人教版高中生物选修1专题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数（37张PPT）

(共37张PPT)
课题背景知识——

1、尿素的利用：
尿素[有机物，CO(NH2)2] 一种重要的农业氮肥，尿素不能直接被植物的根吸收。
土壤中的某些细菌等可将尿素分解成氨之后才能被植物利用。
白色晶体
课题背景知识——

2、细菌利用尿素原因：
土壤中的某些细菌能分解尿素是因为它们能合成脲酶。能将尿素分解为CO2和NH3。
芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌，及某些真菌和放线菌也能分解尿素。(了解)
课题背景知识——

2、细菌利用尿素原因：
土壤中的某些细菌能分解尿素是因为它们能合成脲酶。能将尿素分解为CO2和NH3。
?
NH3不能直接吸收，植物吸收其中的N是以NH4+和NO3-形式吸收的。NH3的水溶性高，在水中形成NH4+；土壤里的微生物(如硝化细菌)把NH3氧化为NO3-，然后以NO3-的形式被植物吸收。(记)
选修1 专题2
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
[课题目的]
1.从土壤中分离出能分解尿素的细菌
2.统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
一.研究思路
1.菌株筛选——
(1)实例：
DNA多聚酶链式反应(PCR—体外DNA复制技术)，此项技术要求使用耐高温(93℃)的DNA聚合酶。去哪寻找这种酶？
耐高温的酶
→耐高温的生物体
→耐高温的环境
(如热泉)
美国微生物学家布鲁克于1966年在美国黄石国家公园的一热泉发现了耐热Taq细菌。(了解)
一.研究思路
1.菌株筛选——
(1)实例：
DNA多聚酶链式反应(PCR—体外DNA复制技术)，此项技术要求使用耐高温(93℃)的DNA聚合酶。去哪寻找这种酶？
耐高温的酶
→耐高温的生物体
→耐高温的环境
(如热泉)
通过自然选择，热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物而保留了耐热Taq细菌。(理)
一.研究思路
1.菌株筛选——
(1)实例：
DNA多聚酶链式反应(PCR—体外DNA复制技术)，此项技术要求使用耐高温(93℃)的DNA聚合酶。去哪寻找这种酶？
耐高温的酶
→耐高温的生物体
→耐高温的环境
(如热泉)
启示：寻找目的菌，要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
一.研究思路
1.菌株筛选——
(2)实验室中微生物的筛选原理：
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
(3)分解尿素细菌的筛选：
一.研究思路
1.菌株筛选——
(3)分解尿素细菌的筛选：(P22)
a.该培养基，为微生物提供碳源和氮源的分别是什么物质？
碳源——葡萄糖；
氮源——尿素
b.该培养基为什么能筛选出分解尿素的细菌？
以尿素作为培养基的唯一氮源
选择培养基
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
上述物质溶解后，蒸馏水定容1000mL
一.研究思路
1.菌株筛选——
(3)分解尿素细菌的筛选：(P22)
a.该培养基，为微生物提供碳源和氮源的分别是什么物质？
碳源——葡萄糖；
氮源——尿素
b.该培养基为什么能筛选出分解尿素的细菌？
以尿素作为培养基的唯一氮源
常见的选择培养基——(记)
1培养基在高温环境中培养，分离出耐高温的微生物；
2以石油为唯一碳源的培养基，分离消除石油污染菌体；
3无有机碳源的培养基，分离自养型微生物；
4无氮源培养基，分离出固氮微生物；
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
上述物质溶解后，蒸馏水定容1000mL
1.菌株筛选——
(3)分解尿素细菌的筛选：(P22)
c.如何证明该培养基对土壤中分解尿素的细菌具有选择作用呢？
需要进行对照实验，对照组应该是用普通的牛肉膏蛋白胨固体培养基。
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
上述物质溶解后，蒸馏水定容1000mL
牛肉膏蛋白胨培养基
牛肉膏 5g
蛋白胨 10g
NaCl 5g
琼脂 20g
上述物质溶解后，蒸馏水定容1000mL
证明此培养基具有选择作用——
培养基类型 接种(土样) 培养条件 结果
以尿素为唯一氮源的培养基
(实验组) 是 适宜相同 平板上的菌落——能分解尿素的细菌
牛肉膏蛋白胨固体培养基
(对照组) 是 适宜相同 平板上的菌落——绝大多数细菌（菌落更多）
一.研究思路
2.统计菌体数目——
回顾必修三P68探究“培养液中酵母菌种群数量变化”实验，怎样对试管中的酵母菌培养液进行计数？

(1)显微镜直接计数法：
采用抽样检测的方法，吸取少量培养液，滴在血球计数板上，利用显微镜观察并计数后，在估算出试管中的酵母菌总数。
不能区分死菌与活菌；
不适于对运动菌体的计数；
个体小的细菌在显微镜下
难以观察等；
？
一.研究思路
2.统计菌体数目——
(2) 稀释涂布平板法：(活菌计数法之一)
a.理论依据(原理)：
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。 (记)
一.研究思路
2.统计菌体数目——
(2) 稀释涂布平板法：(活菌计数法之一)
b.计数原则：
为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液分别涂布在不同的平板上培养，再选择菌落数在30～300的平板进行计数。(记)
实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。
其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中出现了错误，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。需要重新实验。
实验结果合理
思考：下列同学在稀释倍数为106的菌液中取0.1mL涂布平板，获得的菌落数如下，你认为甲、乙、丙同学的实验结果，哪个合理？
操作 改进/不需改进
甲 涂布一个平板，统计的菌落数为230。

乙 涂布了三个平板，统计的菌落数分别为21、212和256，该同学以这三个平板菌落数的平均值163作为统计结果。
丙 涂布了三个平板，统计的菌落数分别为180、200和220，该同学以这三个平板菌落数的平均值200作为统计结果。
一.研究思路
2.统计菌体数目——
(2) 稀释涂布平板法：(活菌计数法之一)
c.计算公式：
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
C：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；
V：涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)；
M：稀释倍数。
一.研究思路
某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL） ( )
A. 2.34×108
B. 2.34×109
C. 234
D. 23.4
B
一.研究思路
2.统计菌体数目——
(2) 稀释涂布平板法：(活菌计数法之一)
d.计数结果：
统计的菌落数往往比活菌实际数低。原因是当2个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。(记)
一.研究思路
2.统计菌体数目——
(2) 稀释涂布平板法：
要点提醒：(记)
①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。
②为使结果接近真实值可将同一稀释度涂三个或三个以上的平板中，计算菌落平均数。
③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。
思考：在做本课题实验时，A同学平板上菌落数与其他同学明显不同，试分析A同学的实验结果出现的原因？
原因：
1培养基被杂菌污染；
2操作有问题；
3选择的土样不同
如何找出原因？
一.研究思路
3.设置对照——
(1)对照实验：必修一P79
除了一个因素以外，其他条件都相同的实验。一般要设置对照组和实验组
对照组
自变量：反应条件
因变量：过氧化氢分解速率
无关变量：反应物浓度、体积等
一.研究思路
3.设置对照——
(1)对照实验：必修一P79
除了一个因素以外，其他条件都相同的实验。
(2)设置对照主要目的：P22
排除实验组中非测试因素(无关变量)对试验结果的影响，提高实验结果的可信度。
思考：在做本课题实验时，A同学平板上菌落数与其他同学明显不同，试分析A同学的实验结果出现的原因？
原因：
1培养基被杂菌污染；
2操作有问题；
3选择的土样不同
？
取A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为对照。以证明培养基是否受到污染。
如无菌落，说明培养基没有污染，如有菌落，说明培养基受到污染。
思考：在做本课题实验时，A同学平板上菌落数与其他同学明显不同，试分析A同学的实验结果出现的原因？
原因：
1培养基被杂菌污染；
2操作有误；
3选择的土样不同
？
取与A同学相同的土样进行实验，与A的实验结果进行对照。如与A同学的菌落数相似，说明土样的不同；如与其他同学结果相似，说明A操作有问题。
二.实验操作
二.实验操作
注意事项——（理解）
1从肥沃、湿润的土壤中取样(绝大多数细菌分布在距表层土3—8cm土壤层) ，故先铲去表层土，再取样。
2取土样的小铁铲和盛土样的信封在使用前都要灭菌。
3应在火焰旁称取土壤。
避免自然环境中(如空气)的微生物进入土壤，干扰实验。
？
二.实验操作
相同的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。(理解)
？
二.实验操作
10g土样 90ml无菌水
101
注意事项—分离不同的微生物采用不同的稀释度
稀释原因：不同微生物在土壤中含量不同
稀释目的：保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板 (记)
土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。
二.实验操作
10g土样 90ml无菌水
101
注意事项—分离不同的微生物采用不同的稀释度
稀释原因：不同微生物在土壤中含量不同
稀释目的：保证获得菌落数在30～300之间，适于计数的平板 。 (记)
涂布操作——(记)
真菌稀释倍数 (102、103、104)
放线菌稀释倍数 (103、104、105)
细菌稀释倍数 (104、105、106)
二.实验操作
涂布操作——(记)
真菌稀释倍数 (102、103、104)
放线菌稀释倍数 (103、104、105)
细菌稀释倍数 (104、105、106)
注意事项——1稀释倍数为 104—106的稀释液，需涂3个选择培养基和1个牛肉膏蛋白胨培养基。
二.实验操作
注意事项——2实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养日期、稀释度等。
二.实验操作
如果得到了2个或2个以上菌落数目在30—300的平板，则说明稀释操作比较成功，可以对菌落进行计数。(记)
(1)培养：
(2)观察与计数：
一般来说，在一定的培养条件下(相同的培养基、温度及培养时间)，同种微生物表现出稳定的菌落特征。(记)
二.实验操作
每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。(记)
(1)培养：
(2)观察与计数：
三.课题延伸
?
鉴别培养基
分解尿素的细菌鉴定
分解尿素的菌体能合成脲酶，可将尿素分解为氨。氨会使培养基的碱性增强，PH升高。通过检测培养基的PH变化来判断。(理解)
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。(记)
[2019年全国Ⅱ卷]物质W是一种含氮有机物，会污染土壤。W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解W的细菌（目标菌）。回答下列问题。
（1）要从土壤中分离目标菌，所用选择培养基中的氮源应该是______。
（2）在从土壤中分离目标菌的过程中，发现培养基上甲、乙两种细菌都能生长并形成菌落（如图所示）。如果要得到目标菌，应该选择________菌落进一步纯化，选择的依据是__________________________________。
W
乙
乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W
[2019年全国Ⅱ卷]物质W是一种含氮有机物，会污染土壤。W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解W的细菌（目标菌）。回答下列问题。
（3）土壤中的某些微生物可以利用空气中的氮气作为氮源。若要设计实验进一步确定甲、乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，请简要写出实验思路、预期结果和结论，即________________________________________
_______________________________。
（4）该小组将人工合成的一段DNA转入大肠杆菌，使大肠杆菌产生能降解W的酶（酶E）。为了比较酶E与天然酶降解W能力的差异，该小组拟进行如下实验，请完善相关内容。
①在含有一定浓度W的固体培养基上，A处滴加酶E的缓冲液，B处滴加含有相同浓度天然酶的缓冲液，C处滴加_______，三处滴加量相同。
②一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，说明___________；若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明___________。
，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源
将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若细菌能生长
缓冲液
缓冲液不能降解W
酶E与天然酶降解W的能力相近