土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

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<<土壤中分解尿素的细菌的分离与计数>>的教学设计
学科：生物 教材名称：选修一 教材出版社：人民教育出版社
课题：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 年级：高二 学期：下
★课题目标
（一）知识与技能
利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产生活中有关微生物的计数
（二）过程与方法
分析研究思路的形成过程，找出共性和差异性
（三）情感、态度与价值观
形成无菌不在的概念，养成讲究卫生的习惯
★课题重点 对土样的选取和选择培养基的配制
★课题难点 对分解尿素的细菌的计数
★教学方法 启发式教学
★教学工具 多媒体课件
★课时安排 2课时：
第一课时（一）学案导学，引入新课（自主探究、自主学习）
学案（学生活动）
1．培养基一般都含有 、 、 、 四类营养物质，另外还需要满足微生物生长对 、 以及 的要求。
2.培养基的分类：按照物理性质可以分为 、 、 ；按照化学性质分为 和 ；
按照用途分为 和 。
3.尿素可以为农作物提供 肥，但是只有被 分解成 之后，才能被植物吸收利用。
4．以土壤中能分解尿素的细菌为研究对象，要达到的两个主要目的是：
⑴ ；⑵ 。
5．PCR（ ）是一种在体外将 。此项技术的自动化，但是在合成的过程中需要在93℃的条件下，所以要求使用耐高温的
【导学过程】（合作探究、合作学习）
（一）筛选菌株
1.原理: 人为提供有利于 生长的条件（包括 等），同时抑制或阻止其他微生物生长。
2.方法：选择培养基
定义：在微生物学中，将允许 的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。
配制的的依据：
①在培养基中加入某种化学物质可以做到这一点，加入 可以分离出酵母菌和霉菌。加入高浓度的食盐可得到 。这里的加入是在培养的培养成分的基础上加入的。
②培养基中的营养成分的改变也可达到分离微生物的目的。如培养基中缺乏 源时，可以分离固氮微生物。
③当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也具有分离效果。
④改变微生物的培养条件， 也可以达到分离微生物的目的，如将培养基放在 环境中培养只能得到耐高温的微生物。
讨论1：怎样找耐高温的酶呢？
讨论2.如何找到能够分解石油的细菌？
(二)统计菌落数目
（1）测定微生物数量的常用方法有 和 。
（2）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。为了保证结果准确，一般设置 个平板，选择菌落数在 的平板进行计数，并取 。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。
讨论3.完成课本P22页思考题
讨论4. 完成课本P22页旁栏思考题？
（三） 设置对照
设置对照的主要目的
对照试验的定义：
讨论5.完成课本P23页A同学的两个对照试验？
（四）实验设计（仅限设计）
实验设计包括 ，所需 、 、用具和药品，具体的 以及
时间安排等的综合考虑和安排。
（1）土壤取样
从富含有机物、潮湿、pH≈ 的土壤中取样。铲去 ，在距地表约 cm的土壤层取样。
（2）制备培养基
准备牛肉膏蛋白胨培养基和用 作为氮源的选择培养基。牛肉膏蛋白胨培养基作为 ，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。
（3）微生物的培养与观察
将土样以1、101、102……依次等比稀释至107稀释度，按照浓度从低到高的顺序涂布平板， （是否）更换移液管。对于不同的微生物要选择不同的稀释浓度，测定细菌一般选择 ，测定真菌一般选择 ，测定放线菌一般选择 。注明培养基种类、培养日期以及平板培养样品的稀释度。将涂布好的培养皿放在 ℃温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌产生。比较牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。
讨论6.为什么分离不同的微生物需要不同的稀释浓度？
（4）细菌的计数
当菌落数目稳定时，进行计数，防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。求出平均值，根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。
（五）操作提示
1.本实验中要注意那些无菌操作？
2. 在进行多组实验过程中，应注意做好标记，其目的是什么？应标记哪些内容？怎样操作更有利于实验的进行？
3.如何对分离的菌种作进一步的鉴定？
第二课时：（一）（学生动手）请填写以下实验流程：
（二）操作：实验过程中注意事项（黑板板书），教师参与活动
1）取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。
2）应在火焰旁称取土壤 10 g。将称好的土样倒入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。
3）在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。
4）实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。
5）为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当事先规划时间。
1.实验步骤：（学生操作）
土壤取样（从肥沃、湿润的土壤中，用无菌小铁铲铲去表层土，迅速取土壤并装入无菌信封密封。）
制备培养基（准备选择培养基）
样品的稀释（在火焰旁称取土壤10g，放入90mL无菌水的三角烧瓶中，振摇使土样与水充分混合，将菌分散。制成101倍土壤稀释液，用一支lmL无菌吸管从中吸取lmL土壤悬液注入盛有9mL无菌水试管中，吹吸三次，使其充分混匀，制成102倍土壤稀释液，以此类推制成103、104、105、106倍土壤稀释液。）
取样涂布 在上述培养基的9个平板底面，每三个一组分别用记号笔写上104、105、106倍的三种稀释液，然后用三支lmL无菌吸管分别从104、105、106倍的三管土壤稀释液中吸收0.1mL对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌涂布器在培养基表面轻轻地涂布均匀（下图）
样品的稀释和稀释液的取样培养流程示意图
培养观察 将培养基平板倒置于30℃～37℃温室中培养1～2天，每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数。
2讨论：①为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？
这是因为土壤中各类微生物的数量是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养条件。
②是否获得某一稀释度下，菌落数目在30～300平板
如果得到了2个或2个以上菌落数目在30～300平板，则说明稀释操作比较成功。并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。
③在微生物培养过程中，为什么每隔24h统计一次菌落数目 菌种鉴定依据是什么
不同种类的微生物，往往需不同的培养温度和培养时间，每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。不同种类的细菌形成的菌落，在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一定的特征，菌落特征可作为菌种鉴定的重要依据。
（三）结果分析与评价
1　对分离的菌种作进一步的鉴定，还需要借助 生物化学 的方法。
2　在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的 脲酶 将尿素分解成了 氨 。氨会使培养基的碱性 增强 ，PH 升高 。因此，我们可以通过检测培养基 pH 变化来判断该化学反应是否发生。
3　在以 尿素 为唯一氮源的培养基中加入 酚红 指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变 红 ，说明该细菌能够 分解尿素 。
〖思考〗测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝 培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现 黑 色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。你认为在该实验中至少应取 三 个水样。
（四）课堂总结、点评
菌落计数
配制土壤溶液
系列稀释
涂布平板与培养
实验方案
土壤中尿素分解菌的分离与计数
分离筛选微生物的原理
有利于目的菌株生长
抑制或阻止其他微生物生长
人为
条件
微生物计数方法与原理
稀释涂布平板法
显微镜直接计数
对照设置与重复设置
实验设计
实验操作
结果与分析
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