人教生物选修1 专题3 课题2 月季的花药培养（共49张PPT）

(共49张PPT)
专题3 :植物的组织培养技术
课题目标
1、说出被子植物花粉发育的过程及花药培养产生
花粉植株的两种途径；
2、说出影响花药培养的因素，学习花药培养的基
本技术；
3、尝试用月季或其他植物的花药进行培养。
课题重点、难点
重点：选取适宜的培养材料和培养基；
难点：选取适宜的培养材料和培养基；
课题背景
1、1964年印度科学家首次培养毛叶曼陀罗花药，由花粉粒发育获得单倍体植株：
说明：生殖细胞在离体条件下也具有发育全能性。
2、自20世纪60年代以来，花药培养的研究迅速发展，据记载已有250多种高等植物的花药培养获得成功，近50多种花粉再生植株由我国科技人员首先培育成功；
3、花药离体培养在育种上的特殊意义：单倍体育种
（1）方法：花药离体培养获得单倍体，染色体加倍获得纯种；
（2）优点：极大缩短了育种周期，后代无性状分离。为新品种的培育开辟了新途径。
一、基础知识
（一）被子植物的花粉发育

（二）产生花粉植株的两种途径

（三）影响花药培养的因素
（一）被子植物的花粉发育
（1）被子植物定义：凡是种子有果皮包被着，胚珠有子房壁包被着的植物，就叫做被子植物（绿色开花植物）
1、 被子植物和裸子植物
（2）裸子植物定义：凡是胚珠裸露，外面没有子房壁包被，种子外面没有果皮包被的植物称为裸子植物（无真正意义上的花）
实例：玉米、大豆、梨、杏
实例：松、杉、柏
（3）被子植物花的结构
花的结构
（3）被子植物花的结构
花梗
花托
花萼：萼片
雌蕊
花被
花冠：花瓣
花蕊
雄蕊
花药
花丝
柱头
花柱
子房
药隔
花粉囊（4或2）
子房壁
子房腔
胚珠
（4）被子植物花的作用
被子植物的有性生殖是在花里进行的，雌蕊和雄蕊是进行有性生殖的主要部分
2、被子植物花粉粒的形成
花丝
花药：囊状结构，内有很多花粉粒
（1）雄蕊的结构
雄蕊：
药隔：花药中部，由薄壁细胞构成，内有
维管束（疏导组织）
花药
花粉囊（4或2个）
囊壁
花粉粒
表皮
纤维层
（2）花药的结构：囊状结构内有许多花粉
2、被子植物花粉粒的形成
（2）花药的结构：
（3）花药的发育
周缘细胞
（初生壁细胞）
外：体积较大药室内壁
中：一层或几层细胞
内：绒毡层
分裂
孢原细胞
造孢细胞
花粉母细胞
（小孢子母细胞）
有丝分裂
发育
花粉
花粉是小孢子母细胞经过减数分裂而形成的，因此，花粉是单倍体的生殖细胞
（4）被子植物的花粉发育
①经历时期：
四分体时期、单核期、双核期等阶段
②花粉发育过程：
小孢子母细胞（花粉母细胞）
减数分裂
4个小孢子（小孢子四分体时期）
1个小孢子（单核居中期）：这时的细胞含有浓
厚的原生质，核位于细胞中央称为单核居中期
②花粉发育过程：
4个单倍体细胞连在一起，进入单核期（四分体的4个单倍体细胞彼此分离，各自形成具有4个单细胞核的花粉粒）
有丝分裂
1个小孢子（单核靠边期）：随着细胞不断长大，细胞核由中央移向细胞一侧称为单核靠边期
花粉管细胞核
生殖细胞核
营养细胞
生殖细胞
2个精子
（基因型相同）
双核期
两个精子和一个营养核的基因型相同
生殖细胞核与花粉管细胞核基因型相同；
1个花粉母细胞
4个小孢子
减数分裂
有丝分裂
4个花粉管细胞核
（基因型不一定相同）
4个生殖细胞核
8个精子（基因型不一定相同）
有丝分裂
③花粉粒类型
一个成熟的花粉粒即为雄配子体，有两种情况：
二核花粉粒:成熟的花粉粒中，只含花粉管细胞核
和生殖细胞核。（精子在花粉管中形成）
三核花粉粒:有些植物的花粉，在成熟前，生殖细
胞进行一次有丝分裂，形成两个精子，这样
的花粉在成熟时，含有一个营养核和两个精子。
3、被子植物胚囊的形成
（1）雌蕊的组成
柱头、花柱、子房
（2）子房的结构
被子植物子房的结构
胚珠的结构
花粉管
精 子
卵细胞
极核
子房壁
珠被
珠孔
（3）被子植物卵细胞的形成
大孢子母细胞（胚囊母细胞）：染色体和体细胞相同。
减数分裂，产生四个细胞
4个大孢子：每个大孢子内的染色体数目都减少一半。
1个胚囊细胞：单倍体细胞
这4个细胞排成一行，其中靠近珠孔的3个细胞退化，最里面的发育为胚囊细胞
核连续进行三次有丝分裂，但是每次核分裂后，并不接着进行细胞质分裂，就形成了8个细胞核的胚囊，（基因型相同的单倍体细胞核）
1个胚囊：(8细胞胚囊)开始这 8个细胞核分别位于胚囊
的两端，每端4个，接着每端各有1个细胞核
移到胚囊的中央，这就是两个极核，8个核经
有丝分裂而来遗传物质相同。以后靠近珠孔
端的3个细胞核发育成3个细胞，其中最大的
一个是卵细胞，其余的是2个助细胞，另一端
3个细胞核也发育成3个反足细胞。
花粉落到雌蕊柱头上以后，在柱头上黏液的刺激下，花粉开始萌发并形成花粉管，花粉管沿着花柱向胚珠方向生长，到达胚珠后从珠孔绕过卵细胞进入胚囊，到达胚囊中卵细胞和极核之间，这时花粉管的前端破裂，释放出两个精子，其中一个精子与两个极核结合形成受精极核，另一个精子与卵细胞结合形成受精卵，这是被子植物特有的双受精现象
（4）被子植物的受精过程（双受精）
（5）发育结果：种子的形成
（二）产生花粉植株的两种途径
1、胚状体：人们一直以为，植物细胞的离体培养只能通过分别诱导芽和根等器官再发育成植株。20世纪50年代末，科学家在胡萝卜根组织细胞悬浮培养液中发现，某些体细胞在形态上转变为与合子发育成的胚非常相似的结构，它的发育过程也与合子胚类似，胚芽、胚轴、培根等结构完整，就像一颗种子。科学家将这种结构称为体细胞胚或胚状体。除了植物的体细胞外，由单倍体性细胞产生的花粉胚，也能发育为单倍体植株，也称为胚状体
（二）产生花粉植株的两种途径
2、产生花粉植株的两种途径：通过花药培养产生的花花粉植株（单倍体植株）一般有两种途径：一种是花粉通过胚状体阶段发育为植株；另一种是花粉在诱导培养基上先形成愈伤组织，再将愈伤组织诱导分化成植株。
①花药中的花粉
②花药中的花粉
脱分化
胚状体
（花粉胚）
分化
丛芽
脱分化
愈伤组织
再分化
丛芽
诱导
生根
移栽
两种途径之间无绝对界限，主要取决于培养基中激素的种类及其浓度配比。
诱导花粉植株能否成功及诱导成功率的高低，受多种因素影响，其中材料的选择与培养基的组成是主要影响因素。
（三）影响花药培养的因素
①不同植物的诱导成功率很不相同；
②同一种植物的生理状况对诱导成功率也有直接影响：
花期早期时的花药比后期的更容易产生花粉植株。
一般月季的花药培养时间选在5月初到5月中旬，即月季的初花期。
选材是否成功是花药培养成功的关键
（1）选材
1、材料的选择：
花期：花期一般指在一个生长季内植株开花的时间段。比如某些种类的月季，从5月初一直到11月都连续开花。那么5月初就叫做该种月季的初花期或花期早期。花期早期的花蕾营养状态及生理状态都比较好，能提高花粉诱导成功率。
（2）花药培养时期的选择：合适的花粉发育时期是提高诱导成功率的重要因素
①原因：因为并不是任何时期的花粉都可以经过培养产生愈伤组织或胚状体，花粉发育的过程中，只有某一个时期对离体刺激敏感。
1、材料的选择：
（三）影响花药培养的因素
一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养的成功率最高。即：最适合花药培养的小孢子发育时期为单核靠边期。
②花药时期选择：单核靠边期。
选择单核期以前的花药接种，质地幼嫩，极易破碎；
选择单核期之后的花药接种，花瓣松动，又给材料的
消毒困难，且难以挑选到单核期的花药。
③其它时期选择的缺点
④单核期花药的挑选：通常选择完全未开放的花蕾。盛开
的或略微开放的花，都不宜选作实验材料。
⑤选择完全未开放花蕾的原因：可挑选到单核期的花药，
菌少、易消毒
花瓣松动后，微生物就可能侵入到花药给材料的消毒带来困难。
旁栏思考：为什么花瓣松动会给消毒带来困难？

2、培养基的组成：培养基的组成会影响脱分化与再分化
花药培养基可能因植物的不同而有所变化如
小麦中为N6
马铃薯、月季中为MS
油菜中为B5培养基
月季花药培养基配方：在1000mlMS培养基配方中添加
2,4—D(0.4mg)、KT(0.2mg)、IAA(4mg)；调节PH至5.8
3、其他影响因素：
如亲本的生长条件、材料的低温预处理以及接种密度对诱导成功率都有影响。
二、实验操作
（一）材料的选取

（二）材料的消毒

（三）接种和培养
②某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙花青-铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色。
①最常用的方法有醋酸洋红法
（一）材料的选取
选择花药时，一般要通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期。确定花粉发育时期的最常用的方法有醋酸洋红法。但是某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙花青—铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色。
（1）醋酸洋红法染色机理：醋酸洋红为碱性染色
剂，而花粉细胞内有染色体，染色体主要成分是
DNA和蛋白质,易被碱性染料着色染成红色 。
（2）醋酸洋红的配置：将体积分数45％的醋酸
100ml煮沸，缓缓加入1g洋红，再加热回流8h，冷
却至50℃，过滤即可。
1、醋酸洋红法
（3）染色操作：将花药放在载玻片上，加一滴质量
分数1％的醋酸洋红，用镊柄将花药捣碎，盖上盖
玻片在显微镜下检查。
2、焙花青—铬钒法
（1）卡诺氏固定液的配制方法：
将无水酒精与冰醋酸按体积比为3：1的比例混匀
（2）焙花青—铬钒溶液的配制方法：将5g铬明矾
[K2SO4Cr2(SO4)3·24H2O]加入90ml蒸馏水中，溶解后
加入0.1g焙花青，混匀并加热至沸腾，煮沸5分钟后
冷却至室温，过滤，加蒸馏水定容至100ml。
（3）染色操作：花药应该先在卡诺氏固定液中固定
20min，然后取出放在载玻片上，加焙花青—铬钒
溶液染色，盖上盖玻片后在显微镜下检查。
（4）染色结果：将花粉细胞核染成蓝黑色
（二）材料的消毒
1、酒精处理
（1）通常先将花蕾用体积分数为70%的酒精浸泡约30
秒，立即取出。
（2）无菌水清洗
（3)无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分
2、消毒液处理
用于培养的花药，实际上多数未熟，由于它的外面有花萼、花瓣或颖片保护，通常处于无菌状态，所以只要将整个花蕾或幼穗消毒即可。
（1）放入质量分数为0.1%的氯化汞溶液中2—4分钟（也
可质量分数为1%的次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液）
（2）无菌水冲洗3—5次
1、剥取花药:
灭菌后的花蕾，在无菌条件下除去萼片和花瓣用镊子取出花药
2、接种:立即将花药接种于培养基上，通常每瓶接种
花药7-10个。
注意：
①勿损伤花药：以免诱导出非花粉愈伤组织
②要彻底去除花丝：因为与花丝相连的花药不利于愈
伤组织或胚状体的形成
（三）接种和培养
（1）培养条件： 温度：25℃左右；
光照：不需要光照，小植株形成后光照。
3、培养
（2）培养：一般经过20-30天培养后，会发现花药开裂，
长出愈伤组织或释放出胚状体。
①如长出愈伤组织：则将愈伤组织及时转移到分化培养
基上，以便进一步分化出再生植株。
②如果花药开裂释放出胚状体：则一个花药内就会产生
大量幼小植株，必须在花药开裂后尽快将幼小植株
分开，分别移植到新的培养基上，否则这些植株将
很难分开。
4、鉴定和筛选：
在花药培养中，特别是通过愈伤组织形成的花粉植株，染色体的数目常常会出现变化（常出现染色体数目倍性的变化，主要原因是营养核和生殖核融合造成的）
诱导丛芽或胚状体培养基配方：MS培养基中加GA (0.1mg/L)
IBA (0.5mg/L)和ＢＡ(1mg/L);
诱导生根培养基配方：MS培养基各成分用量减半，添加IAA (1.5mg/L)
5、植物组织培养技术与花药培养技术的对比：
项目 相同点 不同点
植物组织培养技术 离体的植物组织经脱分化形成愈伤组织，再分化成丛芽，诱导出根，然后进行移栽。 外植体为体细胞，染色体数无需加倍。
花药培养技术 取材为花药，培养的为单倍体幼苗，植株弱小，高度不育，必须用秋水仙素处理，使染色体加倍，恢复正常植株的染色体数，产生纯种。
三、结果分析与评价
1、你能通过镜检找到处于适宜的发育期的花粉吗？
选材是否成功是花药培养成功的关键，应通过显微镜观察处于适宜发育期的花粉。
2、你的花药培养被污染了吗？如有请分析产生原因。
如果出现污染现象，说明某些操作步骤，如培养基灭菌、花蕾消毒或接种等有问题。
3、你接种的花药是否长出了花粉愈伤组织或胚状体？
如长出愈伤组织或胚状体，花药培养的第一步就成功了。要适时转换培养基，以便愈伤组织或胚状体进一步分化成再生植株。
答：F2代紫色甜玉米的基因型组成可能为Aasusu或AAsusu。如果运用常规育种方法，将F2代中的紫色甜玉米与白色甜玉米（aasusu）进行测交，可以选择出基因型为AAsusu纯种紫色甜玉米。但这种方法比较繁琐，耗时也较长，需要至少三年的选种和育种时间。如果利用花药培养的技术，在F1代产生的花粉中就可能有Asu的组合，再将花粉植株进行染色体加倍，就可以直接得到紫色甜玉米的纯合体（AAsusu）。这种方法可以大大缩短育种周期。
课后练习：P40
1、紫色、不甜玉米（基因型为AASuSu）和白色、甜玉米（基因型为aasusu）杂交（Su和su代表一对等位基因），得到F1（AaSusu）再进行自交，F2会有紫色甜玉米的表型产生，如运用常规育种方法，应如何筛选出纯和紫色甜玉米？（运用单倍体育种呢？）
课后练习：P40
2、你能说出植物组织培养技术与花药培养技术的异同吗？你能举例说明组织培养技术在生产中的实际应用吗？
同：培养基配制方法、无菌操作技术及接种操作基本相同不同： ①花药培养选材很重要，需要准备适宜时期的花蕾
②花药裂开后释放出的愈伤组织或胚状体要及时更
换培养基
③花药培养对培养基配方要求更严格，这些都使得
花药培养的难度更大；
组织培养的应用：微型（快速）繁殖、作物脱毒、人工种子、单倍体育种、突变体育种、基因工程育种、植物体细胞杂交、细胞产物的生产如人参皂甙粉等。