2．1微生物的实验室培养（共60张PPT）

(共60张PPT)
冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒以及中东呼吸综合征（MERS）和严重急性呼吸综合征（SARS）等较严重疾病。
2019新型冠状病毒（SARS-CoV-2）
主要的传播途径还是呼吸道飞沫传播、接触传播和气溶胶，和粪—口等传播途径尚待进一步明确。
传播途径
专题2 微生物的培养与应用
微生物
类群
真菌
病毒
原生生物：单细胞的动植物
如草履虫、变形虫、衣藻等
无细胞结构
如细菌、放线菌等
原核
微生物基础知识
特点：结构相当简单,个体多数十分微小。
大肠杆菌
霍乱弧菌
小技巧：
凡是“菌”前面有“杆”、“球”、 “弧” 、 “螺旋”都是细菌。
金黄色葡萄球菌
①原核生物
②真核生物
衣藻
原生生物
单细胞:酵母菌



多细胞
霉菌:青霉、曲霉
大型真菌：如蘑菇、灵芝等
真菌
②真核生物
是由一个核酸分子（DNA或RNA）与蛋白质构成的非细胞形态的营寄生生活的生命体。
③病毒
课题1 微生物的实验室培养
（以培养大肠杆菌为例）
在实验室中培养纯净的微生物,培养关键？
一、基础知识分析
（一）培养基
——指微生物生存的环境和营养物质
1.基本成分：
思考1：微生物“吃”什么？
水、碳源、氮源、无机盐
无机碳源：
有机碳源：
CO2、CO32-、HCO3-
牛肉膏、蛋白胨等
自养微生物
异养微生物
凡能为微生物代谢提供碳元素的物质。
①参与合成有机物
②异养微生物的能源物质
⑴.概念：
⑵.来源：
⑶.作用：
碳源
凡能为微生物代谢提供氮元素的物质。
主要用于合成蛋白质、核酸及含N的代谢产物。
氮源
⑴.概念：
⑵.来源：
⑶.作用：
水：是生命活动所必需的，生物体内含量最多的化合物
无机盐：为微生物提供除碳、氮以外的元素
无机氮源：
有机氮源：
NH4＋、N2、NO3-（为硝化细菌提供N源和能源）
牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素、氨基酸等
注：含CHON的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源
思考2：为什么大多数培养基都有这四类物质？
⑶.常见的生长因子：
⑴.概念：
⑵.作用：
微生物生长不可缺少的微量有机物。
酶和核酸的组成成分。
维生素、氨基酸、碱基等。
有时会加一定量的氯化钠以维持一定的渗透压
2.特殊营养（生长因子）：
3.pH、氧气的需求：
细菌偏碱，真菌偏酸
配制原则
⑴目的要明确：
⑵营养全面、浓度适宜、比例恰当
⑶适宜的pH值：
有机碳源
异养型：
根据微生物的种类、培养目的选择原料
自养型：
不加碳源
细菌偏碱，真菌偏酸
（CO2碳源）
（为维持的相对恒定，可在培养基中加入缓冲剂）
不加凝固剂
加凝固剂，如琼脂
工业生产，大量繁殖
菌种分离、鉴定、计数
由天然成分配制成，成分不明确
工业生产，降低成本
由已知成分配制成，成分明确
菌种分离、鉴定
添加（或缺少）某种化学成分
菌种的分离
加入某种指示剂或化学药品
菌种的鉴别
选择培养基
液体培养基
半固体培养基
固体培养基
菌种保存
4.种类
鉴别培养基
标准 培养基种类 特点 用途
物理性质


化学成分 天然培养基
合成培养基
功能

选择培养基的应用
加入青霉素的培养基——分离酵母菌、霉菌等真菌
加入高浓度食盐的培养基——分离金黄色葡萄球菌
不加氮源的无氮培养基——分离固氮菌
不加含碳有机物的无碳培养基——分离自养型微生物
鉴别培养基的应用
伊红美蓝培养基——鉴别大肠杆菌
大肠杆菌在伊红美蓝培养基上典型特征：
紫黑色，并带有金属光泽
单个
或少数菌体
2.特征：
大小、形状、光泽度、
颜色、透明度等。
3.功能：
1.定义：
菌落
鉴定菌种的重要依据
几种菌落及其形态
金黄色葡萄球菌菌落
路邓葡萄球菌
牛肉膏蛋白胨培养基 是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。
分析营养构成？
碳源、氮源、磷酸盐和维生素
碳源、氮源和维生素
无机盐
氢元素、氧元素
1. 概念
无菌技术又称无菌操作，是指通过一定的物理、化学方法，防止实验室培养物被外来微生物污染，保持微生物的纯净培养的技术。
范围：
①实验操作空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。
④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
②用于培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。
③实验操作应在酒精灯火焰附近进行。
无菌操作的目的是：防止外来杂菌的入侵
（二）无菌技术
2.消毒与灭菌：
原理：使蛋白质变性来抑制微生物的生命活动或杀死微生物
(二)、无菌技术：
防止外来杂菌的污染
较为温和理化方法，
杀死部分有害菌体
（不包括芽孢、孢子）
强烈的理化方法，
杀死所有微生物
（包括芽孢、孢子）
消毒 灭菌
定义
方法
指某些细菌(如芽孢杆菌等)在一定条件下细胞质高度浓缩脱水所形成的一种抗逆性很强的球形或椭圆形的休眠体。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。如某些细菌的芽孢煮沸3小时才死亡。每个细菌仅形成一个芽孢。
指细菌、真菌、原生动物和植物等产生的一种有繁殖作用的生殖细胞。正常情况下不需要两两结合就可以由单个细胞直接发育成新个体。
芽孢
孢子
①煮沸消毒法：100℃煮沸5-6min。
②巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或 80℃下煮15min。
（适用于牛奶、啤酒、红酒、酱油等不耐高温的液体）
③化学药剂消毒法：如用70%酒精进行皮肤消毒；
氯气消毒水源，适量喷洒石碳酸或煤酚皂溶液消毒。

④紫外线消毒
消毒的方法：
常用的消毒与灭菌的方法
紫外线照射30min
微生物的接种工具 (接种环、接种针等；接种过程中试管口或瓶口也可以灼烧灭菌。
灭菌的方法
?灼烧灭菌
?干热灭菌
耐高温需保持干燥的物品璃器皿
（吸管、培养皿)和金属用具
160～170℃ 1～2小时
100kPa 121℃
15-30min
?高压蒸汽灭菌
培养基、无菌水，
2.消毒与灭菌：
(二)、无菌技术：
防止外来杂菌的污染
较为温和理化方法，
杀死部分有害菌体
（不包括芽孢、孢子）
强烈的理化方法，
杀死所有微生物
（包括芽孢、孢子）
①煮沸消毒法：
②巴氏消毒法：
③化学药剂消毒法：
④紫外线消毒
?灼烧灭菌
?干热灭菌
?高压蒸汽灭菌
消毒 灭菌
定义
方法
1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？
2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。
（1）培养细菌用的培养基与培养皿
（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管
（3）实验操作者的双手
有效避免操作者自身被微生物感染。
（1）（2）需要灭菌；（3）需要消毒
旁栏思考：
思考：微生物实验室培养的基本操作程序
1、器具的灭菌
2、培养基的配制
3、培养基的灭菌
4、倒平板
5、微生物接种
6、恒温箱中培养
7、菌种的保存
（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
（二）纯化大肠杆菌
二、实验操作——大肠杆菌的纯化培养
（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
配制培养基的操作步骤为:
计算→称量→溶化并调pH→灭菌→倒平板→无菌检查
牛肉膏蛋白胨固体培养基配方
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
将上述物质溶解后，添加水，定容至1000mL
1.计算：
2.称量：
依配方计算100mL培养基所需各成分的用量
玻棒挑取牛肉膏于称量纸上称取。
牛肉膏：0.5g 蛋白胨：1.0g、NaCl：0.5g琼脂：2.0g
注意：称取牛肉膏和蛋白胨时动作要迅速，称后要及时盖上瓶盖

3.溶化并调PH：
牛肉膏、称量纸 、少量水加入烧杯→加热溶解→取纸→蛋白胨、NaCl→搅拌溶解→→琼脂→搅拌熔化→调pH并补水至100mL
牛肉膏黏稠，保证粘附在称量纸上的牛肉膏也溶于水中，减少误差
作为凝固剂
防止琼脂糊底而导致烧杯破裂
培养基装入锥形瓶，加棉塞，包牛皮纸扎紧，高压蒸汽灭菌；
防止污染和挥发
灭菌时避免水蒸气浸湿棉塞，取出培养基时，也起到隔绝空气中杂菌的作用
4.灭菌：
培养皿5～8套作一包，放于干热灭菌箱内灭菌。
5.倒平板：
培养基冷却至约50℃左右时
6.无菌检查：
37℃倒置培养24～48h，观察是否有微生物生长。
②灼烧灭菌
①左手拔出棉塞
③倒入培养基盖盖
④冷却倒置
用手触摸锥形瓶，感觉刚刚不烫手时。
2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
讨论
1.培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时，才能用来倒平板,为什么?你用什么办法来估计培养基的温度？
原因：温度过高，太烫，不易操作；温度过低，培养基易凝固。
4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
最好不要用。因为空气中的微生物可能在此滋生。
3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠。将平板倒置，既可以防止培养基表面的水分过快挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
5.如何检验制备的培养基灭菌是否合格？
如果未接种的培养基在恒温箱中保温1—2天，无菌落生长，说明培养基的制备成功；否则需要重新制备。
微生物的分离与纯化：
从混杂微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程，称为微生物的分离与纯化
利用固体培养基，将混杂细菌分散或稀释成单个细胞，使其繁殖成单个菌落
二、实验操作——大肠杆菌的纯化培养
（二）纯化大肠杆菌
纯化大肠杆菌的方法：平板划线法和稀释涂布平板法
1.微生物接种方法：
①平板划线法
②稀释涂布平板法
（1）平板划线法
通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体称菌落。
1.将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环_______
2.在_____旁冷却接种环，并打开盛有菌液的试管的棉塞
3.将试管口通过火焰
4.将已______的接种环伸入菌液中沾取一环菌液
6.左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划__________条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。
5.将试管口通过火焰，并塞上棉塞
火焰
冷却
三至五
7.灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的_______开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。
末端
烧红
8.将平板_____放入37℃恒温培养箱中培养
12-24小时.

倒置
划3个平板
1个不划线
（重复实验）
（空白对照）
思考：平板划线操作的整个过程，是如何实现纯化大肠杆菌的？
平板划线操作
区域一
区域二
区域三
区域四
区域五
菌种多
菌种少
菌种减少
菌种减少
菌种减少
菌种最少
注意：平板划线法的要点：
1、接种前，每次划线前及接种后都要灼烧接种环
2、接种环灼烧后等其冷却后再进行划线
3、第二次及其之后的划线操作，总是从上一次划线的末端开始划线
1、为什么在操作的第一步要灼烧接种环？每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
①避免接种环上可能存在的微生物污染培养物
②杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。
③划线结束时灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
讨论
2、在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
避免接种环温度太高，杀死菌种
3、在做第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面,进行培养。

在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落

注：如果在接种的培养基上生长的菌落颜色、形状、大小基本一致，说明接种操作是符合要求的.
（2）稀释涂布平板法：
101
102
103
104
105
106
①梯度稀释菌液：
（2）稀释涂布平板法：
不超过0.1ml
②涂布平板：
①梯度稀释菌液：
将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
均匀地涂布在培养基表面。
（2）稀释涂布平板法：
待酒精燃尽后冷却8～10s
不超过0.1ml
各梯度分别涂布3个平板
1个不涂布作空白对照
备注：划线分离方法简单；涂布分离，易形成单菌落，且可计数，但操作复杂些。
2.培养：
放入37℃恒温箱中培养12h～24h。
稀释涂布平板法的要点
1、用移液管吸取菌液之前先摇匀
3、所有操作都应在火焰附近进行
2、涂布器从酒精中取出后，要在火焰上将其上的酒精烧掉
涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？
应从操作的各个细节保证“无菌”。
例如：酒精灯与培养皿的距离要合适、
吸管头不要接触任何其他物体、
吸管要在酒精灯火焰周围等等。
讨论
⑴平板划线法：
⑵稀释涂布平板法：
2.培养：
将接种后的培养基和一个未接种的培养基
放入37℃恒温箱中培养12h～24h后，
观察并记录
比较纯化微生物的接种方法：
接种环在固体培养基表面连续划线
①梯度稀释菌液：
②涂布平板：
可以观察菌落特征，
对混合菌进行分离
可以观察菌落特征，
可以计数
不能计数
较麻烦，平板不干燥效果不好
好氧菌
厌氧菌
兼性厌氧菌
比较 平板划线法 稀释涂布平板法

关键操作
优点
缺点
适用范围
1.培养未接种培养基的作用是对照，若有菌落形成，说明。培养基灭菌不彻底。

2.在肉汤培养基上，大肠杆菌菌落呈白色，为圆形，光滑有光泽，边缘整齐。

3.培养12h和24h后的菌落大小不同；菌落分布位置相同。原因是时间越长，菌落中细菌繁殖越多，菌落体积越大；菌落的位置不动，但菌落数增多。

4.原因有培养基灭菌不彻底或杂菌感染等。

结果分析与评价
（三）菌种的保藏：
温度
频繁适用的菌种
长期保存的菌种
固体斜面培养基
液体培养基
4℃冰箱
-20℃的冷冻箱
微生物的培养
基础
知识
实验操作
结果分析与评价
培养基
定义：
分类：
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配置出供其生长繁殖的营养物质
固体培养基
液体培养基
无菌技术
培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法
定义：
消毒与灭菌
常用灭菌方法
制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
纯化大肠杆菌
课堂小结
1、有关微生物营养物质的叙述中，正确的是（ ）
A.是碳源的物质不可能同时是氮源
B.凡碳源都提供能量
C.除水以外的无机物只提供无机盐
D.无机氮源也能提供能量
D
学以致用
代谢类型
光能无机营养(光能自养型)
光能有机营养(光能异养型)
化能无机营养(化能自养型)
化能有机营养(化能异养型)
光
光
无机物
有机物
无机物
有机物
无机物
有机物
二氧化碳
二氧化碳及简单有机物
二氧化碳
有机物
大多数已知细菌和全部真核微生物
硝化细菌
氢细菌
紫色非硫细菌
蓝细菌
绿色硫细菌
藻类
营养类型 能源 氢的供体 基本碳源 微生物举例




2、下图甲、乙是微生物接种常用的两种方法，请回答相关问题：





(1)图甲是利用________法进行微生物接种，图乙是利用________________法进行微生物接种。这两种方法所用的接种工具分别是________和________；对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是________和酒精消毒。
平板划线
稀释涂布平板
接种环
涂布器
灼烧灭菌
(2)接种操作为什么一定要在火焰附近进行？
_____________________________
(3)接种后，在固体培养基上培养细菌时为什么进行倒置培养？
_________________________________________。
(4)如图是采用上述接种方法接种后培养的效果图解，其接种方法是________(填图甲或图乙)。
火焰附近存在着无菌区域。
避免培养过程产生的水分影响微生物的生长
图乙