基因工程的操作原理和技术

课件17张PPT。 第二节 基因工程的原理和技术基本原理：让人们感兴趣的基因（目的基因）在宿主细胞中稳定和高效的表达。重组DNA的基本步骤
⑴ 目的基因的获取
⑵ 克隆载体的选择与改建
⑶ 基因与载体的连接
⑷ 重组DNA导入受体细胞
⑸ 重组体的筛选
⑹ 目的基因的表达基因工程基本操作步骤一.目的基因的获取◆化学合成法：利用DNA合成仪合成一些较小的基因。
◆基因组DNA：构建基因组DNA文库
◆cDNA：构建cDNA文库
◆聚合酶链反应（PCR）1、化学法合成（已知目的基因序列）2、建立基因文库（不知目的基因序列）基因组DNA文库:直接从生物体中提取总DNA（包括目的基因在内），构建 (genomic DNA library)，从中调用目的基因cDNA文库 将供体生物细胞的mRNA分离出来，利用逆转录酶在体外合成cDNA，克隆在受体细胞内，筛选获得含有目的基因编码序列的重组克隆。 二. 形成重组DNA分子）同一种限制性内切酶切割质粒和目的基因，加入DNA连接酶，形成重组DNA分子 三.（将重组DNA分子导入受体细胞）将目的基因导入植物细胞：
将目的基因导入动物细胞：
将目的基因导入微生物细胞：土壤农杆菌转化法
基因枪法
花粉管通道法显微注射用Ca2+处理；
电激或热激
重组质粒大量复制5.利用土壤农杆菌Ti质粒动物细胞受精卵显微注射法胰岛素原的合成胰脏(A)n
胰岛素原mRNAcDNA重组质粒转化细菌mRNA反转录酶胰岛素原基因与质粒连接感染E.coli胰岛素原将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。四.筛选含有目的基因的受体细胞　处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。 常利用抗生素抗性基因：这是一种最早而且最广泛使用的方法。pBR322质粒结构 如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活 如果外源DNA插入，四环素抗性基因失活 如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活含氨卞青霉素含四环素含四环素由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，α-互补被破坏，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。 ５－溴－４－氯－３－吲哚－β－Ｄ－半乳糖苷互补显色筛选法：蓝白斑筛选 五.目的基因的表达检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因
检测目的基因是否转录出了mRNA
检测目的基因是否翻译成蛋白质
检测性状分子水平个体水平目的基因的表达有的目的基因需要进行修饰改造才能表达酶切连接重组DNA技术—分、切、接、转、筛导入宿主细胞筛选扩增小结分