专题5课题3《血红蛋白的提取和分离》 课件 (共65张PPT)

(共36张PPT)
血红蛋白
血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质(缩写为HB或HGB)。血红蛋白因含有血红素而呈现红色，是使血液呈红色的蛋白。血红蛋白由四条链组成，两条α链和两条β链，每一条链有一个包含一个铁原子的环状血红素，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳。
血红蛋白的特性是：在氧含量高的地方，容易与氧结合；在氧含量低的地方，又容易与氧分离。血红蛋白的这一特性，使红细胞具有运输氧的功能。
每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。

（一）凝胶色谱法
1、定义：凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据相对分子量的大小分离蛋白质的有效方法。
一、基础知识
2、所用凝胶：实际上是一些微小的多孔球体，如琼脂糖葡聚糖凝胶。
凝胶色谱法分离蛋白质的原理
原理：
当不同的蛋白质通过凝胶时
相对分子质量较小
相对分子质量较大
凝胶内部的通道
容易进入
无法进入凝胶内部的通道
只能在凝胶外部移动
路程较长
移动速度较慢
路程较短
移动速度较快
相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。
思考：所有的蛋白质都可以用凝胶色谱法
来分离吗？
不是，能分离的蛋白质分子必须是具有相对分子质量不同的蛋白质。
（二）缓冲溶液


在一定范围内，能够抵制 对溶液PH值的影响，维持PH 不变。
1.作用:
2.配制:
通常由 溶解于水中配制而成。调节缓冲剂 的就可以制得在 使用的缓冲液。
3.本课题中使用的缓冲液是:__________ ,
其目的是:
利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能
磷酸缓冲液
外界的酸和碱
基本
1~2 种缓冲剂
使用比例
不同PH范围内
思考：说出人体血液中缓冲对。
NaH2PO4 / Na2HPO4
H2CO3 / NaHCO3
（三） 电泳
1.概念：
带电粒子在 作用下发生 的过程。
2.原理：
电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
3.类型:
琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。
电场
迁移
在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动
琼脂糖凝胶电泳示意图
（1）蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。
（2）SDS能与各种蛋白质形成蛋白质-SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
①琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需要事先处理；电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。②测定蛋白质的相对分子质量常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，这是因为该方法分离蛋白质完全取决于分子的大小，而非所带电荷的性质和分子的大小、形状。
二、实验操作
蛋白质的提取和分离一般分为四步：
样品处理— 粗分离—— 纯化————纯度鉴定
（透析）
（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）
本课题我们用哺乳动物的红细胞为材料提取血红蛋白。（采集得到血液加入抗凝血剂柠檬酸钠）
2、与其他真核细胞相比,红细胞有什么特点?
这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义?
1. 用鸡的红细胞提取DNA，用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？
鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。
人的红细胞无细胞核、无细胞器，含有色血红蛋白；因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液.这使血红蛋白的分离过程非常直观,大大简化了实验操作.
血液
100mL
重复洗涤3次，直至上清液没有黄色
（一）样品的处理
1.红细胞的洗涤：
离心机、生理盐水
（1）红细胞洗涤的目的：


去除杂质蛋白（主要是血浆蛋白），以利于后续步骤的分离纯化
（3）为什么要低速短时离心？
不能，生理盐水能保持红细胞的渗透压而不至于破裂，若红细胞提前破裂，使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大分离难度。
（4）为什么要缓慢搅拌？
防止红细胞破裂释放出血红蛋白。
防止白细胞沉淀
（2）能否用蒸馏水代替生理盐水？
2.血红蛋白的释放：
将洗好的红细胞倒入烧杯中，加入蒸馏水到原血液的体积，再加入40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10mim。在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。
思考：
b. 蒸馏水的作用是______________________________。

c. 加入甲苯的作用是____________________________。

d. 为了加速释放过程，采取的措施是____________________________。
使红细胞大量吸水胀破
溶解红细胞的细胞膜
使用磁力搅拌器
蒸馏水，40%体积的甲苯
a.释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞中加入的物质是_____________________。
红细胞
混合液
烧杯
有机溶剂
血红蛋白
3.分离血红蛋白溶液
注：2000r/mim的速度高速离心10mim
无色透明甲苯层
白色薄层固体
红色透明液体
暗红色杂质沉淀层
试管中溶液层次
4.透析（即粗分离）：
（1）取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓液中（pH为7.0），透析12h。
（2）透析的目的是什么？
去除分子量较小的杂质
（3）透析过程中为何使用pH＝7的磷酸缓冲液？为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量？
维持血红蛋白的正常特性；有利于杂质分子充分地向外扩散。
1.凝胶色谱柱的制作
①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。
②底塞的制作：
打孔 挖出凹穴 安装移液管头部 覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。
（二）凝胶色谱操作（纯化）：去除相对分子量较大的杂质蛋白

凝胶色谱柱的制作
洗涤平衡凝胶
一次性缓慢倒入；轻轻敲打
装填悬浮液
凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀
根据色谱柱体积计算凝胶用量
色谱柱垂直固定在支架上
配制悬浮液
计算称量凝胶
固定色谱柱
材料：交联葡聚糖凝胶G-75 、20mmol/L磷酸缓冲液（“G”表示什么？75代表什么？）
2.凝胶色谱柱的装填
步骤 操作要求
①
②
③
④
⑤
②洗涤平衡凝胶目的：
用磷酸缓冲液洗涤12h，使凝胶装填紧密。
注意：①装填凝胶柱时不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。
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教材P70：为什么凝胶的装填要紧密、均匀？
如果装填不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，影响分离的效果。
3.样品加入与洗脱
（1）加样前
打开下端出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。
注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。
（2）加透析样品
（4）洗脱
色谱柱制作成功的标志：
红色区带均匀一致的移动
（3）样品渗入凝胶床
打开下端，用磷酸缓冲液洗脱，待红色的蛋白质接近色谱柱底端时用试管收集。
打开下端出口，当样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。
（三）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（纯度鉴定 ）：选做
若纯度高，分子向阳极迁移速率基本相同。
样品处理
总结蛋白质提取和分离步骤：
红细胞的洗涤
粗分离：
血红蛋白的释放
分离血红蛋白溶液
纯化：
纯度鉴定：
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
三、操作提示
1. 红细胞的洗涤：
洗涤次数不能过少；低速、短时离心。
2.凝胶的预处理：
用沸水浴加热，时间短，还能除去微生物和气泡。
3.色谱柱的装填：装填尽量紧密；无气泡；不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒。
4. 色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。
观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。
四、结果分析与评价
1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？
2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？
由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。
如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。
3、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？