2011届江西高考生物复习研讨会资料【实验九】dna的粗提取与鉴定

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【实验九】DNA的粗提取与鉴定
陈小珺（江西省赣州市第三中学 341000）
1 教学建议
在本实验的教学中，教师应注意以下几点。
1.1 实验材料必须准备充足。本实验所用的实验材料是鸡血细胞液,由活鸡的鲜血经沉淀后获得。每组(2个学生)需用5 mL 鸡血细胞液,则每班(50人)至少需要130 mL,而鸡血细胞液与鸡血的体积比为1:3,这样每班至少需要390 mL 鸡血细胞液。宰杀1只中等大小的活鸡,一般可得120 mL 左右的鲜血,因此,1个班实验需要买4只活鸡。也可以到市场售活鸡处去索取鸡血,但所带烧杯中必须提前放入抗凝剂。（每100ml鸡血加入3g柠檬酸钠）
1.2 盛放鸡血细胞液的容器,最好是塑料容器。因为鸡血细胞破碎后释放出的DNA,容易被玻璃容器吸附,由于细胞内DNA的含量本来就比较少,再被玻璃容器吸附去一部分,提取到的DNA就会更少。
1.3 获取较纯净的DNA的关键步骤。
1.3.1 充分搅拌鸡血细胞液：将鸡血细胞液与蒸馏水混合以后,必须用玻璃棒沿一个方向快速搅拌,使鸡血细胞加速破裂,并释放出DNA。
1.3.2沉淀DNA时必须用冷酒精：体积分数为95%的酒精在冰箱中至少存放24 h。
1.3.3正确搅拌含有悬浮物的溶液实验步骤3、5、7,都需要用玻璃棒搅拌。教师应提醒学生注意,在进行步骤3、5时,玻璃棒不要直插烧杯底部,而且搅拌要轻缓,以便获得较完整的DNA分子。进行步骤7时,要将玻璃棒插入烧杯中溶液的中间,用手缓慢转动5 min。
2 实验原理的补充介绍
2.1 DNA的释放　本实验用鸡血细胞做实验材料有两个原因。一是因为鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水胀破。DNA位于鸡血细胞的细胞核中,正常情况下不会释放出来。为了使DNA从细胞核中释放出来,实验中采用了向鸡血细胞液中加入蒸馏水并且搅拌的方法。蒸馏水对于鸡血细胞来说,是一种低渗液体,水分可以大量进入血细胞内,使血细胞破裂。同时,再加上搅拌的机械作用,就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂),于是释放出DNA,当然也有RNA。但是,释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起。
2.2 将DNA与蛋白质分离　根据二者的特性,即在浓度较高的氯化钠溶液(物质的量浓度为2 moL/L )中,核蛋白容易解聚,游离出DNA。而DNA在浓度较高的氯化钠溶液中的溶解度很高,Na+与带负电的DNA结合成DNA钠盐。这时DNA在溶液中呈溶解状态。
2.3 DNA的析出与获取　　利用DNA在浓度较低的氯化钠溶液中溶解度小的原理,向含有DNA的浓度较高的氯化钠溶液中加入大量(300 mL )蒸馏水,稀释氯化钠溶液,使DNA的溶解度下降,而蛋白质的溶解度增高(这就是蛋白质的盐溶现象),从而使二者分离。这时,加上不停地搅拌,溶解度下降的DNA逐渐呈丝状物。再通过过滤,滤去蛋白质,就可以获取DNA的黏稠物了。如果采用离心法则更好,用4 000 r/min 的旋转频率,离心15 min ,除去上清液(含有蛋白质),留下的沉淀物中含DNA。
2.4 DNA的再溶解　　再用较高浓度的氯化钠溶液去溶解DNA黏稠物。
2.5 DNA的沉淀和浓缩　　除去了蛋白质的核酸溶液,必须再进一步沉淀和浓缩。最常用的方法是酒精沉淀法。就是将含有Na+的DNA溶液,加入到相当于其两倍体积的体积分数为95%冷酒精溶液中（实验一般要求采用预冷的95％的乙醇，但对比结果显示，常温下的乙醇溶液也可产生明显效果。从理论上分析，预冷的乙醇溶液具有以下优点。一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是降低分子运动，易于形成沉淀析出；三是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。）,混匀以后可以使DNA沉淀、浓缩,形成含杂质较少的DNA丝状物,悬浮于溶液中。如果出现的丝状物较少,可以将此混合液再放入冰箱中冷却几分。浓缩后的DNA丝状物,可以用缓缓旋转玻璃棒的方法卷起(因为玻璃棒有吸附DNA的作用)。
2.6 DNA的鉴定　本实验中鉴定DNA的方法为二苯胺法。
二苯胺法的原理是:DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成ω-羟基-γ酮基戊醛,它再和二苯胺作用而显现蓝色(溶液呈浅蓝色)。
鉴定时溶液蓝色的深浅,与溶液中DNA含量的多少有关。
3 几种新材料的DNA粗提取与鉴定介绍
3.1新鲜菜花(或蒜黄、菠菜)DNA粗提取与鉴定
一.材料用具
　　新鲜菜花(或蒜黄、菠菜)。
　　塑料烧杯,量筒,玻璃棒,尼龙纱布,陶瓷研钵,试管,试管架,试管夹,漏斗,酒精灯,石棉网,三角架,火柴,刀片,天平。　
　　研磨液,体积分数为95%的酒精溶液,二苯胺试剂,蒸馏水。 　
二.方法步骤
　　(1)DNA的粗提取
　　①准备材料 将新鲜菜花和体积分数为95%的酒精溶液放入冰箱冷冻室,至少24 h。
　　②取材 称取30 g菜花,去梗取花,切碎。　　
　　③研磨 将碎菜花放入研钵中,倒入10 mL研磨液,充分研磨10 min 。　
　　④过滤 在漏斗中垫上尼龙纱布,将菜花研磨液滤入烧杯中(有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心,用1 000r/min的旋转频率,离心25 min,取上清液放入烧杯中)。在4S冰箱中放置几分后,再取上清液。
　　⑤加冷酒精 将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为95%的冷酒精溶液中,并用玻璃棒缓缓地轻轻搅拌溶液(玻璃棒不要直插烧杯底部)。沉淀35 min后,可见白色的DNA絮状物出现。用玻璃棒缓缓旋转,絮状物会缠在玻璃棒上。
　　(2)DNA的鉴定
　　①配制二苯胺试 剂取0.1 mL B液,滴入到10 mL A液中,混匀。
　　②鉴定 取4 mL DNA提取液放入试管中,加入4 mL 二苯胺试剂,混匀后观察溶液颜色(不变蓝)。用沸水浴(100 ℃)加热10 min 。在加热过程中,随时注意试管中溶液颜色的变化(逐渐出现浅蓝色)。
3.2洋葱DNA粗提取实验与鉴定（值得推介，它取材容易，操作简便，效果明显。）
一、实验原理
洗涤剂等去污剂可以溶解细胞的细胞壁，破坏细胞膜，同时也能使蛋白质变性。当细胞
壁破坏后，细胞释放出核酸与蛋白质形成的复合物——核糖核蛋白(RNP)和脱氧核糖核蛋白(DNP)，这两种复合物在不同电解质溶液中的溶解度有较大差异。当NaCl浓度达到0.14mol／L时，DNP溶解度约为纯水中溶解度的1％，但RNP则不一样，在0.14mol／L NaCl溶液中，DNP溶解度很低，而RNP的溶解度仍相当大，因此在制备DNA时，利用0.14mol／L稀盐溶液使DNP与RNP分开。
去除蛋白质后的核酸盐溶液，再利用其不溶于有机溶剂的性质，但细胞中的其他物质则可以溶于有机溶剂，应用适当浓度的有机溶剂 (如乙醇)使DNA呈絮状沉淀析出（本实验加入酒精后使食盐浓度接近0.14mol/L）。在溶液中，DNA链略带负电荷，而盐离子可被吸引到DNA的负电荷上，中和这些负电荷，因此就能够使DNA片段聚合在一起，形成絮状粘稠物质。利用这一原理，就可以用酒精萃取DNA。
DNA与二苯胺作用生成蓝色沉淀用来鉴定 DNA。
二. 材料：洋葱、洗洁精、食盐、95％酒精、蒸馏水、
0.015 mol／L的NaCl溶液：称取0.88g NaCl，投入1000ml容量瓶中，加水到所需体
积的刻度线上，溶解后成0.015 mol／L氯化钠溶液。
二苯胺试剂：1 g重结晶的二苯胺溶于100ml冰乙酸（A.R.）中，再加10ml过氯酸，
临用前加入1.0ml 16%的乙醛，试剂应为无色，
三.器具：
匀浆机或研钵、纱布、漏斗、烧杯、玻璃棒、量筒、滴管、试管、天平。
四.方法步骤
称取100 g洋葱，切碎，放进搅拌机或研钵中
加入100ml洗洁精
充分搅拌或研磨
将研磨液用漏斗和两层纱布过滤到烧杯中
加入1g食盐，搅拌均匀
量取上述澄清的洋葱液50ml
加入70ml的95％酒精
轻轻摇动或用玻璃棒轻轻搅拌
白色纤维状粘稠物质析出，即DNA
用玻璃棒可将其轻轻卷起，放入1号试管
搅拌溶解后，加入4ml二苯胺试剂
混合均匀，在沸水浴中加热 3～8min，观察颜色的变化。
五. 实验注意事项
1)材料必须充分匀浆或研磨，否则洋葱细胞没有完全破碎，影响实验效果；
2)加入酒精后摇动或搅拌时一定要轻缓，否则会破坏DNA，以至于看不到；
3)DNA鉴定时，二苯胺最好现配现用，否则二苯胺会变成浅蓝色或绿色，则不能使用。
4 几种新材料的DNA粗提取介绍
4.1 细菌DNA提取方法（尤其对有荚膜的细菌）
方法一
1．种子加入2ml盛有4℃预冷的抽提缓冲液（8M LiCl，2% b-巯基乙醇仅针对RNA）离心管中，4℃过夜；
2．离心4s，转移上清到2ml新管中（针对植物）；
3．离心，12,000rpm，30min，4℃（仅针对RNA）；
4．弃上清液，用70％乙醇洗沉淀，风干；
5．溶解上述沉淀于缓冲液（5%SDS，10mMNaCl，25mM EDTA，10mM Tris-HCl，pH7.6，2％巯基乙醇）中；
6．加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）
7．离心12,000rpm，10min，转移上清到新管中.
8．加入等体积氯仿/异戊醇(24：1)
9．离心12,000rpm，10min，转移上清到新管中
10．分装至两支1.5ml离心管中，各加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），－200C沉淀；
11．离心12,000rpm，10min；
12. 弃上清，70％乙醇洗，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml 水中。
方法二
1．试剂：抽提缓冲液、2% CTAB (W/V)、 2% PVP K25 (w/v) （去色素）、100mM Tris-HCl (pH8.0)、 25mM EDTA (pH8.0)、 2.0M NaClbM.、 2.10M LiClr+1、3. 2M LiCl,
DEPC-water（抑制RNA酶活性）、 3M NaAc (pH5.2) 、96% 乙醇、 70% 乙醇
2．步骤：
1）抽提缓冲液65℃预热；
2） 加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65℃，10min；;
3）加酚、氯仿、异戊醇（25：24：1），振荡，离心12,000rpm，10min；
4）取上清，加氯仿、异戊醇（24：1）振荡，离心12,000rpm，10min；
5）取上清，重复4步骤；
6）加10M LiCl 1/4体积到上清液；
7）4℃过夜，沉淀DNA；
8）离心（12,000rpm，10min），弃上清；
9）70％乙醇洗，再用100％乙醇洗，风干；
10） 加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），
－200C沉淀；
11）离心12,000rpm，10min；
12）弃上清，70％乙醇洗，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml 水中。
4.2 从动物组织提取DNA的方法：
一、材料：哺乳动物新鲜组织。
二、设备： 移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅。
三、试剂
　　1、分离缓冲液：10mmol/L Tris·Cl pH7.4, 10mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA。
　　2、其它试剂：10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，乙醚，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，无水乙醇及70%乙醇，5mol/L NaCl，3mol/L NaAc，TE。
四、操作步骤:
　　1. 切取组织5g左右,剔除结缔组织,吸水纸吸干血液,剪碎放入研钵(越细越好)。
　　2. 倒入液氮,磨成粉末,加10ml分离缓冲液。
　　3. 加1ml 10% SDS, 混匀,此时样品变得很粘稠。
　　4. 加50ul或1mg 蛋白酶 K, 37℃保温1-2小时, 直到组织完全解体。
　　5. 加1ml 5mol/L NaCl, 混匀,5000rpm离心数秒钟。
　　6.取上清液于新离心管，用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提。待分层后,3000rpm离心 5分钟。
　　7. 取上层水相至干净离心管, 加2倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。
　　8. 移去上层乙醚,保留下层水相。
　　9. 加1/10 体积3mol/L NaAc, 及2倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室温下静止10-20分钟，DNA沉淀形成白色絮状物。
　　10. 用玻棒钩出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水纸上吸干,溶解于1ml TE中,-20℃保存。
　　11. 如果DNA溶液中有不溶解颗粒,可在5000rpm短暂离心,取上清; 如要除去其中的RNA,可加5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃保温30分钟, 用酚抽提后, 按步骤9-10重沉淀DNA。
4.3 大豆DNA的提取
将新鲜大豆叶片保存在冰箱，用时取出。
1、称取大豆叶片2克左右，放入研磨钵中，倒入液氮，将其研碎成粉末。
2、将粉末装入50ml离心管中；同时将CTAB提取液放入水浴锅中，加温至65度。
3、吸取10ml的CTAB提取液和200ul的巯基乙醇放入装有叶片粉末的离心管中。
4、充分振荡后，放入65度的水浴锅中，大约40分钟；其间，每隔10分钟轻轻的摇
晃离心管，使溶液和粉末充分混合。
5、40分钟后，取出冷却至室温，加入等体积的氯仿异戊醇（24：1），充分混匀。
6、然后将离心管放入离心机中离心，转速12000rpm，时间大概15分钟，即可。
7、取上清液至另一离心管中，再吸取等体积的氯仿异戊醇，混匀离心，重复上述步骤。
8、再一次吸取上清液，加入2倍于该上清液体积的冰无水乙醇，轻轻混匀（因为此时
DNA已有少许絮状沉淀，避免DNA断裂），放入4度冰箱中，大概1小时左右。
9、将DNA沉淀用玻璃器皿将其挑到1.5ml的离心管中，用70%的酒精清洗两遍，放
置室温中，待其酒精味挥发完之后（用鼻子闻闻），加入TE溶液即可，这就是DNA原液，
放入-20度冰箱保存即可。
4.4 植物DNA的SDS（十二烷基硫酸钠）提取法：
取2-3g新鲜叶片，在液氮中研磨成粉状（防止溶化）后转入15ml离心管中。加入5ml
于65℃预热的提取缓冲液，65℃水浴保温30min（摇动数次），使提取液与样品充分混合。
加入2ml 5mol/L Kac，剧烈振荡，冰浴保温20 min以上。2700转离心20min，将上清液倒
入新的15ml离心管中，（若提取DNA用于Southern等实验，一般在转移上清时加滤膜，防
止样品残渣混入，可保证DNA纯度）。加入4ml氯仿/异戊醇（24∶1），摇匀，平衡，2700
转离心15 min。在另一新的15ml离心管中加入5ml预冷的异丙醇，将上清液用移液枪转入
此管，在－20℃冷却30 min以上。2700转离心10 min，弃去上清液，用4ml 70%乙醇洗涤，
室温保持10 min。2700转离心3 min，倒去上清液。重复步骤7，用4ml 70%乙醇洗涤，室
温保持10 min。2700转离心3min，倒去上清液。超净工作台内吹干（3h左右）。加1ml TE
缓冲液中溶解，加10μl RNase （10mg/ml），在37℃恒温箱中温育20min。再加100μl 3
mol/L NaAc和2ml无水乙醇，2700转离心3min，倒去上清液。超净工作台内吹干（3h左右）。
将DNA沉淀溶于150μl TE中，置于超净工作台内（3h左右）。将TE溶液转入已灭菌的15ml
eppendorf管中,－20℃保存备用。
4.5 植物DNA的“一管法”提取方法：
称取100mg新鲜植物组织，剪碎置于15ml离心管中，可加入少许无菌石英砂，加入3
滴提取缓冲液，用带玻璃钻头的电钻充分研磨匀浆。加入400μl提取缓冲液，混匀后置于
90℃水浴中，不时颠倒摇匀。温育20min后，置于冰浴中5min，使组织和聚乙烯聚吡咯烷
酮（PVPP）沉淀，置于4℃下保存备用。
4.6 适用于PCR研究的快速提取法：
田间剪取植株新鲜叶片5－10mg（约2cm长）左右，新鲜叶片放于15ml离心管中，存
于冰盒中，根据样品号贴上相应的标签。用剪刀将叶片组织剪细（约0.5cm长）放在点穴式
研板中。加入400μl DNA提取缓冲液，用玻棒将叶组织研细，直到液体变成深绿色即可。
再加400μl DNA提取缓冲液，混合均匀，转入一新的15ml离心管（贴上相应的编号）。加
400μl氯仿，混合均匀后，2400转离心30s，将上清液转入一支新的15ml离心管（贴上相
应的编号）。加800μl无水乙醇，混匀，2400转离心3min。弃上清。70%乙醇冲洗，风干。
用50μl TE缓冲液溶解，存于－20℃。取1μl用于PCR分析。
4.7 棉花等酚类、多糖类物质较多的植物DNA提取法：
取2g新鲜幼嫩的叶片放入研钵中，加入液氮后快速、充分研磨，待成极细的粉末状时
迅速转入到50ml离心管中。在50ml离心管中加入10ml冰预冷的提取缓冲液，在涡悬振荡
器上充分混匀。于4℃，2700转离心20min，倒去上清液在沉淀中加入5ml裂解缓冲液，在
涡旋振荡器上充分混匀。于65℃水浴锅中温育30min。加入5ml氯仿/异戊醇（24/1），并
上下翻转以充分混合。于4℃，2700转离心5min。转移上层水相至一新的50ml离心管中。
重复步骤7－9一次。加入2/3体积的冰预冷的异丙醇，并上下翻转以充分混合，至－20℃ 2h。
于4℃，1200转离心10min。在一新管中加入20ml含80%乙醇15m mol/L NaAc溶液，用玻
棒将DNA转入该管（如不能直接用玻棒缠出，可离心后倒出上清，再在其中加入20ml含80%
乙醇15m mol/L NaAc溶液），放置20min后稍许离心，移走上清并吸出残存乙醇，室温干
燥。加入1 0ml TE（10 m mol/L Tris-HCl pH=8.0、1 m mol/L EDTA）并加入终浓度为20g/L
的RnaseA，过夜。风干，用50μl TE缓冲液溶解，存于－20℃备用。
4.8 植物DNA的CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取法：
称取新鲜叶片2-3g，剪碎放入研钵中，在液氮中研磨成粉末。将粉末转移到的加有7ml
经预热的15×CTAB提取缓冲液15ml离心管中，迅速混匀后置于65℃水浴中，温育30min。
取出离心管,冷却至室温，加入氯仿、异戊醇(24:1)，充分混匀，室温下2300转离心20min。
将上清转移至另一新的15ml离心管中，加入1/10体积10%的CTAB和等体积的氯仿/异戊醇。充分混匀，2300转离心20min。转移上清至另一新的15ml离心管中，加入等体积1%的CTAB沉淀缓冲液，轻轻摇晃至形成DNA絮状沉淀。1000转离心10min，使DNA沉淀于管底。加入1.5-2ml的1mol/L NaCl及5μl RNase置于56℃水浴中过夜。待DNA完全溶解后，加2-3ml 4℃预冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀，挑出DNA，置于15ml离心管中。用70%乙醇清洗30min，用离心机甩5s，倒出70%乙醇，再用95%乙醇浸泡5min，倒出95%乙醇，在超净工作台上吹干。将风干的DNA直接在4℃保存备用或溶于100μl TE溶液中于-20℃保存。
5 二苯胺试剂的配制
A液：　15 g二苯胺溶于100 mL 冰醋酸中,再加15 mL浓硫酸,用棕色瓶保存。如冰醋酸呈结晶状态,则需加温后待其熔化,再使用。
B液：　乙醛的体积分数为0.2%的溶液。将0.1 mL B液加入到10 mL A液中,现配现用。
6 研磨液的配制方法
Tris（三羟甲基氨基甲烷）：10.1 g(相对分子质量为121.14),先加50 mL 蒸馏水溶解,用物质的量浓度为2 moL/L 的盐酸调至pH8.0,再加下述药品。
　　NaCl：8.76 g(相对分子质量58.44)
　　EDTA（乙二胺四乙酸二钠）：37.2 g(相对分子质量372.24)
　　SDS(十二烷基磺酸钠)：20 g(相对分子质量288.3)
待上述药品全部溶解后,再用蒸馏水定容至1 000 mL。
若在室温低于20 ℃时配制药液,SDS呈沉淀析出,此时需要加温,才能将SDS溶解。如果提前配制的研磨液出现了沉淀,则应加温使沉淀溶解后再使用。
7 研磨液中几种药品的作用
SDS(十二烷基磺酸钠):可使蛋白质变性,与DNA分离。
EDTA(乙二胺四乙酸二钠):为DNA酶的抑制剂,可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNA。
　　物质的量浓度为0.15 moL/L的氯化钠溶液：能很好地溶解DNA。
　　Tris/HCl：提供缓冲体系,DNA在此缓冲体系中呈稳定状态。(Tris为三羟甲基氨基甲烷)
8　鉴定DNA的其他方法　
用紫外灯照射法鉴定DNA效果很好。具体鉴定方法如下。
1.配制染色剂。用蒸馏水配制万分之五的溴化乙锭(EB)溶液。
　　2.将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹于蜡纸上,再滴1滴EB溶液染色。
　　3.将蜡纸放在紫外灯(260 nm)下照射(暗室中),可见橙红色的萤光(DNA的紫外吸收高峰在280 nm处)。
9 浅谈DNA的粗提取和鉴定实验的设计思路
遵循实验步骤提取和鉴定DNA，从而掌握“怎样做”的方法十分重要。但亲身体验科学过程，培养“为什么要这样做”的思维习惯，使学生改变学习方式而主动学习就更为重要。下面就谈一谈该实验的设计思路。
一、问题来源及连锁目标
粗提取并进一步提纯DNA，从而单独地、直接地去观察DNA的作用，对于验证DNA是遗传物质十分关键。同时，能使学生在对提取出的DNA进行物理观察的过程中直观认识DNA絮状聚集物。
二、问题延伸及子问题展现
要提取DNA并鉴定提取物是DNA，递次出现的问题有：①DNA主要存在于细胞核中，如何选取具核的生物组织作为实验材料。②如何除去核外的核膜和质膜，对于植物细胞又如何破壁。③细胞核中除DNA外，还有RNA，且DNA以核蛋白体DNP的形式存在。那么，如何使DNA和RNA分开，又如何使DNA和蛋白质分开。④如何去除杂质物质使DNA更加纯化。⑤如何验证提取物主要是DNA成分。
三、问题分析及处理方案
对以上子问题进行相应的分析和处理：①取鸡血细胞液（其红细胞椭圆具核，除骆驼外，猪、羊、狗等哺乳动物红细胞无核）当然，在提取出的DNA中也含有一定量的胞质DNA，即线粒体DNA和叶绿体DNA。②使红细胞溶血破膜。在低渗溶液中，如加蒸馏水使血细胞过度渗透吸水直至破裂，同时用玻棒加速血细胞及核破裂，经一级过滤后滤出液为DNA核蛋白和RNA核蛋白。③利用DNA和RNA溶解度的不同析出DNA。在浓氯化钠溶液（2 mol/L）中，DNA核蛋白的溶解度很大，而RNA核蛋白的溶解度很小。在稀氯化钠溶液（0.14mol／L）中DNA的溶解度最低，蛋白质的溶解度很高而出现盐溶现象，经二级过滤后滤出液主要为DNA粗制品。④DNA不溶于酒精，经三级过滤后，再利用乙醇沉淀法使其他物质溶于酒精而进一步纯化DNA。⑤二苯胺鉴定法即DNA遇二苯胺（沸水浴）被染成蓝色，且颜色的深浅与DNA纯化程度有关。在此过程中设计对照实验，以增强实验中二苯胺对DNA专一性显色结果的可信度。
四、评价总结及批判性研究
就DNA粗提取和鉴定实验的结果而言，它是一个定量分析定性检测实验。其生化实验的复杂性决定了学生必须对该实验的操作要点和具体步骤作出必要的归纳总结，才能对实验流程作一个整体把握。就该实验的过程而言，大有文章可作。应鼓励学生积极开拓思维，从不同的研究角度大胆地进行创新研究，在评判诸如选材的优劣、操作的繁简以及实验的改进等方面问题的过程中，愉快而轻松地学习。
①1个目的：在体验科学思维的过程中提取和鉴定DNA。
②2次用蒸馏水：蒸馏水破膜提取核物质和蒸馏水稀释析出DNA。
③3次过滤：过滤核外物质，过滤DNA核蛋白，过滤DNA。
④4个关键词：DNA提取，设计思路，科学思维和研究性学习。
⑤5次搅拌：第1步同方向加力搅拌，第3、5步同方向轻缓搅拌，第7步同方向缓慢搅拌，第8步可不同方向搅拌。
⑥6种溶液：主要有柠檬酸钠液、酒精液、二苯胺液、甲基绿液、0.015 mol／L和2 mol／L氯化钠液。
⑦7种探究模式：本实验可尝试性拓展为探究性实验，改型后主要参考课题有──（a）探究使用鸡的不同组织材料进行实验时的实验效果。（b）探究蒸馏水量引起的鸡血细胞在不同低渗状态下的破裂程度。（c）探究 DNA在不同质量分数氯化钠溶液中的溶解度并绘出曲线图。(d）探究DNA鉴定过程中不同水浴温度对显色的影响。（e）探究沉淀DNA时不同温度的酒精对沉淀量的影响。（f）探究过滤过程中纱布层数对最终提取物量的影响。(g）探究使用玻璃烧杯、试管与使用塑料制品对DNA提取量的影响。
⑧8个步骤：提取→过滤→溶解→过滤→再溶解→再过滤→提纯→鉴定。
10 DNA粗提取和鉴定的记忆
本实验是考纲当中步骤最为复杂的，记忆成为一个难题，思得一法，试行之。
一、结合原理对应步骤记忆，将实验分为以下三大步。
1、DNA在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低，对应DNA提取步骤。
2、DNA不溶于酒精溶液，对应DNA提纯步骤。
3、DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，对应DNA鉴定步骤。
二、理解整体，把握重点
1、两次加蒸馏水。第一次，利用红细胞渗透吸水破裂，释放DNA；第二次， 稀释NaCl溶液浓度至0.14mol/L，降低DNA溶解度，沉淀DNA。
2、两次DNA沉淀。都是由于溶解度降低所致，第一次，由NaCl溶液浓度改变；第二次由于95%的冷酒精的加入。
3、三次溶解DNA。对应三大步骤，提取和提纯只有溶解后才能通过降低DNA溶解度才能沉淀DNA，而鉴定DNA溶液实验现象更好。
11 实验步骤简略：（以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取）
1.破碎细胞，释放DNA：向5～10 mL的鸡血细胞液加入20 mL蒸馏水。用玻璃棒沿一个方向小心快速搅拌5 min搅拌，使血细胞膜和核膜胀破。再用3～4层纱布过滤，除去一些颗粒较大的杂质。
2．溶解细胞核内的DNA：在溶液中加入两倍体积的浓度为2 mol/L的NaCl溶液，搅拌1 min。注意应沿一个方向搅拌，使DNA充分溶解。
3．DNA的析出：这一步骤是实验成败的关键。①缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌。同时控制加水量，使NaCl溶液的终浓度为0.1～0.2 mol/L。加水过程一般分三次进行，当总加水量为300 mL左右时，DNA已基本析出。加水太多、溶液过稀，会使DNA分子又重新溶解。②用3～4层纱布对DNA稀释液进行过滤，滤去蛋白质，收集DNA的黏稠物。此时注意观察DNA黏稠物的颜色（最佳为白色）。
4.DNA的初步纯化：继续用2 mol/L的NaCl溶液20 mL溶解DNA黏稠物，仍旧沿一个方向不停搅拌3 min，使DNA充分溶解。用3～4层纱布进行过滤，滤去杂质，收集含有DNA的滤液。向滤液中贴壁缓慢加入50 mL预冷的体积分数为95％的乙醇，并用玻璃棒朝一个方向缓慢、均匀地搅拌(玻璃棒不要直插到烧杯底部)，溶液中会出现DNA丝状物。(因为玻璃棒有吸附DNA的作用。也可以用筷子等表面粗糙的用具来帮助DNA分子缠绕。)。
5．DNA的鉴定：用0.015 mol/L的NaCl溶液5mL溶解DNA丝状物。加入4mL二苯胺试剂，置于沸水中加热5min，注意观察试管溶液颜色的变化。（要做对照组）
6．成果评价：①是否提取出了DNA：观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备。②分析DNA中的杂质：本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
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