A错误；步骤①倒平板操作后应等待平板冷却至凝固(大约需5至10分钟)后，再将其倒过来放置，防止水蒸气落在培养基上造成污染，B错误；步骤③应多个方向划线，使接种物逐渐稀释，最终培养后出现单个菌落，C正确；步骤④划线结束后应在皿底上做好标注，D错误。故选C。
9．培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶采用的灭菌、消毒方法依次是( A )
①化学消毒 ②灼烧灭菌 ③干热灭菌 ④紫外线灭菌 ⑤高压蒸汽灭菌 ⑥巴氏消毒法
A．⑤③②①④⑥ B．①②③④⑤⑥
C．⑥②③④①⑤ D．③④②①⑥⑤
10．外科手术器械和罐头食品的消毒，都要以能够杀死什么为标准( D )
A．球菌 B．杆菌
C．螺旋菌 D．芽孢
[解析] 外科手术器械和罐头食品的消毒都要求无菌，要杀灭一切生物，包括芽孢和孢子。
11．高温灭菌的原理是( C )
A．每种微生物生长的最适温度是一定的
B．微生物对高温环境不适应
C．高温破坏了细胞内的蛋白质、核酸，影响其生命活动
D．高温降低了环境中氧的浓度
[解析] 相对于动植物来说，微生物的耐高温能力是很强的。灭菌即杀死各种微生物及其他生命形态(如芽孢)，所以要采用更高温以破坏微生物体内蛋白质、核酸的分子活性，以使其永远丧失生活能力。
12．(2019·康杰中学高二期中)分离纯化大肠杆菌最常用的方法是平板划线法和稀释涂布平板法。下列有关这两种方法的叙述正确的是( D )
A．两种方法都可以用来计数活菌
B．单菌落均是由一个细菌繁殖而来的
C．都需要使用接种环进行接种
D．两种方法的目的都是得到单菌落
[解析] 平板划线法只能用来分离大肠杆菌，不能用来计数，A项错误；单菌落可能是由一个或几个聚在一起的细菌繁殖而来的，B项错误；稀释涂布平板法需要使用涂布器，C项错误；两种方法的目的都是得到单菌落，前者用于分离，后者可用于分离、计数，D项正确。
二、非选择题
13．入冬以来，宝鸡地区雾霾天气增多，空气中除二氧化硫，氮氧化物及可吸入颗粒物增多外，还含有较多的微生物，某兴趣小组收集了校园内体育场、教室、宿舍、小树林四处的微生物，对此进行探究，实验步骤如下：
①配制培养基(成分：牛肉膏、蛋白陈、NaCl、琼脂、水)；
②制作无菌平板；
③将制作好的平板，按下表进行处理
组别
处理方法
A组
打开培养皿盖，置于体育场暴露20min
B组
打开培养皿盖，置于教室内暴露20min
C组
打开培养皿盖，置于宿舍内暴露20min
D组
打开培养皿盖，置于小树林暴露20min
E组
不打开培养皿盖，静置20min
④将各组平板置于37℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数，回答下列问题：
(1)上述实验的目的是__探究校园内不同场所微生物的分布__。
(2)该培养基中，牛肉膏、蛋白胨为微生物提供的主要营养有__碳源、氮源__和维生素，从物理性质来看，该培养基属于__固体__培养基。
(3)若要完成步骤②，需对培养皿进行灭菌处理，常用的方法是__高压蒸汽灭菌__。倒平板时培养基的温度不能太低，原因是温度太低，会导致__培养基凝固无法铺展__，待平板冷凝后，要将平板__均匀倒置__，以防止培养皿盖上凝结的水珠掉入培养基中造成污染。
(4)该实验中的__E__组是对照组，若该组培养基表面有菌落生长说明__培养基灭菌不合格(受到杂菌污染)__。
[解析] (1)通过表格可知该实验的目的是探究校园内不同场所微生物的分布。(2)该培养基中，牛肉膏、蛋白胨为微生物提供的主要营养有碳源、氮源和维生素，培养基中有琼脂，从物理性质来看，该培养基属于固体培养基。(3)若要完成步骤②制作无菌平板，需对培养皿进行灭菌处理，常用的方法是高压蒸汽灭菌。倒平板时培养基的温度不能太低，因为培养基中有琼脂，温度低培养基凝固无法铺展，待平板冷凝后，要将平板倒置，以防止培养皿盖上凝结的水珠掉入培养基中造成污染。(4)该实验中的E组是对照组，若该组培养基表面有菌落生长说明培养基灭菌不合格(受到杂菌污染)。
14．某航空公司宣布，启用以生物柴油(俗称“地沟油”)为燃料的客机执行飞行任务，以减少碳排放。科学家发现，在微生物M(单细胞)产生的脂肪酶作用下，从地沟油中提取的植物油与甲醇反应能够合成生物柴油。
(1)用培养基培养微生物时，培养基中应有__碳源__、__氮源__、__水__和__无机盐__等营养，同时还必须满足微生物生长对__特殊营养物质__、__pH__、__氧气__的要求。在筛选产脂肪酶的微生物M时，应用__选择__培养基，可以在培养基中添加__植物油__作为唯一碳源。
(2)培养基灭菌采用的最适方法是__高压蒸汽灭菌__法。
(3)图示是采用纯化微生物M培养的两种接种方法接种后培养的效果图，过程一的接种方法是__平板划线法__，过程二的接种方法是__稀释涂布平板法__，接种后应注意培养皿要__倒置__放置。
[解析] (1)微生物的培养基的基本成分包括水、无机盐、碳源、氮源及特殊生长因子等。同时还必须满足微生物生长对特殊营养物质、pH、氧气的要求。已知脂肪酶能够催化脂肪水解为脂肪酸和甘油，筛选产脂肪酶的微生物时，宜用植物油作为培养基中的唯一碳源，从功能上讲，这种培养基属于选择培养基。(2)培养基一般有高压蒸汽灭菌法灭菌。(3)接种微生物常用的方法是稀释涂布平板法和平板划线法，获得图过程一的接种方法是平板划线法，过程二的接种方法是稀涂布平板法。
15．请回答与大肠杆菌纯化培养有关的问题：
(1)制备培养基。
配制培养基时各种成分在溶化后分装前必须调节__pH__，培养基在接种前要进行__高压蒸汽__灭菌。
(2)纯化大肠杆菌。
①通过连续划线操作，将聚集的菌种逐步分散到培养基的表面，在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这种方法称为__平板划线法__。
②用该方法统计样本菌落数时__需要__(填“需要”或“不需要”)设置对照组。为什么？__需要判断培养基是否被污染__。
(3)讨论分析。
①纯化大肠杆菌时，__不可__(填“可”或“不可”)用加入抗生素的方法防止杂菌感染。
②用该方法分离大肠杆菌时，从第二次划线操作起，每次总是要从上一次划线的末端开始划线，其原因是__线条末端的细菌数量少，最终可得到由单个细菌繁殖而形成的菌落__。
③大肠杆菌与酵母菌的最本质区别是__大肠杆菌无成形的细胞核(酵母菌有成形的细胞核)__。
[解析] (1)配制培养基时各种成分在熔化后分装前必须进行pH的调节，接种前要进行高压蒸汽灭菌。(2)①题干所述接种方法为平板划线法。②平板划线法接种培养微生物时，需要进行不接种的空白培养实验以判断培养基是否被污染，所以用该方法统计样本菌落数时需要设置对照组。(3)①大肠杆菌属于细菌，对抗生素敏感，培养大肠杆菌时不能用加入抗生素的方法防止杂菌感染。②平板划线法分离大肠杆菌时，从第二次划线操作起，每次总是要从上一次划线的末端开始划线，并划线数次，其原因是线条的末端的细菌数量少，最终可以得到由单个细菌繁殖而形成的菌落。③调查结果属于原核生物，酵母菌属于真核生物，它们最本质的区别是大肠杆菌无成形的细胞核。
课件56张PPT。专题二微生物的培养与应用
趣 味 导 学
巴斯德帮人们解决了防止酒变酸的难题。其实很简单，只要将酒加热到一定温度，就可以将细菌杀死，这就是后来被普遍采用的“巴氏消毒法”。巴斯德发现的细杆菌即醋酸杆菌，属于细菌。细菌、支原体、衣原体、病毒等被称为微生物。本专题介绍了微生物的培养与应用，通过本专题的学习，应当掌握有关微生物培养的基础知识，应当掌握培养基的配制、高压蒸汽灭菌和平板划线法等基本操作技术，并可以运用相关技术解决生产生活中有关微生物计数、微生物的分离与培养等实际问题。本专题包含三个方面的内容：课题1《微生物的实验室培养》；课题2《土壤中分解尿素的细菌的分离与计数》；课题3《分解纤维素的微生物的分离》。课题1介绍了最基本的微生物技术，是开展其他两个课题的基础。课题2和课题3要求分离某种特定的微生物，难度较大，探究性也很强。
专题重点：无菌技术的操作；对土样的选取和选择培养基的配制；从土壤中分离分解纤维素的微生物。
专题难点：无菌技术的操作；对分解尿素的细菌的计数；从土壤中分离分解纤维素的微生物。专 题 概 述 微生物与人类的关系极为密切。本专题在必修课基础上学习微生物培养的基本技术，以增进对微生物的了解。首先，要树立“有菌”的观念，应对培养基和其他材料用具进行灭菌，明确无菌操作的方法。其次，要学会分离微生物的方法，即用选择培养基分离到由单个细菌长出的菌落。学 法 指 导 课题1 微生物的实验室培养自 主 学 习一、培养基的概念、种类及营养要素
1．概念：人们按照微生物对____________的不同需求，配制出供其____________的营养基质。
2．种类：
按照培养基的____________划分为______________和______________。
3．营养要素：各种培养基一般都含有水、________、________、__________，此外还要满足微生物生长对______、________________以及________的要求。营养物质 生长繁殖 物理状态 液体培养基 固体培养基 碳源 氮源 无机盐 pH 特殊营养物质 氧气 二、无菌技术
1．获得纯净培养物的关键是防止________的入侵。
2．消毒和灭菌
(1)消毒，常用方法有________消毒法、________消毒法和____________消毒法。
(2)灭菌，常用方法：________灭菌、________灭菌、____________灭菌。
三、纯化大肠杆菌的无菌操作
本实验使用________培养基进行大肠杆菌的纯化培养，可分成______________和________________两个阶段进行。杂菌 煮沸 巴氏 化学药剂 干热 灼烧 高压蒸汽 固体 制备培养基 纯化大肠杆菌
所有微生物都可以用培养基进行培养吗？
提示：病毒是没有细胞结构的特殊微生物，必须在活细胞内寄生并以复制的方式增殖，因此不能生活在培养基中。目前常用于培养动物病毒的是活鸡胚。1．液体培养基含有水，而固体培养基不含水。( )
分析：液体培养基与固体培养基都含有水，它们的区别为是否添加凝固剂。
2．纯化大肠杆菌可选用牛肉膏蛋白胨培养基。( )
3．日常生活中所用的84消毒液，其消毒方法属于巴氏消毒法。( )
分析：消毒液消毒属于化学药剂消毒法。判断题× √ × 4．平板冷凝后应将平板倒置，防止皿盖上的冷凝水落入培养基，造成污染。( )
5．用酒精消毒时，酒精的浓度越高杀菌效果越好。( )
分析：酒精消毒时，70%的酒精杀菌效果最好，原因是：浓度过高，使菌体表面蛋白质变性过快从而凝固成一层保护膜，酒精分子不能渗入其中；浓度过低，杀菌能力减弱。√ × 新 知 解 读1．种类知识点1 培养基2．营养要素3．配制原则
①目的要明确(根据微生物的种类、培养目的等)。如培养基可由简单的无机物组成，生产用的培养基内可加入化学成分不明确的天然物质，而分类鉴定用的培养基内必须加入已知化学成分的物质。
②营养要协调。注意各种营养物质的浓度和比例。
③pH要适宜。各种微生物适宜生长的pH范围不同，
如细菌、放线菌和真菌的最适pH分别为：6.5～7.5、7.5～8.5和5.0～6.0。知识贴士
加入培养基中的凝固剂，一般不能被微生物利用，只起到凝固作用。琼脂是常用的凝固剂，主要作用是使液体培养基凝固。 关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的叙述错误的是( )
A．将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯溶解
B．等培养基冷却50℃左右时进行倒平板
C．待平板冷却凝固5～10分钟后将平板倒过来放置
D．操作顺序为计算、称量、溶化、倒平板、灭菌
[解析] 将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯溶解，A正确；等培养基冷却50℃左右时进行倒平板，B正确；待平板冷却凝固5～10分钟后将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上，C正确；操作顺序为计算、称量、溶化、灭菌、倒平板，D错误。故选D。D 〔变式训练1〕 关于配制培养基的叙述中，正确的是( )
A．制作固体培养基必须加入琼脂
B．加入青霉素可得到放线菌
C．培养自生固氮菌不需氮源
D．发酵工程一般用半固体培养基
[解析] 固体培养基需加入凝固剂，琼脂是常用的，但不是唯一的，青霉素可抑制细菌和放线菌的生长，发酵工程一般用液体培养基。自生固氮菌能够将空气中的氮还原成氨，故培养基配制时不需加氮源。C 主要是为防止外来杂菌的入侵，重点是消毒和灭菌。
1．消毒是指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子)。灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。知识点2 无菌技术2．消毒和灭菌的区别知识贴士
(1)灭菌和消毒都是通过一定的理化手段，使病原菌的蛋白质或核酸变性，失去生命活性。
(2)消毒与灭菌的原理是相同的，只是作用的条件不同，抑菌灭菌的程度不同。 无菌技术包括以下几个方面的叙述，其中错误的是( )
A．对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行灭菌
B．将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌
C．为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行
D．实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触
[解析] A项是进行消毒而不是灭菌，故错误。A 〔变式训练2〕 下列关于消毒和灭菌的叙述中，正确的是( )
A．选择消毒或灭菌要根据无菌操作的对象及目的而定
B．通过消毒或灭菌，可以将所有的杂菌、孢子和芽孢等都杀灭
C．培养基在倒平板前可以通过高压蒸汽灭菌或干热灭菌
D．对需要保持生物活性的材料可以采取消毒或瞬时灭菌
[解析] 选择消毒或灭菌要根据无菌操作的对象及目的而定，如培养的对象只能进行消毒，而培养基和培养的容器可以进行灭菌处理，A正确；消毒只能杀死物体体表或内部的一部分微生物，不能将所有的杂菌、孢子和芽孢等都杀灭，B错误；培养基在倒平板前可以通过高压蒸汽灭菌，但是不能通过干热灭菌，C错误；对需要保持生物活性的材料可以采取消毒，但是不能灭菌，D错误。A 1．制备牛肉膏蛋白胨固体培养基步骤如下：
计算：依据牛肉膏蛋白胨培养基配方比例计算配制100mL的培养基时，各种成分的用量
↓
称量：牛肉膏比较黏稠，可用称量纸称取，牛肉膏和蛋白胨都易吸潮，称取时动作要迅速，称后要及时盖上瓶盖
↓知识点3 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基及微生物纯化2．纯化物接种的方法
微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法，目的都是使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，并在培养基表面形成单个细胞繁殖而成的子细胞群体——菌落。
(1)平板划线法：①通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线培养后，可以分离到菌落。
②第一次划线及每次划线之前都需灼烧接种环灭菌，划线操作结束仍需灼烧接种环。
③灼烧接种环之后，要等其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。④划线时最后一区域不要与第一区域相连。
⑤划线用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破。
具体如下图(结合课本)(2)稀释涂布平板法：①将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。随后挑取单菌落，或重复以上操作数次，便可进行纯培养。
②稀释操作时：每支试管及其中9mL水、移液管均需灭菌。操作时，试管口和移液管应在离火焰1～2cm处。移液后用手指轻压上端的橡皮头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀。③涂布平板时：稀释涂布平板的操作比较复杂，且各个细节均需保证“无菌”，应特别注意：
酒精灯与培养皿的距离要合适；吸管头不要接触任何其他物体；吸管要在酒精灯火焰周围使用。
具体如下图(结合课本)3．接种成功的标准
如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，实验失败，需要分析原因，再次接种。知识贴士
(1)整个操作在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。
(2) 平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠。将平板倒置，既可避免培养基中的水分过快地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
(3)倒平板时不要将培养基溅在皿盖与皿底之间，否则此培养基不能用来培养微生物。
(4)倒平板时，锥形瓶瓶口要通过酒精灯火焰灭菌。
(5)在溶化后，要先调pH，后灭菌。 微生物接种最常用的方法是平板划线法和稀释涂布平板法。下列关于这两种接种方法的叙述中，不正确的是( )
A．都只能用于固体培养基接种 B．都能用于微生物的计数
C．接种培养后均可获得单菌落 D．接种工具使用后需要灭菌
[解析] 将微生物接种到固体培养基中的方法通常为平板划线法和稀释涂布平板法，A正确；稀释涂布平板法接种可以形成单菌落，所以常用来进行微生物的计数，平板划线法常用来筛选分离微生物，B错误；两种接种方法在培养基中均可形成单个菌落，C正确；为防止杂菌污染，接种工具需要灭菌后使用，D正确；故选B。B 变式训练3〕 有关平板划线法接种微生物的操作的叙述，不正确的是
( )
A．第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养基
B．每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种
C．在第二区域内划线时，接种环上的菌种直接来自菌液
D．划线结束后，灼烧接种环，能及时杀死接种环上的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者C [解析] 平板划线操作中，接种环蘸取菌液前灼烧的目的，是避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；以后每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线后残留的菌种；划线结束仍需灼烧接种环，是为了能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。从第二次划线开始，每次划线时接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，而不是菌液。指 点 迷 津菌种保藏
1．菌种保藏的依据
低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素。
2．菌种保藏的方法
为了保持菌种的纯净，需要进行菌种的保藏，常用的方法有临时保藏法和甘油管藏法。(1)临时保藏法：适用于频繁使用的菌种，其步骤为：①将菌种接种到试管的固体斜面培养基上；②在适宜条件下，培养至菌落长成；③将试管放在4℃的冰箱中保藏；④以后每3～6个月，都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上，重复步骤①②③。
这种方法保存菌种的时间短(3～6个月)，菌种易被污染或产生变异。
(2)长期保存法——甘油管藏法，其步骤为：①在3mL的甘油瓶中，装入1mL甘油后灭菌；②将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在－20℃的冷冻箱中保存。 为了保持菌种的纯净需要进行菌种的保藏，下列有关叙述不正确的是( )
A．对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法
B．临时保藏的菌种一般是接种到试管的固体斜面培养基上
C．临时保藏的菌种容易被污染或产生变异
D．对于需要长期保存的菌种，可以采用－4℃低温保藏的方法
[解析] 对于需要长期保存的菌种，可采用甘油管藏法，即在3mL的甘油瓶中加入1mL甘油后灭菌，将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在－20℃的冷冻箱中保存。D 核 心 素 养 为了获得β－胡萝卜素产品，某小组开展了产β－胡萝卜素酵母的筛选与色素提取实验。请回答下列问题：
(1)实验用的培养皿常用的两种灭菌方法是______________________________________；为了减少灭菌后器皿被污染，灭菌前应该____________________________。
(2)为了筛选出酵母菌，培养基中添加了青霉素，其目的是__________________________。干热灭菌和湿热灭菌(高压蒸汽灭菌) 用牛皮纸(报纸)包扎器皿 抑制细菌(放线菌)生长 (3)下图是灭菌锅及其局部剖面示意图，图中甲、乙、丙指示的依次是______。(填序号)
①安全阀、放气阀、压力表
②放气阀、安全阀、压力表
③安全阀、放气阀、温度表
④放气阀、安全阀、温度表
(4)为了将分离到的菌株纯化，挑取了菌落在3块相同平板上划线，结果其中一块平板的各划线区均未见菌落生长，
最可能的原因是____________________________。
[思维过程] 思考微生物培养中的有关灭菌方法及操作步骤，利用平板划线法接种微生物时的相关问题。① 接种环温度过高，菌被杀死 [解析] (1)培养皿灭菌常用的方法有湿热灭菌(高压蒸汽灭菌)、干热灭菌等。将培养皿放入灭菌锅之前通常用牛皮纸或报纸包扎，避免灭菌后的再次污染。(2)青霉素能抑制细菌和放线菌的生长繁殖，但对酵母菌等真菌不起作用，因此添加青霉素可筛选出酵母菌。(3)图中乙连接软管，为排(放)气阀，甲为安全阀，丙是压力表。(4)三块平板中有两块平板长有菌落，说明含有菌株并可在培养基上生长；而其中一块平板未见菌落，说明接种不成功，可能是接种环灼烧后未冷却或未充分冷却，使菌株因温度过高而被杀死。
[方法技巧] 无菌技术措施的选择原则
(1)考虑效果：灭菌的效果比消毒要好。
(2)考虑操作对象的承受能力：活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒的方法，而不能采用灭菌的方法。问 题 释 疑教材P15“旁栏思考题”
无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。
教材P16“旁栏思考题”
1、2需要灭菌；3需要消毒。
教材P17“倒平板操作”的讨论
1．可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就开始倒平板。教材P18“平板划线操作”的讨论
1．操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
2．以免接种环温度太高，杀死菌种。使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
3．划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。教材P18“涂布平板操作”的讨论
应从操作的各个细节保证无菌。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。知 识 构 建
