课件23张PPT。专题整合提升二苯胺 蓝色 去除 滤液中的杂质 柠檬酸钠 引物 变性 复性 高压灭菌粗分离 缓冲液要与凝胶面平齐1．分离DNA、PCR技术、分离蛋白质的比较：专题一 DNA和蛋白质技术2.PCR扩增的常见问题分析：
(1)样品扩增后产物比预期少，即出现假阴性。
①主要原因。
a．Taq DNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制。
b．引物设计不合理导致不能复制。
c．提取的模板质量不过关以及PCR系统的建立欠妥当。
d．循环次数不够等。②预防措施。
a．选用活力高的Taq DNA聚合酶。
b．提取DNA模板时，要注意避免提取物中有抑制酶活性的酚、氯仿等污染物。
c．保证引物与模板DNA互补。(2)样品扩增后产生新DNA，即出现假阳性。
①主要原因：PCR技术高度灵敏，极其微量的外源DNA也会造成非目的DNA片段的大量增加，因此，外源DNA的污染是PCR出现假阳性结果的主要原因。
②预防措施：隔离操作区、分装试剂、简化操作程序、使用一次性吸液枪头等。【易错警示】 血红蛋白的提取与分离实验的易错点
(1)红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少，否则无法除去血浆蛋白；要低速、短时间离心，否则会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。
(2)凝胶的预处理：用沸水浴法不但节约时间，而且能除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内的空气。(3)色谱柱的装填：装填时尽量紧密，减小颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。
(4)色谱柱成功的标志：红色区带均匀一致地移动。1．下列有关物质提取与分离的叙述中，错误的是
A．有机大分子的提取分离在思路上是根据不同物质的不同的理化性质，选择一定的物理化学方法，达到提取与分离的目的
B．叶绿体中色素的分离是纸层析法，其原理是各种色素在层析液中的溶解度不同，在滤纸条上的扩散速度不同［变式训练］C．可以用电泳法从DNA和蛋白质的混合液中提取、分离DNA分子
D．从多种蛋白质的混合液中提取、分离某种蛋白，可以用凝胶色谱法，也可用电泳法解析 生物大分子的提取分离，一般就是根据其固有的理化性质，用不同的物理或化学方法，达到不同成分的分离。叶绿体中色素的分离借助各色素成分在层析液中的溶解度及其在滤纸条上的扩散速度不同而达到分离的目的。不同蛋白质分子由于其相对分子质量、分子大小、形状、带电荷数有很大差异，因此可借助凝胶色谱法或电泳法进行分离。而从DNA、蛋白质的混合液中分离DNA，多借助于二者在NaCl溶液中的溶解度不同来分离，而电泳法难以达到分离DNA的目的。
答案 C2．下列是有关DNA鉴定实验的1管(对照组)与2管(实验组)示意图，图示中恰当的选项是解析 A中的1管中不应加酒精，加二苯胺，错误；在物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液DNA溶解度最大，DNA量溶解状态，有二苯胺，沸水溶液呈蓝色，B中2管正确；C中1管应除去酒精，1管错误；D中2管不应加酒精，错误。
答案 B专题二 “DNA粗提取与鉴定”中方法与目的
归纳 【易错警示】
(l)哺乳动物成熟的红细胞中不含细胞核，也没有DNA，不适于作DNA提取的材料，但却是提取血红蛋白的理想材料。
(2)实验过程中两次用到蒸馏水，第一次目的是使成熟鸡血细胞吸水涨破释放出DNA，第二次目的是稀释NaCl溶液。3．下列DNA粗提取的实验操作中，经过离心或过滤后，取上清液或液液的有［变式训练］A．在新鲜鸡血中加入适量的柠檬酸钠，混合均匀后离心
B．在盛有血红胞的塑料烧杯中加蒸馏水，快速搅拌后过滤
C．调节NaCl溶液的物质的量浓度至0.14 mol/L后，轻轻搅拌后过滤
D．在溶有DNA的NaCl溶液中缓慢加入蒸馏水，轻轻搅拌后过滤解析 柠檬酸钠能够防止血液凝固，新鲜鸡血经过离心后，上清液中血细胞较少，则A项错误；在血细胞中加入蒸馏水，细胞因吸水而涨破，DNA在滤液中，则B项正确；当NaCl溶液的物质的量浓度为0.14 mol/L时，DNA溶解度最低而析出，杂质在滤液中，则C、D项错误。
答案 B4．在DNA的粗提取与鉴定实验中，将提取获得的含DNA的黏稠物(还含有较多杂质)分别处理如下：第一，放入0.14 mol/L的氯化钠溶液中，搅拌后过滤，得滤液A和黏稠物a；第二，放入2 mol/L的氯化钠溶液中，搅拌后过滤，得滤液B和黏稠物b；第三，放入冷却的95%的酒精溶液中，搅拌后过滤，得滤液C和黏稠物c。
以上过程获得的滤液和黏稠物中，因含DNA少而可以丢弃的是________(填字母)。解析 在不同浓度的NaCl溶液中，DNA的溶解度是不同的，在0.14 mol/L的NaCl溶液中DNA溶解度最小，呈丝状物析出。在2 mol/L的NaCl溶液中溶解度最大，所以DNA呈溶解状态，过滤后存在于滤液中。酒精溶液可使DNA分子凝集，呈丝状物，过滤后存在于黏稠物中。
答案 AbC专题5 DNA和蛋白质的技术
(本试卷满分100分，时间60分钟)
一、选择题(共15小题，每小题4分，共60分)
1．下列关于DNA和血红蛋白的提取与分离实验的叙述中，错误的有
A．提取动物细胞中的DNA和蛋白质可以采用蒸馏水涨破细胞的方法
B．采用不同浓度的NaCl溶液反复溶解与析出DNA的方法可去除蛋白质等杂质
C．蛋白质纯化过程中采用透析法可去除溶液中的小分子杂质
D．血红蛋白只能采用凝胶色谱法纯化，DNA则可采用电泳、盐析等方法纯化
解析 DNA和蛋白质存在于细胞内，用动物作材料提取DNA和蛋白质，都要用蒸馏水处理，使细胞吸水涨破，释放出其中的蛋白质或DNA，A正确；DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，因此可以采用不同浓度的NaCl溶液反复溶解与析出DNA的方法可去除蛋白质等杂质，B正确；蛋白质纯化过程中，由于小分子杂质可以通过透析袋，大分子蛋白质不能通过透析袋而留在袋内，因此可以采用透析法去除溶液中的小分子杂质，C正确；凝胶色谱法纯化血红蛋白只是很多纯化方法中的一种，蛋白质的纯化也可以采用电泳、盐析等方法纯化，D错误。
答案 D
2．下列关于PCR引物的说法，不正确的是
A．引物是PCR过程中与模板DNA部分序列互补，并能引导模板DNA的互补链合成的核苷酸
B．引物常根据需要扩增的目标DNA的碱基序列用化学合成的方法获得
C．PCR过程中需要一种引物或两种引物
D．引物的3′端具有游离的—OH
解析 由于DNA聚合酶不能从头合成DNA链，因此引物是PCR过程中与模板DNA部分序列互补，并能引导模板DNA的互补链合成的核苷酸序列，A项正确。PCR扩增的DNA片段取决定于两种引物的结合位点，因此所用的引物通常是根据需要扩增的目标DNA的碱基序列用化学合成的方法获得，B项正确；C项不正确。引物的3′端具有游离的—OH，D项正确。
答案 C
3．固定化单宁酶应用于茶饮料加工，可消除其中的苦涩味。下列有关叙述正确的是
A．在单宁酶纯化时采用透析法去除蛋白
B．化学结合法比吸附法对单宁酶活性影响更小
C．温度、pH和重金属离子都可能影响固定化单宁酶活性
D．酶的高效性决定固定化单宁酶不会降解茶饮料中的有益成分
解析 A错：透析法可除去相对分子质量较小的杂质，酶与杂蛋白都属于生物大分子，用透析法无法分离，正确的分离方法是凝胶色谱法。B错：与吸附法相比，化学结合法对酶的活性影响更大。C对：温度、pH和重金属离子等因素都会对酶活性产生影响。D错：酶的专一性决定固定化单宁酶不会降解茶饮料中的有益成分。
答案 C
4．有关凝胶色谱法和电泳法的说法正确的是
A．它们都是分离蛋白质的重要方法
B．它们的原理相同
C．使用凝胶色谱法需要用缓冲溶液而电泳不需要
D．以上说法都正确
解析 凝胶色谱法和电泳法都是分离蛋白质的重要方法，A正确；凝胶色谱法和电泳法的原理不同，凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小来分离蛋白质的，而电泳法是根据：待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、性状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离，B错误；凝胶色谱法和电泳法都要用缓冲溶液来调节溶液的酸碱度，C错误；由A、B和C选项可知，B和C都错误，D错误。
答案 A
5．在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是
A．防止血红蛋白被氧气氧化
B．血红蛋白是一种碱性物质，需要酸中和
C．磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程
D．让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其结构和功能
解析 在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理，是为了维持PH相对稳定，防止血红蛋白的结构发生改变。
答案 D
6．关于凝胶色谱柱的装填，除哪项外均为正确解释
A．交联葡聚糖凝胶(G－75)“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围，75表示凝胶得水值
B．凝胶用自来水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液
C．用300 ml的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12 h
D．色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡，必须重装
解析 凝胶需用磷酸缓冲液充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，B错误。
答案 B
7．使用凝胶色谱法分离蛋白质时，洗涤红细胞、释放血红蛋白和透析过程中，分别使用下列哪些试剂
①蒸馏水 ②生理盐水 ③20 mmol/L的磷酸缓冲液 ④清水 ⑤柠檬酸钠
A．①③⑤ B．①②③
C．④①③ D．②①③
解析 洗涤红细胞需使用生理盐水，释放血红蛋白时用到蒸馏水，透析时则需用20 mmol/L的磷酸缓冲液，D正确。
答案 D
8．PCR技术扩增DNA，需要的条件是①目的基因②引物③四种脱氧核苷酸④DNA聚合酶⑤mRNA⑥核糖体
A．①②③④ B．②③④⑤
C．①③④⑤ D．①②③⑥
解析 ①PCR技术需含目的基因的DNA作为模板，①正确；②PCR技术需要引物以延伸DNA链，②正确；③PCR技术需四种脱氧核苷酸作为原料，③正确；④PCR技术需耐高温的DNA聚合酶来催化，④正确；⑤mRNA为翻译的模板，PCR技术不需要，⑤错误；⑥核糖体为翻译的场所，PCR技术不需要，⑥错误，故本题答案为A。
答案 A
9．在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，实验原理是利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同来进行提取，DNA的溶解度与下图所示曲线的对应点相符合的是
A．a点浓度最适合析出DNA
B．b点浓度最适合析出DNA
C．c点浓度最适合析出DNA
D．d点浓度最适合析出DNA
解析 如题图所示，DNA在物质的量浓度为0.14 mol·L－1的NaCl溶液中的溶解度最小，这一浓度最适合析出DNA；随着NaCl溶液浓度的增大或减小，DNA溶解度均逐渐增大。
答案 B
10．关于DNA的实验，叙述正确的是
A．用兔的成熟红细胞可提取DNA
B．PCR的每个循环一般依次经过变性－延伸－复性三步
C．DNA溶液与二苯胺试剂混合，沸水浴后生成蓝色产物
D．用甲基绿对人的口腔上皮细胞染色，细胞核呈绿色，细胞质呈红色
解析 本题主要考查实验的原理、选材以及试剂的使用。兔为哺乳动物，其成熟的红细胞中无细胞核，不能从中提取DNA，故A项错误；PCR每次循环都可以分为变性－复性－延伸三步，故B项错误；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺变成蓝色，故C项正确；甲基绿使DNA呈现绿色，不论是细胞核还是细胞质，只要含有DNA，都会呈绿色，故D项错误。
答案 C
11．提取DNA时，若选择的实验材料为植物细胞，破碎细胞时要加入一定量的洗涤剂和食盐。加入食盐的目的是
A．利于DNA的溶解 B．分离DNA和蛋白质
C．溶解细胞膜 D．溶解蛋白质
解析 以植物细胞为实验材料，破碎细胞时加入洗涤剂的目的是瓦解细胞膜，使DNA释放出来；而加入食盐的目的是溶解DNA。
答案 A
12．PCR技术(多聚酶链式反应)是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，下图表示合成过程。下列说法错误的是
A．a过程高温使DNA变性解旋，该过程不需要解旋酶的作用
B．c过程要用到的酶在高温下失活，因此在PCR扩增时需要再添加
C．如果把模板DNA的两条链用15N标记，游离的脱氧核苷酸不标记，控制“94 ℃～55 ℃～72 ℃”温度循环3次，则在形成的子代DNA中含有15N标记的DNA占25%
D．PCR中由碱基错配引起的变异属于基因突变
解析 高温所起的作用类似于解旋酶，使双链DNA变为单链。c过程为PCR技术的延伸阶段，当系统温度上升至72 ℃左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。TaqDNA聚合酶是耐热的，高温下不变性，所以一次性加入即可。PCR技术遵循半保留复制的特点，经过3次循环，共产生23个DNA分子，其中有2个DNA分子含有15N标记。基因中的碱基对改变属于基因突变。
答案 B
13．如图表示PCR技术扩增DNA分子的过程中，DNA聚合酶作用的底物，据图分析正确的是
A．图中a为引物，是一种单链RNA分子
B．图中b为DNA模板链，f端为3′末端
C．PCR技术中通过控制温度来实现DNA双链的解旋和结合
D．DNA聚合酶无需引物也能将单个脱氧核苷酸连接成DNA片段
解析 PCR技术中，DNA聚合酶需要引物，才能够将单个脱氧核苷酸连接成DNA片段，该技术中引物通常为单链DNA，即题图中的a；图中b为DNA模板链，f端为5′末端；PCR技术中通过高温和降温来实现DNA双链的解旋和结合。
答案 C
14．如图所示，DNA扩增过程中，DNA片段经若干次扩增，与其数目的理论值变化相符的是
解析 PCR反应中DNA分子的扩增和生物体内DNA的复制是类似的，即1个DNA分子复制1次产生2个DNA分子，复制2次产生4个DNA分子，呈指数扩增，开始以1个DNA分子为模板，经过n次复制后得到的DNA分子的数目应为2n，与曲线C相符合。
答案 C
15．在PCR扩增的实验中，加入一种提取物(一种模板DNA片段)，但实验得到的产物却有2种DNA，其原因可能是
A．基因突变
B．Taq DNA聚合酶发生变异
C．基因污染
D．温度过高
解析 此现象属于PCR技术中的假阳性现象。其原因是基因污染造成的。因此，在PCR实验中，一定要做到隔离操作区、分装试剂、简化操作程序、使用一次性吸头等。尽量避免基因污染，故C项正确。若是基因突变，则可能得不到扩增产物或扩增产物仍为一种，A项不正确。若Taq DNA聚合酶发生变异则不会有扩增产物，B项不正确。若温度过高，亦不会有扩增产物，D项不正确。
答案 C
二、非选择题(共4小题，共40分)
16．(10分)下列是有关血红蛋白的提取与分离的问题，请回答：
(1)凝胶色谱法，是根据________分离蛋白质的有效方法。所用的凝胶实际上是一些____________。
(2)实验前取新鲜的血液，切记要预先加入柠檬酸钠，加入柠檬酸钠的目的是____________。蛋白质的提取和分离实验中，首先要用____________(填写溶液名称)洗涤红细胞，其目的是去除_____________________________________。
(3)在________的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。用________法可分离出血红蛋白。
(4)取血红蛋白溶液装入透析袋，再将透析袋放入pH为7.0的________中，透析12 h，透析的目的是________________。透析的原理是________________。
(5)人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白，其原因是___________________________________________________________________。
解析 (1)凝胶色谱法是根据相对分子质量大小分离蛋白质的有效方法。所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体。相对分子质量较大的蛋白质经过凝胶颗粒的外部，移动距离短，移动速度快，先洗脱下来。
(2)柠檬酸钠可以防止血液凝固；首先要用生理盐水洗涤红细胞，其目的是去除可能吸附的血浆中的蛋白质。
(3)向红细胞中加入蒸馏水和甲苯，蒸馏水会使红细胞破裂，甲苯可以溶解细胞膜，经高速离心后可分离出血红蛋白。
(4)透析袋能使小分子自由进出，而大分子则保留在袋内。取血红蛋白溶液装入透析袋，再将透析袋放入pH为7.0的缓冲液中，以维持血红蛋白的结构和功能。
(5)鸡红细胞具有细胞核，含有DNA，适合用于提取DNA；人红细胞无细胞核，且血红蛋白含量丰富，适合用于提取血红蛋白。
答案 (1)相对分子质量大小 微小的多孔球体 (2)防止血液凝固 生理盐水 杂蛋白 (3)蒸馏水和甲苯 (高速)离心 (4)(磷酸)缓冲液 去除分子质量较小的杂质 透析袋能使小分子自由进出，而大分子则保留在袋内(合理得分) (5)鸡红细胞具有细胞核，含有DNA，适合用于提取DNA；人红细胞无细胞核，且血红蛋白含量丰富，适合用于提取血红蛋白
17．(10分)(2018·江苏卷)为生产具有特定性能的α-淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了α-淀粉酶基因(1 656个碱基对)，利用基因工程大量制备α-淀粉酶，实验流程见下图。请回答下列问题：
(1)利用PCR技术扩增α-淀粉酶基因前，需先获得细菌的________。
(2)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的________端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是______________________________________________________________。
(3)进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中________的设定与引物有关，________的设定与扩增片段的长度有关。(填序号)
①变性温度 ②退火温度 ③延伸温度 ④变性时间 ⑤退火时间 ⑥延伸时间
(4)下图表示筛选获得的工程菌中编码α-淀粉酶的mRNA的部分碱基序列：
图中虚业框内mRNA片段包含________个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有________种。
(5)获得工程菌表达的α-淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性，结果如下：
缓冲液
50 mmol/L
Na2HPO4-KH2PO4
50 mmol/L
Tris-HCl
50 mmol/L
Gly-NaOH
pH
6.0
6.5
7.0
7.5
7.5
8.0
8.5
9.0
9.0
9.5
10.0
10.5
酶相对活性%
25.4
40.2
49.8
63.2
70.1
95.5
99.5
85.3
68.1
63.7
41.5
20.8
根据上述实验结果，初步判断该α-淀粉酶活性最高的条件为________。
解析 (1)利用PCR技术扩增α-淀粉酶基因前，需先获得细菌的基因组DNA作为模板，并依据α-淀粉酶基因两端的部分核苷酸序列合成两条引物。
(2)利用PCR技术扩增DNA时，只能从3′端延伸DNA子链，为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5′端加上限制性酶切位点，并且要注意在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，这样既能防止目的基因、载体的自身连接，又能确保目的基因与表达载体的定向连接。
(3)PCR技术包括变性、退火(复性)和延伸三步，变性温度决定PCR反应中双链DNA的解链，且时间很短；退火时引物结合到互补的DNA单链上，退火温度由引物复性温度决定，其温度设定与引物的长度、碱基组成及浓度等有关；延伸时间与产物片段的长度有关，产物在1 kb以内的延伸时间为1 min左右，3～4 kb的延伸时间为3～4 min。
(4)图中虚线框内共含有24个碱基，mRNA上3个相邻的碱基编码1个氨基酸，故共包含8个密码子。虚线框后的第1个密码子的第1个碱基是U，第2和第3个碱基各有4种可能性，因此共有16种可能性。题干表明控制α-淀粉酶的基因1 656个碱基对，说明图中虚线框后的第一个密码子肯定不终止密码子(3种终止密码子为UAA、UAG、UGA)，故虚线后第一个密码子实际最多有16－3＝13种可能性。
(5)分析表格中的数据，酶相对活性最高为99.5%，对应的条件是pH为8.5，缓冲液为50 mmol/L Tris-HCl。
答案 (1)基因组DNA (2)5′ 使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连 (3)② ⑥ (4)8 13 (5)pH为8.5，缓冲液为50 mmol/L Tris-HCl
18．(10分)下列为凝胶色谱法分离血红蛋白时样品的加入(甲图)和洗脱(乙图)示意图，请据图回答下列问题。
(1)装填凝胶色谱柱时需要一次性________(填“缓慢”或“快速”)倒入，并轻轻敲打使凝胶装填紧密而不具有气泡，否则必须重装。
(2)用吸管加样时须注意正确操作以避免破坏凝胶面，加样操作应如甲图所示吸管口沿管壁环绕移动进行，形成________(填“滴灌加样”或“贴壁加样”)。
(3)凝胶色谱法分离血红蛋白的基本过程：样品加入后进行洗脱，而后收集血红蛋白，则该全过程中，共需要几次打开下端的流出口？________。收集血红蛋白样品时须把握好时机，即待_______________________________________
时，用试管连续收集流出液。最后收集到的血红蛋白与刚洗脱时收集到的蛋白质相比，后者相对分子质量较________(填“大”或“小”)，原因是_________________________________________________________________________________________________________________________________________。
(4)电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。某同学又利用电泳技术将得到的蛋白质样品进行分离，在电泳过程中，影响蛋白质迁移速度的因素包括蛋白质分子的________________、________________以及分子的形状等。而在测定蛋白质相对分子质量时通常使用的电泳方法为___________________________________________________________________。
(5)许多重要的生物大分子，如蛋白质、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。丙图表示模拟电泳现象的实验装置图，U型管左侧的颜色逐渐变深，原因最可能是_____________________________________。
解析 (3)凝胶色谱法分离血红蛋白的过程的操作为调节缓冲液面，打开下端流出口，使缓冲液下降到与凝胶面平齐后关闭出口→加入蛋白质样品→打开下端出品，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口→洗脱：色谱柱上端连接缓冲液洗脱瓶，打开下端流出口→收集分装蛋白质，即可分离得到血红蛋白。(4)在测定蛋白质相对分子质量时通常使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。在凝胶中加入的SDS可与蛋白质形成“蛋白质—SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。
(5)由题图分析可知Fe(OH)3胶体粒子带正电荷，在电场作用下向阴极移动。
答案 (1)缓慢 (2)贴壁加样
(3)3次 红色蛋白质接近色谱柱底端 小 相对分子质量大的蛋白质，通过色谱柱的路程较短，移动速度较快
(4)带电性质 分子本身大小 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
(5)Fe(OH)3胶体粒子带正电荷，在电场作用下向阴极移动
19．(10分)下图为鸡血细胞中DNA的粗提取和鉴定实验过程中的部分操作示意图，请据图分析，回答下列问题：
(1)图中正确的实验操作顺序是________(用序号与箭头表示)。
(2)步骤③中加入蒸馏水的目的是________________________；步骤⑤中加入蒸馏水后DNA析出，该操作的原理是________________________。
(3)步骤①中所用酒精最佳是经过________后再使用，该步骤的目的是________________________。
(4)DNA可用________试剂鉴定，沸水浴后的颜色反应为________________。
(5)由于鸡血较难找到，某学生试图用人血代替，结果没有成功，其原因最可能是______________________________________________________________。
解析 (1)DNA的粗提取和鉴定步骤是：加入蒸馏水，破碎细胞→过滤，获取含DNA的滤液→去除滤液中杂质→DNA的析出→鉴定．所以正确的操作顺序是③→②→⑤→④→①。
(2)步骤③中加入蒸馏水的目的是加速血细胞的破裂；当NaCl溶液浓度大于0.14 mol/L时，DNA在NaCl溶液中的溶解度随NaCl溶液浓度的降低而减小，因此步骤⑤中加入蒸馏水后DNA析出。
(3)步骤①中所用酒精最佳是经过充分预冷后再使用，该步骤的目的是利用DNA不溶于酒精的性质，可除去细胞中溶于酒精的物质而得到较纯的DNA。
(4)DNA可用二苯胺试剂鉴定，沸水浴后的颜色反应为蓝色。
(5)人是哺乳动物，哺乳动物血液中的红细胞没有细胞核和细胞器，因此用人血代替鸡血来进行该实验难以取得成功。
答案 (1)③→②→⑤→④→①
(2)加速血细胞的破裂 DNA在2 mol/L NaCl溶液中的溶解度，随NaCl溶液浓度的降低而减小
(3)充分预冷 提取含杂质较少(或较纯净)的DNA(利用DNA不溶于酒精的性质，可除去细胞中溶于酒精的物质而得到较纯的DNA)
(4)二苯胺 蓝色
(5)人血含DNA太少(成熟的红细胞没有细胞核)
专题5
课题1 DNA的粗提取与鉴定
[随堂巩固]
1．在DNA的粗提取与鉴定实验中有三次过滤
(1)过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液
(2)过滤含黏稠物的质量浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液
(3)过滤溶解有DNA的质量浓度为2 mol/L的NaCl溶液
以上三次过滤分别为了获得
A．含核物质的滤液、纱布上的黏稠物、含DNA的滤液
B．含核物质的滤液、滤液中DNA黏稠物、含DNA滤液
C．含核物质的滤液、滤液中DNA黏稠物、纱布上的DNA
D．含较纯DNA滤液、纱布上黏稠物、含DNA滤液
解析 过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液，为了获得含核物质的滤液。过滤含黏稠物的质量浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液，获得纱布上的黏稠物。过滤溶解有DNA的质量浓度为2 mol/L的NaCl溶液，获得过滤溶解有DNA的质量浓度为2 mol/L的NaCl溶液，A正确。
答案 A
2．蛋白酶能将蛋白质水解而使染色质中的DNA分离出来。下列选项可达到上述同一目的的是
A．蒸馏水 B．NaCl溶液
C．NaOH溶液 D．盐酸
解析 蛋白酶是利用酶的专一性将DNA和蛋白质分离，而NaCl溶液则是利用DNA和蛋白质在该溶液中的溶解度不同将其分离。
答案 B
3．在利用鸡血进行“DNA的粗提取与鉴定”的实验中，相关叙述正确的是
A．用蒸馏水将NaCl溶液浓度调至0.14 mol/L，滤去析出物
B．调节NaCl溶液浓度或加入木瓜蛋白酶，都可以去除部分杂质
C．将丝状物溶解在2 mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色
D．用菜花替代鸡血作为实验材料，其实验操作步骤相同
解析 DNA的粗提取实验原理是0.14 mol/L NaCl溶液中DNA溶解度最低，DNA不溶于95%的冷酒精等，用蒸馏水将2 mol/L NaCl溶液浓度调至0.14 mol/L，析出的是DNA，丢弃的是滤液，A错误；DNA在不同浓度的NaCl溶液中DNA溶解度不同，DNA在2 mol/L NaCl溶液中溶解度最大，在0.14 mol/L NaCl溶液中溶解度最小，酶具有专一性，木瓜蛋白酶可以水解DNA中的蛋白质类杂质，B正确；DNA丝状物溶解在2 mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后需要沸水浴才会呈现蓝色，C错误；植物细胞有细胞壁保护着，所以用菜花做实验材料时，需要研磨，加入食盐和洗涤剂，D错误。
答案 B
4．在混合物中提取DNA分子的基本思路是
A．根据各种大分子的理化性质的差异
B．根据各种大分子的理化性质的共性
C．根据各种大分子在细胞内的功能
D．根据各种大分子的结构和在细胞内的位置
解析 在混合物中提取DNA分子的基本思路是根据各种大分子的理化性质的差异，A正确。
答案 A
5．关于DNA粗提取的实验材料的选择，研究者经过多次实验效果的比较，最终选择鸡血做实验材料。请据图回答问题：
(1)在实验中，两次向烧杯中加入蒸馏水的作用是________。
A．稀释血液，冲洗样品
B．使血细胞破裂、降低NaCl浓度使DNA析出
C．使血细胞破裂、增大DNA溶解量
D．使血细胞破裂、提取含杂质较少的DNA。
(2)生活在牧区的人们，采集牛、羊和马血比较方便，若它们按实验要求完成实验步骤后，结果是很难提取到DNA，原因是__________________________。
(3)不同的NaCl溶液中，DNA的溶解度不同，在NaCl溶液浓度是________________时，DNA的溶解度最小。
(4)在DNA的析出和鉴定过程中析出DNA时应将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等的、冷却的________(写出体积分数)，静置后溶液中将析出DNA。鉴定时所用的试剂为________________。
解析 (1)在DNA粗提取的实验中，先后两次向烧杯中加入蒸馏水的作用分别是使血细胞吸水涨破，释放DNA；降低NaCl浓度，使DNA析出。
(2)牛、羊和马属于哺乳动物，哺乳动物成熟的红细胞中不含细胞核和细胞器，因此若用它们的血液作为实验材料将很难提取到DNA，但若改用动物肝脏做实验材料，实验能顺利进行，这是因为肝细胞有细胞核。
(3)不同的NaCl溶液中，DNA的溶解度不同，在NaCl溶液浓度是0.14 mol/L时，DNA的溶解度最小。
(4)在DNA的析出和鉴定过程中，析出DNA时应将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等的、冷却的95%的酒精，静置后溶液中将析出DNA。鉴定时所用的试剂为二苯胺。
答案 (1)B
(2)牛羊马为哺乳动物，其成熟的红细胞中没有细胞核
(3)0.14 mol/L (4)95%的酒精 二苯胺
[限时检测]
[时间45分钟，满分80分]
一、选择题(每小题5分，共50分)
1．甲、乙两图为“DNA的粗提取与鉴定”实验中涉及的两个操作装置图。相关叙述正确的是
A．图甲的烧杯和图乙的试管中所用溶剂都为NaCl溶液，但两者浓度不同
B．图乙试管经稍稍加热后即可观察到一支试管中的溶液明显变蓝，另一支试管中的溶液不变蓝
C．图甲操作需用玻璃棒迅速搅拌以使DNA析出，并缠绕在玻璃棒上
D．图乙操作中所用的二苯胺需现配现用以达到较好的鉴定效果
解析 图甲烧杯中为酒精溶液，图乙试管中为NaCl溶液；图乙试管需要在沸水中加热5 min；图甲用玻璃棒沿一个方向轻轻搅拌，卷起丝状物；图乙操作中所用的二苯胺最好现配现用，否则会影响鉴定的效果。
答案 D
2．在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，甲、乙、丙、丁四个小组除下表中所列处理方法不同外，其他操作步骤均正确，但实验结果却不同。下列有关叙述不正确的是
组别
实验材料
提取核物质时加入的溶液
去除杂质时加入的溶液
DNA鉴定时加入的试剂
甲
鸡血
蒸馏水
95%的酒精50 ℃
二苯胺
乙
菜花
蒸馏水
95%的酒精(冷却)
双缩脲试剂
丙
猪血
蒸馏水
95%的酒精(冷却)
二苯胺
丁
鸡血
蒸馏水
95%的酒精(冷却)
二苯胺
A.实验材料选择错误的组别是丙
B．沸水浴后试管中溶液颜色变蓝的组别是甲、丁
C．甲组实验现象差的原因是50 ℃的酒精对DNA的凝集效果差
D．乙组实验不成功仅因为在鉴定时加入了双缩脲试剂
解析 猪血中的成熟红细胞中没有细胞核和细胞器，不能作为提取DNA的材料，A项正确；乙组是植物材料，仅加入蒸馏水无法提取DNA，需要先加入洗涤剂和食盐，丙组选材错误，所以沸水浴后溶液颜色变蓝的组别只有甲、丁，B项正确；DNA在冷却的酒精中的溶解度较低，50 ℃的酒精对DNA的凝集效果差，C项正确；乙组实验不成功不仅是因为在鉴定时加入了双缩脲试剂，还因为植物材料提取核物质时加入的溶液是蒸馏水，起不到预期的效果。
答案 D
3．下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验原理与方法的叙述，错误的是
A．DNA在NaCl溶液中的溶解度随着溶液浓度的变化而变化
B．向鸡血细胞液中加入蒸馏水的目的是使其吸水涨破，释放出其中的DNA
C．把DNA加入二苯胺溶液，在沸水浴中颜色不变，只有冷却后才能观察到蓝色
D．向滤液中加入冷却酒精的目的是除去DNA中的杂质，纯化DNA
解析 DNA在0.14 mol/L NaCl溶液中的溶解度最低，高于或低于这个浓度，溶解度上升，A项正确；鸡血细胞液中加入蒸馏水的目的是使其吸水涨破，释放出其中的DNA，B项正确；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，C项错误；DNA不溶于酒精，因此向滤液中加入冷却酒精的目的是除去DNA中的杂质，纯化DNA，D项正确。
答案 C
4．下表有关“DNA粗提取和鉴定”的相关操作中所选取的试剂，错误的是
相关操作
选用的试剂
A
破碎鸡血细胞
蒸馏水
B
溶解核内DNA
0.14 mol/L的NaCl溶液
C
提取杂质较少的DNA
冷却的95%的酒精
D
DNA的鉴定
现配的二苯胺试剂
解析 在鸡血细胞液中加入蒸馏水，使得血细胞吸水涨破，A正确；0.14 mol/L的NaCl溶液中DNA的溶解度最低，B错误；DNA不溶解于酒精，而其它杂质能溶解于酒精，则用体积分数为95%的冷酒精能提取杂质较少的DNA，C正确；DNA用二苯胺鉴定呈蓝色，双缩脲用来检测蛋白质呈紫色，D正确。
答案 B
5．DNA粗提取实验中，应尽可能避免DNA断裂和降解。相关操作正确的是
A．以菜花为材料进行研磨时，可以适当加热以促进DNA溶解
B．向DNA溶液中迅速加入蒸馏水，使DNA快速析出
C．将丝状物溶解到2 mol·L－1 NaCl溶液中后，加水析出
D．向DNA溶液中加入冷却的酒精并沿同一方向缓慢搅拌
解析 以菜花为材料进行研磨时，可以加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分地搅拌和研磨，过滤后收集研磨液，A项错误；为避免DNA断裂，加入蒸馏水要缓慢，B项错误；将丝状物溶解到2 mol·L－1 NaCl溶液中后，加入与滤液体积相等的、冷却的、体积分数为95%的酒精溶液，静置2～3 min，以析出含杂质较少的DNA，C项错误；为避免DNA断裂和降解，要向DNA溶液中加入冷却的酒精并沿同一方向缓慢搅拌，D项正确。
答案 D
6．在DNA的粗提取实验中，加入与滤液体积相等的、冷却的A溶液，静置2～3 min，溶液中会出现白色丝状物。上面的A溶液是指
A．0.9%的NaCl溶液
B．0.14 mol/L的NaCl溶液
C．质量分数为15%的HCl
D．体积分数为95%的酒精溶液
解析 在DNA的粗提取实验中，加入与滤液体积相等的、冷却的A溶液，静置2～3 min，溶液中会出现白色丝状物。上面的A溶液是指体积分数为95%的酒精溶液。所以D正确。A、B、C不正确。
答案 D
7．下列有关DNA的粗提取与鉴定实验的叙述，正确的是
A．取材：鸡血细胞；原因：有细胞核，其他动物的血细胞都没有细胞核
B．粗提取：不同浓度的NaCl溶液；原因：DNA在其中的溶解度不同
C．提纯：95%的冷酒精；原因：DNA溶于酒精，蛋白质等杂质不溶于酒精
D．鉴定：二苯胺试剂；原因：DNA溶液加入二苯胺试剂即呈蓝色
解析 除了哺乳动物成熟的红细胞，其他都有细胞核，A错误；不同浓度的NaCl溶液，DNA在其中的溶解度不同，进而粗提取DNA，B正确；DNA不溶于酒精，而蛋白质等杂质溶于酒精，进而提纯DNA，C错误；DNA溶液加入二苯胺试剂后沸水浴加热成蓝色，D错误。
答案 B
8．在DNA的粗提取过程中，初步析出DNA和提取较纯净的DNA所用的药品的浓度及其名称分别是
①0.1 g/mL的柠檬酸钠溶液
②物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液
③物质的量浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液
④体积分数为95%的酒精溶液
⑤物质的量浓度为0.015 mol/L的NaCl溶液
⑥物质的量浓度为0.04 mol/L的NaCl溶液
A．①③⑤ B．③④
C．②④ D．②③④
解析 0.1 g/ml的柠檬酸钠溶液是作为抗凝剂防止血液凝固的，不能用于DNA的初步析出和提纯，①错误；DNA在2.00 mol/L的NaCl溶液中溶解度较大，可以利用该溶液从血细胞中提取DNA，但不能用于DNA的初步析出和提纯，②错误；DNA在0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度最低，此时DNA会从溶液中析出，可用于初步析出DNA，③正确，⑤⑥错误；由于DNA不溶于酒精，而其它杂质可以溶于酒精，因此利用体积分数为95%的酒精溶液，可提取较纯净的DNA，④正确。因此，B项正确，A、C、D项错误。
答案 B
9．下列关于“DNA粗提取与鉴定实验”的叙述，正确的是
A．洗涤剂能瓦解细胞膜并增加DNA在NaCl溶液中的溶解度
B．将DNA丝状物放入二苯胺试剂中沸水浴后冷却变蓝
C．常温下菜花浆中有些酶类会影响DNA的提取
D．用玻璃棒缓慢搅拌滤液会导致DNA获得量减少
解析
选项
正误
判断理由
A
×
洗涤剂不能增加DNA在NaCl溶液中的溶解度
B
×
DNA丝状物加入二苯胺后沸水浴加热后呈现蓝色，并不要冷却
C
√
常温下菜花研磨匀浆中含有一些酶会影响DNA的提取
D
×
玻璃棒搅拌滤液不会导致DNA含量的减小
答案 C
10．若从植物细胞中提取DNA，发现实验效果不好，如看不到丝状物、用二苯胺鉴定时不显示颜色反应等，其可能的原因是
①植物细胞中DNA含量低 ②研磨不充分 ③过滤不充分 ④95%冷酒精的量过多
A．①② B．③③
C．①④ D．②③
解析 研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少；过滤不充分也会导致提取的DNA量过少；若用于沉淀DNA的酒精量过少，会导致DNA的沉淀量少。这三种情况都可能导致题中的实验效果。
答案 D
二、非选择题(共3小题，共30分)
11．(10分)下图为“DNA的粗提取与鉴定”实验的相关操作。
(1)图中实验材料A可以是________等，研磨前加入的B应该是___________________________________________________________________。
(2)通过上述所示步骤得到滤液C后，再向滤液中加入2 moL/L的NaCl溶液的目的是__________________________________________________________，
再过滤得到滤液D，向滤液D中加入蒸馏水的目的是
_______________________________________________________________。
(3)在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，将含有一定杂质的DNA丝状物分别放入体积为2 mL的4种溶液中，经搅拌后过滤，获得如表所示的4种滤液，含DNA最少的是滤液________。
1
研磨液
搅拌后过滤
滤液E
2
2 moL/L NaCl溶液
搅拌后过滤
滤液F
3
0.14 mol/L NaCl溶液
搅拌后过滤
滤液G
4
冷却的95%的酒精溶液
搅拌后过滤
滤液H
(4)DNA鉴定的原理是__________________________________________
_____________________________________________________________。
解析 (1)选用洋葱、菜茎等植物材料提取DNA时，要在切碎的材料中加入一定量的洗涤剂和食盐，进行充分搅拌和研磨。(2)DNA在2 mol/L的NaCl溶液中的溶解度较高，而在0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度最小。向溶液中加入2 mol/L的NaCl溶液可以使DNA溶解，过滤除去不溶的杂质，向溶液中加入蒸馏水可降低NaCl溶液的浓度，使DNA析出，除去溶解在低盐溶液中的杂质。(3)DNA不溶于酒精，因此在4种滤液中H滤液含DNA最少。(4)DNA鉴定的原理是在沸水的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。
答案 (1)洋葱 洗涤剂和食盐
(2)使DNA溶解 使DNA析出
(3)H
(4)在沸水条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色
12．(10分)某生物兴趣小组开展DNA粗提取的相关探究活动。具体步骤如下：
材料处理：称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各2份，每份10 g。剪碎后分成两组，一组置于20 ℃、另一组置于－20 ℃条件下保存24 h。
DNA粗提取：
步骤一：将上述材料分别放入研钵中，各加入15 mL研磨液(含洗涤剂和食盐)，充分研磨。用两层纱布过滤，取滤液备用。
步骤二：先向6只小烧杯中分别注入10 mL滤液，再加入20 mL体积分数为95%的冷酒精溶液，然后用玻璃棒缓缓地向一个方向搅拌，使絮状物缠绕在玻璃棒上。步骤三：取6支试管，分别加入等量的________(填溶液名称及浓度)溶液溶解上述絮状物。
步骤四：在上述试管中各加入4 mL________试剂。混合均匀后，置于沸水中加热5 min，待试管冷却后比较溶液的颜色深浅，结果如下表：
材料保存温度
花菜
辣椒
蒜黄
20 ℃
＋＋
＋
＋＋＋
－20 ℃
＋＋＋
＋＋
＋＋＋＋
(注：“＋”越多表示蓝色越深)
分析上述实验过程，回答下列问题：
(1)该探究性实验课题名称是________。
(2)步骤一中研磨液中洗涤剂的作用是____________，食盐的作用是________________。
(3)步骤二中“缓缓地”搅拌，这是为了______________________________，
所加酒精溶液需冷却的原因之一是低温抑制________的活性，可以防止DNA降解。
(4)上述实验中步骤三、步骤四的空缺依次分别为________、________。
(5)实验表明，____________获取的DNA量最多。
解析 (1)表中信息显示，该实验有两个自变量：实验材料和温度，所以该探究性实验课题名称是：探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响。
(2)步骤一中研磨液中洗涤剂的作用是溶解细胞膜，有利于细胞内DNA的释放。食盐的作用是溶解DNA。
(3)步骤二中“缓缓地”搅拌，这是为了防止DNA断裂，所加酒精溶液需冷却的原因之一是低温抑制DNA水解酶的活性，可以防止DNA降解。
(4)步骤二中得到的缠绕在玻璃棒上的絮状物是DNA。在鉴定DNA时，需将DNA溶解在2 mol/L NaCl溶液中，所用的鉴定试剂为二苯胺，所以上述实验中步骤三、步骤四的空缺依次分别为2 mol/L NaCl、二苯胺。
(5)表中的“＋”越多表示蓝色越深，而DNA遇二苯胺(沸水浴)被染成蓝色，据此可知：保存在－20 ℃的蒜黄获取的DNA量最多。
答案 (1)探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响 (2)溶解细胞膜 溶解DNA (3)减少(或防止)DNA断裂 DNA水解酶(或核酸水解酶或DNA酶)
(4)2 mol/L NaCl 二苯胺 (5)保存在－20 ℃的蒜黄
13．(10分)某实验小组以洋葱组织为实验材料，进行DNA粗提取和鉴定的实验，实验主要过程如下图，回答下列问题：
步骤一 步骤二
―→―→
步骤三 步骤四
―→
(1)步骤一中需加入一定量的洗涤剂和________对洋葱组织进行处理，加入前者是为了瓦解细胞膜结构，加入后者的目的是____________________。将搅拌和研磨后的物质进行过滤，即可得到含有DNA的滤液。
(2)步骤二是DNA纯化过程中的关键步骤，可以采用以下几种不同的方法：
①滤液中NaCl浓度在0.14 mol/L时可分离出DNA，若要再次提纯，需要将其溶解在________mol/L的NaCl溶液中；
②通常会向DNA粗提取物中加入嫩肉粉，其目的是____________________；
③将得到的DNA粗提取物放在60～75 ℃水浴中保温10～15 min，蛋白质被破坏，但仍能得到纯度较高的DNA，说明DNA_________________________。
(3)步骤三中向滤液中加入体积分数为95%的酒精的目的是____________________，依据的原理是____________。得到纯净的DNA后，可利用DNA与____________在沸水浴条件下发生显色反应，来对其进行鉴定。
解析 (1)进行DNA粗提取和鉴定时，步骤一中需加入一定量的洗涤剂和食盐(氯化钠)对洋葱组织进行处理，加入前者是为了瓦解细胞膜结构，加入后者的目的是溶解DNA，将搅拌和研磨后的物质进行过滤，即可得到含有DNA的滤液。
(2)步骤二是DNA纯化过程中的关键步骤，可以采用以下几种不同的方法：
①利用DNA在浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度最低可分离出DNA；若要再次提纯，需要将其溶解在2 mol/L的NaCl溶液中。
②通常会向DNA粗提取物中加入嫩肉粉，由于嫩肉粉中含有蛋白酶，可破坏其中的蛋白质。
③由于DNA具有较高的稳定性(或耐较高温度)，将得到的DNA粗提取物放在60～75 ℃水浴中保温10～15 min，则蛋白质被破坏，可得到纯度较高的DNA。
(3)由于DNA不溶于酒精，但酒精可以使蛋白质变性并与DNA分离，故步骤三中向滤液中加入体积分数为95%的酒精的目的是析出DNA。得到纯净的DNA后，可利用DNA与二苯胺在沸水浴条件下发生显色(蓝色)反应，来对其进行鉴定。
答案 (1)食盐(氯化钠) 溶解DNA
(2)①2 ②破坏其中的蛋白质 ③具有较高的稳定性(或耐较高温度)
(3)析出DNA DNA不溶于酒精，但酒精可以使蛋白质变性并与DNA分离 二苯胺
课件45张PPT。专题5 DNA和蛋白质技术课题1 DNA的粗提取与鉴定 1．提取DNA的基本思路：
(1)生物大分子的提取：选用一定的_____________方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。一、DNA粗提取的方法与鉴定的方法［基础梳理］物理或化学(2)DNA的粗提取：利用DNA与___________________等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。RNA、蛋白质和脂质2．提取DNA分子的基本原理：
(1)利用DNA的溶解性。
①在NaCl溶液中的溶解特点：
a．在NaCl浓度为2 mol/L时____________，而部分蛋白质发生盐析而生成______，通过过滤可除去部分_________。
b．在NaCl浓度为0.14 mo/L时__________，过滤可除去溶解的部分________。DNA溶解沉淀蛋白质DNA析出蛋白质②在酒精溶液中的溶解特点：DNA不溶于______溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于_______溶液。利用这一原理，可将DNA与蛋白质进一步分离。酒精酒精(2)利用DNA的耐受性方面的性质。
①蛋白酶能水解________，但对DNA没有影响。
②大多数________不能忍受60～80 ℃的高温，而DNA在80 ℃以上才会变性。
③洗涤剂能够瓦解______，但对____没有影响。蛋白质蛋白质细胞膜DNA二苯胺 蓝色 1．选取实验材料：选取富含________的组织，如鸡血细胞、菜花等。二、DNA的粗提取与鉴定的实验设计DNA2．具体操作步骤：
(1)破碎细胞，释放DNA：如用鸡血细胞，置于清水中使之__________并用玻璃棒______搅拌，过滤取滤液。吸水涨破单向(2)去除滤液中的杂质。
①高浓度的____________溶解细胞核内的DNA。
②加蒸馏水降低NaCl溶液的浓度，使_________、过滤。
③将DNA丝状物再溶解、过滤。
(3)DNA的初步纯化：向滤液中加入体积分数为______________溶液进行提纯。NaCl溶液DNA析出95%的冷酒精二苯胺 蓝色 1．不同浓度的NaCl溶液对DNA的溶解度一定不同。
解析 DNA在0.14 mol/L的NaCl溶液中的溶解度最小，低于或高于此浓度可能会出现DNA溶解度相同的情况。
答案 ×［即时反馈］2．冷却的体积分数为95%的酒精溶液能够溶解DNA中含有的蛋白质杂质。
解析 在冷却的体积分数为95%的酒精溶液中DNA能析出，但蛋白质杂质能溶解。
答案 √3．洗涤剂能瓦解细胞膜并增加DNA在NaCl溶液中的溶解度。
解析 洗涤剂能瓦解细胞膜，使DNA从细胞中释放出来，但是不能增加DNA在NaCl溶液中的溶解度。
答案 ×4．将DNA丝状物放入二苯胺试剂中沸水浴后冷却变蓝。
解析 将DNA丝状物溶解在2 mol/L的NaCl溶液中，然后加入二苯胺试剂，沸水浴后冷却可观察到蓝色出现。
答案 ×5．加入酒精溶液后，用玻璃棒搅拌DNA滤液时，应顺时针和逆时针交替，这样搅拌更充分。
解析 搅拌时，应缓慢沿一个方向搅拌，防止DNA断裂，以便获得较完整的DNA。
答案 ×6．用玻璃棒缓慢搅拌滤液会导致DNA获得量减少。
解析 在实验过程中用玻璃棒缓慢搅拌滤液的目的是以免加剧DNA分子的断裂，并不会导致DNA含量减少。
答案 ×1．DNA溶解性原理：结合DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线，分析DNA在不同浓度NaCl溶液中的溶解度有何特点。知识点一 DNA粗提取与鉴定的方法 ［互动探究］(1)低于0.14 mol/L时：
________________________________________________________。
(2)高于0.14 mol/L时：
________________________________________________________。 DNA的溶解度随NaCl溶液物质的量浓度增加而逐渐降低 DNA的溶解度随NaCl溶液物质的量浓度增加而逐渐升高2．DNA粗提取的操作思路
DNA与蛋白质在NaCl溶液中的溶解情况如下表。溶解溶解探讨通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出的思路是：用_________的NaCl溶液溶解DNA，然后过滤获得_____，能够去除_______________________；调节NaCl溶液的物质的量浓度为0.14 mol/L，使DNA析出，然后过滤获得_________，能够去除_________________________。2 mol/L滤液该条件下不能溶解的杂质析出物该条件下能够溶解的杂质3．DNA不溶于_________，而细胞中的某些______则溶于酒精溶液，此特点对于提取DNA的作用是___________________________。酒精溶液蛋白质将DNA和蛋白质进一步分离DNA粗提取的三个原理
(1)利用DNA随NaCl溶液浓度的不同而溶解度不同的原理可粗提取DNA。
(2)利用DNA不溶于酒精，而细胞内的其他许多物质可溶于酒精的原理可进一步提纯DNA。
(3)利用DNA对酶和高温的耐受性可以去除蛋白质杂质。［核心归纳］1．下表是关于DNA粗提取与鉴定实验中所使用的材料、操作及其作用，表述正确的是［对点训练］解析 柠檬酸钠溶液的作用是防止血液凝固；蒸馏水与鸡血细胞混合，蒸馏水的作用是让鸡血细胞吸水涨破；蒸馏水加入溶解有DNA的NaCl中，此时蒸馏水的作用是将NaCl溶液的物质的量浓度稀释至0.14 mol/L，从而析出DNA丝状物；将粗提取之后的DNA加入冷却的酒精中以纯化析出含杂质较少的DNA丝状物。
答案 C2．对“DNA的粗提取和鉴定”实验的叙述，正确的是
A．利用DNA能溶而蛋白质不溶于冷酒精溶液，可将DNA与蛋白质分离
B．在用花菜作实验材料时，研磨过程中加入食盐的目的是瓦解细胞膜
C．在DNA滤液中加入嫩肉粉，通过木瓜蛋白酶的作用，可提高DNA纯度
D．利用DNA在0.14 mol/L NaCl溶液中溶解度最大的特点，可将DNA与杂质分离解析 由于DNA不溶于酒精，而其它杂质如蛋白质可以溶于酒精，因此利用体积分数为95%的冷酒精溶液将DNA和蛋白质分离，A错误；提取分离DNA时，加入洗涤剂的目的是瓦解细胞膜，B错误；利用酶的专一性，蛋白酶只能将蛋白质分解，而不能分解DNA，因此在DNA滤液中加入嫩肉粉，通过木瓜蛋白酶的作用，可将DNA与蛋白质分离，从而提高DNA纯度，C正确；DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，在0.14 mol/L NaCl溶液中溶解度最小，D错误。
答案 C1．实验材料的选取：
哺乳动物的红细胞和鸡的血液提取DNA效果更好的是___________。原因是
__________________________________________________________________________。知识点二 DNA的粗提取与鉴定的实验设计 ［互动探究］鸡的血液 鸡血细胞核DNA含量丰富，材料易得，而哺乳动物的红细胞无细胞核，不含DNA2．实验操作分析：
(1)在鸡血细胞液中加入蒸馏水的目的是___________________。
(2)提取菜花的DNA时，加入洗涤剂和食盐的目的是：
①加入洗涤剂的目的：
__________________________________________。
②加入食盐的目的：
__________________________________________。使鸡血细胞吸水涨破洗涤剂能溶解细胞膜，有利于DNA的释放食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解(3)探讨在DNA分子的粗提取实验中，两次向烧杯中加入蒸馏水的目的：使血细胞过度吸水而破裂，以便核物质溶解使NaCl溶液浓度降至0.14_mol/L，以使DNA析出(4)实验过程要充分地搅拌和研磨，如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？
提示：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，导致看不到丝状沉淀物，用二苯胺鉴定不显示蓝色。(5)实验过程中应如何使用玻璃棒搅拌？为什么？
提示：搅拌时玻璃棒不能直插烧杯底部，搅拌要轻缓，并向一个方向搅拌以便获得较完整的DNA分子。DNA粗提取与鉴定实验成功的关键
(1)破碎细胞应彻底充分。
(2)对提取的含杂质较多的DNA进行提纯时，所用的酒精必须经过充分预冷后才能使用。［核心归纳］(3)实验过程中，搅拌时玻璃棒不能直插烧杯底部，并且搅拌要轻缓，并向一个方向搅拌以便获得较完整的DNA分子。
(4)由于玻璃表面带电荷，DNA易被吸附于玻璃表面，故实验中应尽量不使用或少使用玻璃器皿，这样可以提取到较多的DNA。
(5)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。3．图1、2分别为“DNA的粗提取与鉴定”实验中部分操作步骤示意图，下列叙述不正确的是［对点训练］A．图1、2中加入蒸馏水稀释的目的相同
B．图1中完成过滤之后保留滤液
C．图2中完成过滤之后弃去滤液
D．在图1滤液中加入少许嫩肉粉有助于去除杂质解析 图1、2中加入蒸馏水稀释的目的不同，前者是使细胞吸水涨破，后者是析出DNA，A错误；图1中加入蒸馏水使血细胞吸水涨破，完成过滤之后获取含DNA的滤液，所以要保留滤液，B正确；图2中加蒸馏水是使NaCl溶液的浓度降低，DNA析出，所以完成过滤之后弃去滤液，C正确；在图1鸡血细胞液中加入少许嫩肉粉，其中的木瓜蛋白酶能分解DNA中的杂质蛋白，从而有助于去除杂质，D正确。
答案 A 4．下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验叙述，错误的是
A．酵母菌和菜花均可作为提取DNA的材料
B．DNA既溶于2 mol/L NaCl溶液也溶于蒸馏水
C．向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，可见玻棒上有白色絮状物
D．DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热，冷却后变蓝解析 理论上只要含有DNA的生物组织均可作为该实验的材料，因此酵母和菜花均可作为提取DNA的材料，A正确；DNA既可溶于2 mol/L NaCl溶液也溶于蒸馏水，B正确；向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，可使细胞破裂，释放DNA，但不会观察到玻棒上有白色絮状物，C错误；DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热，冷却后变蓝，D正确。
答案 C本讲结束
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课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段
[随堂巩固]
1．下列关于PCR的描述中，正确的是
①PCR是一种酶促反应
②引物决定了扩增的特异性
③扩增DNA利用了热变性的原理
④扩增的对象是氨基酸序列
A．①②④ B．②③④
C．①③④ D．①②③
解析 PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，在高温条件下，把DNA的双链打开，缓慢冷却后，又重新结合，需要耐高温DNA聚合酶，同时，还需要引物，从引物的3′端连接脱氧核苷酸。
答案 D
2.下列关于PCR技术的叙述，错误的是
A．利用了细胞内DNA复制的原理
B．引物是合成子链的条件之一
C．Taq酶在90－95 ℃时会变性
D．每一次循环后目的基因的量增加一倍
解析 PCR技术的原理是DNA分子的复制，A正确；PCR技术需要两个不同的引物，B正确；Taq酶是耐高温的DNA聚合酶，在90－95 ℃时不会变性，C错误；PCR技术的原理是DNA分子的复制，每一次循环后目的基因的量增加一倍，D正确。
答案 C
3．下列关于DNA复制和PCR技术的比较中，描述正确的是
A．两个过程都是边解旋边复制
B．两个过程都是随时都能进行
C．两个过程都需要相同的酶催化
D．两个过程都遵循碱基互补配对原则
解析 DNA复制是边解旋边复制，而PCR是变性→复性→延伸，分开、循环进行。DNA复制发生在细胞有丝分裂间期和减数第一次分裂前的间期，而PCR只要反应条件合适随时可以进行。DNA复制需要DNA解旋酶、DNA聚合酶等，而PCR只需要耐高温的TaqDNA聚合酶，不需要DNA解旋酶。
答案 D
4．小鼠杂交瘤细胞表达的单克隆抗体用于人体试验时易引起过敏反应，为了克服这个缺陷，可选择性扩增抗体的可变区基因(目的基因)后再重组表达。下列相关叙述正确的是
A．设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列
B．用PCR方法扩增目的基因时必须知道基因的全部序列
C．PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶
D．一定要根据目的基因编码产物的特性选择合适的受体细胞
解析 本题考查PCR技术。A项中，设计扩增目的基因的引物时，要考虑扩增的目的基因与载体两端序列碱基互补配对，故错误。B项中，DNA复制沿着模板进行，不必知道基因的全部序列，故错误。C项中，PCR技术中的DNA聚合酶是耐高温的DNA聚合酶，不是从受体细胞中提取的DNA聚合酶，故错误。D项中，目的基因编码产物不同，相应的受体细胞不同，故正确。
答案 D
5．PCR技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行研究的问题，而被广泛应用，此过程需要一种Taq DNA聚合酶。请回答有关问题：
(1)体内DNA复制过程中用解旋酶打开双链DNA，而PCR技术中应用____________。
(2)Taq DNA聚合酶是从水生耐热细菌Taq中分离的。
Taq DNA聚合酶的功能是_________________________________________。
(3)相对于细菌分离，DNA分子的分离和提取操作要复杂的多。
①在DNA提取中两次用到蒸馏水，其目的分别是____________、____________。
②实验中能否以哺乳动物成熟的红细胞为实验材料？为什么？____________________。
(4)与体内DNA复制相比较，PCR反应要在____________中才能进行，并且要严格控制________条件。
(5)PCR中加入的引物有________种，加入引物的作用是________________。
解析 (1)PCR技术中用高温使DNA分子中的氢键打开，从而解旋。
(2)在DNA分子复制中，Taq DNA聚合酶将一个脱氧核苷酸的脱氧核糖和另一脱氧核苷酸的磷酸连结形成磷酸二酯键。
(3)①在使用蒸馏水时，第一次使血细胞破裂，第二次使NaCl溶液浓度降低至0.14 mol/L。
②哺乳动物成熟的红细胞中无DNA分子，不能用它作为DNA分子分离和提取的材料。
(4)PCR反应是在一定的缓冲溶液中进行的，并需严格控制好温度条件。
(5)PCR中与体内DNA复制过程中的原料是完全相同的，并加入小段单链DNA作为引物，引导DNA复制，可以使游离的脱氧核苷酸与之结合形成磷酸二酯键，成为DNA复制的起点。
答案 (1)高温使DNA分子热变性
(2)催化脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键
(3)①使血细胞破裂，释放出DNA分子 稀释NaCl溶液，使DNA分子析出 ②不能，哺乳动物成熟的红细胞中无DNA分子
(4)一定的缓冲溶液 温度
(5)2 作为DNA复制的起点
[限时检测]
[时间45分钟，满分80分]
一、选择题(每小题5分，共50分)
1．以下为形成cDNA过程和PCR扩增过程示意图，据图分析，下列说法正确的是
A．催化②⑤过程的酶都是DNA聚合酶，都能耐高温
B．催化①过程的酶是RNA聚合酶
C．④过程发生的变化是引物与单链DNA结合
D．如果RNA单链中A与U之和占该链碱基含量的40%，则一个双链DNA中，A与U之和也占该DNA碱基含量的40%
解析 图中②⑤过程为形成子链，这两个过程都需要DNA聚合酶的催化，其中⑤过程进行的温度是70～75 ℃，因此催化该过程的DNA聚合酶能耐高温，但催化②过程的酶不耐高温，A错误；①为逆转录过程，该过程需要逆转录酶的催化，B错误；④为复性过程，发生的变化是引物与互补DNA链结合，C正确；根据碱基互补原则A－T，U－A，如果RNA单链中A与U之和占该链碱基含量的40%，则一个双链DNA中，A与T之和也占该DNA碱基含量的40%，而DNA分子中不含碱基U，D错误。
答案 C
2．下列关于PCR反应体系中所加物质作用的描述，错误的是
A．热稳定的DNA聚合酶用于合成DNA子链
B．引物使Taq酶能从引物的5′端延伸DNA链
C．四种游离脱氧核苷酸用于合成子链的原料
D．目标DNA母链用于合成DNA复制的模板
解析 PCR反应体系中，DNA聚合酶催化合成DNA子链；引物使DNA聚合酶能从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸；四种游离的脱氧核苷酸是用于合成子链的原料；DNA母链提供DNA复制的模板。故选B。
答案 B
3．在PCR反应中，只有一个DNA的片段作为模板，经过三次循环后，含引物I的DNA单链占DNA总链数的
A．1/2 B．1/4
C．1 D．7/16
解析 聚合酶链式反应(PCR)技术是在人为条件下进行的DNA分子复制技术，而DNA复制为半保留方式，经过3次循环即复制3次，则合成23个DNA拷贝，共16条单链，而含有引物Ⅰ的DNA除亲代DNA片段外，其余每个DNA片段都有一条单链含引物Ⅰ，所以，含引物I的DNA单链占DNA总链数的7/16，选D。
答案 D
4．(2019·荆门检测)下列有关PCR技术的叙述，正确的是
A．作为模板的DNA序列必须不断地加进每一次的扩增当中
B．作为引物的脱氧核苷酸序列必须不断地加进每一次的扩增当中
C．反应需要的DNA聚合酶必须不断地加进反应当中
D．反应需要的DNA连接酶必须不断地加进反应当中
解析 模板DNA只需要加入一次，A项错误；引物在合成过程中不断被利用，需要不断加入，B项正确；DNA聚合酶可反复使用，C项错误；PCR技术中用到耐热的DNA聚合酶，D项错误。
答案 B
5．SRY基因为Y染色体上的性别决定基因，可用SRY—PCR法鉴定胚胎性别，其基本程序如图。相关说法正确的是
―→―→
A．PCR扩增的操作步骤依次是：高温变性、中温复性、低温延伸
B．上述过程需要使用的工具酶之一是RNA聚合酶
C．PCR技术中以核糖核苷酸为原料，以指数方式扩增
D．SRY探针能与雄性胚胎样品中DNA配对
解析 PCR扩增的操作步骤依次是高温变性、低温复性及适温延伸等，A项错误；上述过程需要使用的工具酶之一是热稳定DNA聚合酶，B项错误；PCR技术的原理是DNA双链的复制，其产物是大量的DNA，所以需要以脱氧核苷酸为原料，C项错误；SRY基因为Y染色体上的性别决定基因，SRY探针是用位于Y染色体上的性别决定基因(SRY基因)制成的，因此SRY探针能与雄性胚胎样品中DNA配对，D项正确。
答案 D
6．复性温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40～60 ℃，可使引物和模板发生结合。PCR的结果可不考虑原来解旋开的两个DNA模板链的重新结合，原因是
A．引物是人工合成的
B．引物为DNA聚合酶提供了3′端
C．加入引物的量足够多而模板链数量少
D．模板链加热解旋已经变性不可能再次结合
解析 PCR的结果可不考虑原来解旋开的两个DNA模板链的重新结合，原因是引物的量足够多，而模板链数量少。
答案 C
7．在实验室中，做PCR时通常使用的微量离心管是一种薄壁塑料管，此过程可以使用玻璃离心管吗，为什么？
A．可以，玻璃离心管、塑料微量离心管都可以使用
B．不可以，玻璃离心管易碎，使用不安全
C．不可以，玻璃离心管一般较大，不适合作为微量离心管
D．不可以，玻璃离心管容易吸附DNA
解析 玻璃离心管容易吸附DNA，在进行DNA操作时应选用塑料器皿。
答案 D
8．多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述三十多次循环：95 ℃下变性(使模板DNA解旋)→55 ℃下复性(引物与DNA模板链结合)→72 ℃下延伸(形成新的脱氧核苷酸链)。下列有关PCR过程的叙述中不正确的是
A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现
B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对
C．延伸过程中需要DNA聚合酶和四种核糖核苷酸
D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高
解析 变性是为了使DNA内部的氢键断裂，双螺旋打开，体内复制时借助解旋酶来实现；借助碱基互补配对原则，引物可与DNA模板链结合；延伸时是形成新的DNA分子，需要以脱氧核苷酸为原料；PCR过程的温度高，会导致一般的DNA聚合酶失活，需特定的耐高温DNA聚合酶。
答案 C
9．下列对PCR技术的叙述，错误的是
A．PCR技术的原理是DNA复制
B．PCR是一种酶促反应，需耐高温的解旋酶和DNA聚合酶
C．一个DNA片段经PCR扩增，可以形成2n个DNA片段(n代表循环次数)
D．PCR利用了DNA的热变性来控制DNA的解旋与结合
解析 PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它以极少量的DNA为模板，以四种脱氧核苷酸为原料，在引物作用下使DNA聚合酶从引物的3′端连接脱氧核苷酸，短时间内迅速复制上百万份的DNA拷贝。PCR利用DNA在不同温度下变性解旋或复性的特性来解旋并结合引物，不需要用解旋酶来解旋。
答案 B
10．下列关于DNA复制和PCR的描述中，正确的是
A．DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5′端延伸DNA链
B．DNA复制不需要引物
C．引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合
D．PCR扩增的对象是核糖核苷酸序列
解析 由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链，故DNA复制需要引物，而且它与DNA母链通过碱基互补配对结合。PCR扩增的对象是DNA，即脱氧核苷酸序列而不是核糖核苷酸序列。
答案 C
二、非选择题(共3小题，共30分)
11．(10分)RT－PCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应相结合的技术，具体过程如图所示：
(1)过程Ⅰ需要加入缓冲液、原料、________________、________________和引物A等。
(2)过程Ⅱ首先要将反应体系的温度升高到95 ℃，其目的是________________________，该反应体系中所用的Taq聚合酶至少应能耐受________℃。
(3)过程Ⅱ模拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，理论上至少需要________个引物B。
(4)利用RT－PCR技术获取的目的基因________(填“能”或“不能”)在物种之间交流；该技术还可用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度，原因是________________________。
(5)RT－PCR过程中主要借助对____________________的控制，影响酶的活性，从而使得化学反应有序高效地进行。
解析 试题分析：PCR技术的原理是模拟生物体内DNA分子复制的过程，利用DNA分子热变性原理，通过控制温度控制DNA分子的解旋和结合，DNA分子体内复制过程中DNA的解旋是在解旋酶的作用下实现的；PCR扩增DNA片段过程最高经过n次扩增，形成的DNA分子数是2n个，其中只有2条单链不含有引物。分析题图：过程Ⅰ是由mRNA形成cDNA的过程，表示逆转录．过程Ⅱ先使mRNA－cDNA杂合双链解开，再以单链的DNA合成双链的DNA，最后利用RCR技术进行DNA复制。
(1)过程Ⅰ是由mRNA形成cDNA的过程，表示逆转录，需要加入缓冲液、原料、RNA提取物、逆转录酶和引物A等。
(2)过程Ⅱ首先要将反应体系的温度升高到95 ℃，其目的是让逆转录酶变性失活、使mRNA－cDNA杂合双链解开，该反应体系中所用的Taq酶至少应能耐受95 ℃。
(3)过程Ⅱ模拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，理论上至少需要2n－1个引物B。
(4)利用RT－PCR技术获取的目的基因能在物种之间交流；该技术还可用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度，原因是增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量(或浓度)，便于检测。
(5)RT－PCR过程中主要借助对温度的控制，影响酶的活性，从而使得化学反应有序高效地进行。
答案 (1)RNA提取物 逆转录酶 (2)让逆转录酶变性失活、使mRNA－cDNA杂合双链解开 95 (3)2n－1 (4)能 增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量(或浓度)，便于检测 (5)温度
12．(12分)(2017·江苏)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题：
(1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过________获得________用于PCR扩增。
(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的________________位点。设计引物时需要避免引物之间形成________________，而造成引物自连。
(3)图中步骤1代表________，步骤2代表复性，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。
(4)PCR扩增时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏________________的碱基配对。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但________________的引物需要设定更高的复性温度。
(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有________(填序号：①升高复性温度 ②降低复性温度 ③重新设计引物)。
解析 (1)由mRNA获得目的基因片段需要通过逆转录，获得的片段为cDNA。
(2)为方便构建重组质粒，可在引物中增加适当的限制性核酸内切酶位点，以便使复制出的目的基因两端含限制性核酸内切酶切点；设计引物时，需避免引物之间碱基互补配对，以防引物间自连。
(3)图中步骤1为高温下实现DNA变性解链。
(4)PCR扩增时，若复性温度过高会破坏引物与模板间的碱基互补配对。DNA片段中G与C间可形成三个氢键，GC碱基含量越高的DNA分子越稳定，其复性温度应越高。
(5)若PCR反应得不到任何扩增产物，则可通过降低复性温度及重新设计引物等措施，以便使引物与模板结合，从而进行后序扩增过程。
答案 (1)逆转录 cDNA
(2)限制性核酸内切酶 碱基互补配对
(3)变性 (4)引物与模板 GC碱基含量高
(5)②③
13．(8分)聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，由1983年美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链式反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。到如今2013年，PCR已发展到第三代技术。1973年，台湾科学家钱嘉韵，发现了稳定的Taq DNA聚合酶，为PCR技术发展也做出了基础性贡献。下图为PCR扩增中第一轮的变化，结合所学回答下列问题：
(1)PCR是一项在生物____________复制特定DNA片段的核酸合成技术，它是利用____________的原理，将基因的核苷酸序列不断的加以复制，使其数量呈____________方式增加。利用PCR技术扩增目的基因的前提，是要有____________________________________________________________________。
(2)PCR技术每一轮扩增中，需要参与的引物有____________种，引物的本质是____________，PCR扩增中需要dATP、dTTP、dCTP、dGTP的参与，它们的作用是____________________。参与PCR扩增的酶是Taq聚合酶，它与普通的DNA聚合酶相比，特点是__________________________________________。
解析 试题分析：解答本题需识记有关PCR技术的相关知识：
①概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。
②原理：DNA复制。
③前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。
④过程：高温变性：DNA解旋过程；低温退火(复性)：引物结合到互补链DNA上；中温延伸：合成子链，PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。
(1)PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，其原理是DNA双链的复制，将基因的核苷酸序列不断的加以复制，使其数量呈指数方式增加。利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列。
(2)PCR技术每一轮扩增中，需要不同的2种引物，引物的本质是单链DNA，PCR扩增中需要dATP、dTTP、dCTP、dGTP的参与，提供能量和原料。参与PCR扩增的酶是Taq聚合酶具有耐高温的特点。
答案 (1)体外 DNA双链复制 指数(或2n) 一段已知目的基因的核苷酸序列 (2)2 单链DNA(单链DNA或RNA) 提供能量和原料 耐高温
课件46张PPT。课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段 1．PCR原理：
(1)概念：PCR，即___________反应，能以_______________为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝，是一种体外迅速_____________的技术。一、PCR原理与反应过程［基础梳理］多聚酶链式极少量的DNA扩增DNA片段半保留 80～100 ℃ 复性 (3)条件。
①模板：________________。
②引物：分别与两条模板链相结合的________。
③原料：四种______________。
④酶：______的DNA聚合酶，一般选用___________________。
⑤其他条件：需要稳定的pH和能严格控制温度的温控设备。DNA的两条单链两种引物脱氧核苷酸耐热Taq_DNA聚合酶2．PCR的反应过程：
(1)循环次数：一般是________次。
(2)过程。
①变性：当温度上升到___________时，双链DNA_____________。
②复性：温度下降到____________，两种引物通过______________与两条单链DNA结合。三十多90 ℃以上解聚为单链50 ℃左右碱基互补配对③延伸：温度上升到____________，溶液中的四种脱氧核苷酸在______________的作用下，根据_____________原则合成新的DNA链。
(3)结果：DNA聚合酶只能特异地复制处于_________之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈_______扩增。72 ℃左右DNA聚合酶碱基互补配对两个引物指数1．实验步骤：
准备：按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上
↓
移液：用_____________按照配方在微量离心管中依次加入各组分
↓ 二、PCR的实验操作 微量移液器混合：盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液___________
↓
离心：将微量离心管放在离心机上，离心约10 s。目的是使反应液集中在______________
↓
反应：将离心管放入___________中，设置程序进行反应混合均匀离心管底部PCR仪2．操作提示：
(1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的一些用具及缓冲液、蒸馏水等在使用前必须进行____________。
(2)PCR所用的缓冲液和酶应______________，并在___________下储存。高压灭菌分装成小份－20 ℃(3)在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都__________。所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液__________。必须更换混合均匀3．实验中DNA含量的测定：
(1)原理：DNA在__________的紫外线波段有一强烈的吸收峰。峰值的大小与________的含量有关。可以利用DNA这一特点进行DNA含量的测定。
(2)过程。
①稀释：取2 μL PCR反应液，加入98 μL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释。260 nmDNA②对照调零：以________作为空白对照，在波长_____ nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。
③测定：取DNA稀释液100 μL至比色杯中，测定___ nm处的光吸收值。
④计算：DNA含量(μg/mL)＝
_____________________________。蒸馏水26026050×(260_nm的读数)×稀释倍数1．DNA聚合酶能延伸子链的3′端或5′端。
解析 DNA聚合酶只能延伸子链的3′端。
答案 ×［即时反馈］2．PCR反应始终在高于70 ℃的条件下进行。
解析 PCR反应中要调控不同温度，不能始终在同一温度下进行。
答案 ×3．PCR扩增与体内DNA复制不同，前者通过高温解开双链，后者通过解旋酶解开双链。
答案 √4．PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行。
答案 √1．PCR原理：
(1)PCR反应与体内DNA复制的引物在化学本质上是否相同？请分析原因。知识点一 PCR原理与反应过程 ［互动探究］提示：不相同。体内DNA复制所需引物为RNA聚合酶合成的一小段RNA，但PCR反应时所用引物是人工加入的一小段DNA。(2)判断PCR是否需要以下两种酶，说明判断的理由。
①解旋酶
判断：_______(填“是”或“否”)。
理由：
___________________________________________________________________________________。否 PCR中解旋是通过控制温度实现的，在80～100 ℃的温度内，DNA的双螺旋结构被打开②DNA聚合酶
判断：_____(填“是”或“否”)。
理由：
________________________________________________________________________。是 DNA聚合酶能将单个核苷酸加到已有的单链片段的3′端上，但该酶需耐高温2．PCR反应过程：
(1)PCR的每次循环中应如何控制温度？请分析原因。
提示：每次循环中先高温解旋，再低温使引物与模板结合，最后适当升温有利于Taq DNA聚合酶发挥作用。(2)结合下图分析PCR过程中DNA链复制的方向是怎样的。提示：DNA聚合酶能从引物的3′端开始延伸DNA链．DNA链复制的方向总是从子链的5′端向3′端延伸。PCR扩增与DNA复制的异同［核心归纳］1．PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，下列有关PCR过程的叙述，不正确的是［对点训练］A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键
B．复性过程中引物与DNA模板链的结合依靠碱基互补配对原则完成
C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸
D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高解析 变性过程是打开DNA双链之间的氢键，A正确。复性过程是引物与DNA模板根据碱基互补配对而形成氢键，B正确。延伸过程需要的是Taq酶，ATP和四种脱氧核糖核苷酸，C错误。PCR与细胞内DNA复制相比需要的酶的温度高，D正确。
答案 C 2．有关PCR技术的说法，错误的是
A．是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术
B．PCR技术的原理是DNA双链复制
C．操作过程要有一段已知目的基因的核苷酸序列
D．PCR扩增中必须有解旋酶才能解开双链DNA解析 PCR技术是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，A正确；PCR技术的原理是DNA双链复制，B正确；PCR技术的前提是要有一段已知的目的基因的核苷酸序列，以便根据该核苷酸序列合成引物，C正确；双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA，可见该过程不需要解旋酶解开双链DNA，D错误。
答案 D1．实验过程分析：
(1)分析离心的目的，说出离心管盖子盖严的原因。
①离心的目的是
_______________________________________。知识点二 PCR的实验操作 ［互动探究］使反应液集中在离心管底部，提高反应效率②离心管的盖子一定要盖严，原因是
______________________________。
(2)离心前用手轻轻弹击离心管侧壁的目的是____________________。防止实验中脱落或液体外溢使反应液混合均匀(3)PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌，为什么这样操作？还有哪项操作与此目的相同？
提示：为避免外源DNA等的污染。在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。2．结果检测：
(l)实验中为什么要测定DNA的含量？
提示：实际操作过程中会有许多因素影响DNA含量，所以需要对DNA含量进行测定。(2)如何判断DNA扩增成功？
提示：①可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果。
②电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。PCR扩增的注意事项
(1)DNA复制需要引物的原因：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链。PCR中，引物长度通常为20～30个核苷酸。［核心归纳］(2)当DNA变性后PCR反应体系的温度快速冷却到50 ℃左右时，引物与模板可结合，一般不需要考虑解开的两个DNA模板链的重新结合，原因是：
①模板DNA链比引物长得多而且复杂得多，不易重新结合。
②引物和模板之间的碰撞机会远远高于模板互补链之间的碰撞机会。
③加入的引物的量足够大，而模板链数量少。3．(2019·德州检测)下列对PCR操作过程的叙述，错误的是［对点训练］A．PCR反应中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌
B．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存
C．PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化
D．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的吸液枪头都必须更换解析 为了避免外源DNA等因素的污染，PCR反应中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌；PCR所用的缓冲液及酶应分装成小份保存，并使用一次性吸液枪头。在冰箱中放置的缓冲液和酶取出后应放在冰块上缓慢融化，而不能迅速融化。
答案 C4．PCR利用了DNA的热变性原理，PCR仪实际上也是一种能自动调控温度的仪器。对PCR过程中“温度的控制”的说法，错误的是
A．PCR反应需要高温，是为了确保模板是单链
B．延伸的温度必须大于复性温度而小于变性温度
C．要用耐高温的DNA聚合酶
D．需要耐高温的解旋酶解析 解答本题需明确：
PCR技术三个反应阶段的温度及主要目的。
DNA的热变性原理。
PCR是体外DNA扩增技术，DNA双链的解开不需要解旋酶，而是靠高温使其变性解体。复性后，在耐高温的Taq DNA聚合酶的作用下根据碱基互补配对原则合成新的DNA，因此延伸的温度要大于复性温度但小于变性温度。
答案 D本讲结束
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课题3 血红蛋白的提取与分离
[随堂巩固]
1．有资料显示，在非洲，镰刀型细胞贫血症基因的携带者更能适应当地的环境。有人认为这种人的血红蛋白可能与正常人或镰刀型细胞贫血症病人的有一定差异。为证实这种猜想，需对携带者的血红蛋白进行检测，而检测前需要分离得到这种血红蛋白。试想分离提纯镰刀型细胞贫血症携带者(Aa)的血红蛋白时，用不到的药品或仪器是
A．琼脂糖 B．磷酸缓冲液
C．离心机 D．二苯胺
解析 二苯胺是鉴定、检测DNA的化学试剂，与分离提纯血红蛋白无关，所以不需要该药品，选D。
答案 D
2．用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质
A．路程较长，移动速度较慢
B．路程较长，移动速度较快
C．路程较短，移动速度较慢
D．路程较短，移动速度较快
解析 当不同相对分子质量的蛋白质通过凝胶柱时，分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程长移动的速度慢，而分子量大的蛋白质分子不容易进入凝胶内部的通道，路程短，移动的速度快，最先洗脱出来，故选D。
答案 D
3．将释放出的血红蛋白以2 000 r/min的速度离心10 min后，可以看到试管中的溶液分为4层，其中哪一层是血红蛋白的水溶液
A．第一层无色透明 B．第二层白色
C．第三层红色透明 D．第四层暗红色
解析 分离血红蛋白溶液时，将搅拌好的混合液转移到离心管中，经过中速长时离心后，可明显看到试管中溶液分为4层，从上往下数，第1层为甲苯层，第2层为脂溶性物质的沉淀层，第3层为血红蛋白水溶液，第4层为杂质沉淀层。所以C正确。A、B、D不正确。
答案 C
4．根据血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱示意图分析，所带负电荷最多的球蛋白是
A．α1-球蛋白 B．α2-球蛋白
C．β-球蛋白 D．γ-球蛋白
解析 根据电泳的原理进行分析，带电粒子在电场中向与其电性相反的电极泳动的现象称为电泳。因此移动越慢的，所带负电荷就越少(点样是在负极)。
答案 A
5．下图甲乙表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请回答下列问题：
(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，其在红细胞中的作用体现了蛋白质具有____________功能。
(2)甲装置中，B是血红蛋白溶液，则A是________________；乙装置中，C溶液的作用是________________________。
(3)甲装置用于____________，目的是____________________________。用乙装置分离蛋白质的方法叫________________，是根据______________________分离蛋白质的有效方法。
(4)用乙装置分离血红蛋白时，待________________接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集。
(5)血红蛋白提取和分离的程序可分为四步：样品处理、粗分离纯化、纯度鉴定。其中样品处理包括________________、________________、收集血红蛋白溶液。
解析 试题分析：(1)血红蛋白具有运输氧气的作用。
(2)透析是将血红蛋白溶液装入透析袋，放入磷酸缓冲液。C磷酸缓冲液的作用是洗脱血红蛋白。
(3)甲装置用于透析(粗分离)，目的是去除样品中分子量较小的杂质。乙装置分离蛋白质的方法叫凝胶色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。
(4)乙装置分离血红蛋白时，待红色的蛋白质(血红蛋白)接近色谱柱底端时，用试管收集流出液。
(5)样品处理包括：红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、收集血红蛋白溶液。
答案 (1)运输 (2)磷酸缓冲液 洗脱血红蛋白 (3)透析(粗分离) 去除样品中分子量较小的杂质 凝胶色谱法 相对分子质量的大小 (4)红色的蛋白质 (5)红细胞的洗涤 血红蛋白的释放
[限时检测]
[时间45分钟，满分80分]
一、选择题(每小题5分，共50分)
1．下列试剂可用于血红蛋白释放的是
①0.9%的生理盐水 ②甲苯 ③磷酸缓冲液 ④蒸馏水 ⑤柠檬酸钠
A．①③ B．①④
C．④⑤ D．②④
解析 0.9%的生理盐水是洗涤红细胞时应用的试剂，不能用于血红蛋白释放，①错误；甲苯的作用是溶解细胞膜的磷脂，加速血红蛋白的释放，②正确；磷酸缓冲液用于粗分离蛋白质，不能用于释放血红蛋白，③错误；蒸馏水作用是使红细胞吸水胀破，释放其中的血红蛋白，④正确；柠檬酸钠的作用是采血时，防止血液凝固，不能用于血红蛋白的释放，⑤错误。故选D。
答案 D
2．以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确的是
A．洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂
B．猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少
C．血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测
D．在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢
解析 A项，生理盐水与细胞内液渗透压相近，可避免在洗涤过程中红细胞因外界渗透压较小而吸水涨破，即A项表述正确，故不选择A项。B项，不成熟的红细胞有细胞核，细胞质中有各种细胞器，可以转录、翻译等，从而形成血红蛋白与呼吸作用相关的酶。成熟后细胞核和细胞器退化，细胞质中主要成分成为血红蛋白，所以哺乳动物成熟的红细胞中杂蛋白较少，即B项表述正确，故不选择B项。C项，血红蛋白属于有色蛋白，因此在凝胶色谱法分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液，如果操作严谨正确，还可以清楚的观察到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整的随洗脱液缓慢流出，这使得血红蛋白的分离过程非常直观简捷，即C项表述正确，故不选择C项。D项，凝胶色谱法也称作分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快，因此二者得以分离，所以血红蛋白分子要比分子量较小的杂蛋白移动快，即D项表述错误，故选择D项。
答案 D
3．下列有关提取和分离血红蛋白的叙述，错误的是
A．样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液
B．通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取
C．可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化
D．可通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度
解析 样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液，所以A正确；通过透析可以去除样品中分子质量较小的杂质，此为样品的粗提取，B错误；可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化，C正确；SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳法是蛋白质纯化鉴定使用最多的方法，所以D正确。
答案 B
4．如图表示对某蛋白质溶液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果(类似于纸层析法分离色素)，下列相关叙述不正确的是
A．蛋白质上某些基团解离后可使蛋白质带电，电场中带电的蛋白质分子(或多肽)会向着与其所带电荷相反的电极移动
B．蛋白质在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率完全取决于其所带净电荷多少
C．蛋白质在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率基本取决于其相对分子质量的大小
D．电泳结果表明溶液中蛋白质可能有两种，但也可能只有一种
解析 蛋白质的氨基与羧基可发生偏离，使其带正电或负电，在电场中发生迁移。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳所加的SDS可掩盖蛋白质本身所带电荷，故电泳迁移率与本身所带电荷无关，而由其分子大小决定。SDS会使蛋白质解聚成单条肽链，故结果所示可能只是一种蛋白质(有两种肽链)，也可能是两种。
答案 B
5．电泳过程中，什么样的分子迁移速度最快
A．纤维状、大分子 B．纤维状、小分子
C．球状、大分子 D．球状、小分子
解析 电泳就是利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同迁移速度。一般来说，球状分子比纤维状分子易移动，小分子比大分子易移动。
答案 D
6．下列关于血红蛋白提取和分离的过程及原理叙述，正确的是
A．为了防止血液凝固，应在采血器中预先加入抗凝血剂柠檬酸钠
B．红细胞洗涤使用5倍体积的蒸馏水，直到离心后上清液不呈现黄色为止
C．利用0.9%的NaCl对血红蛋白溶液的透析12小时，可以去除小分子杂质
D．在凝胶柱中加入蛋白样品后即可连接缓冲溶液洗脱瓶进行洗脱和收集样品
解析 为了防止血液凝固，应在采血器中预先加入抗凝血剂柠檬酸钠，A正确；红细胞洗涤使用5倍体积的生理盐水，直到离心后上清液不呈现黄色为止，B错误；利用磷酸缓冲液对血红蛋白溶液透析12小时，可以去除小分子杂质，C错误；在凝胶柱中加入蛋白样品后，等样品完全进入凝胶层后才能连接缓冲溶液洗脱瓶进行洗脱和收集样品，D错误。
答案 A
7．下列是关于血红蛋白的提取和分离实验中关键步骤，其中正确的是
A．蛋白质的提取和分离一般可分为粗分离、样品处理、纯化、纯度鉴定等4步
B．蛋白质的提取和分离实验可以以猪、牛、羊、蛙等动物的血液为材料分离血红蛋白
C．对样品的处理过程分为红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、透析和分离血红蛋白等
D．对蛋白质的纯化和纯度鉴定的方法使用最多的是SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
解析 蛋白质的提取和分离一般可分为样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定等4步，A项错误；一般用哺乳动物如牛、羊的成熟的红细胞作为实验材料提取和分离血红蛋白，而不用鸡、蛙等动物的血液为材料，B项错误；对样品的处理过程分为红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液和透析等，C项错误；对蛋白质的纯度鉴定的方法中，使用最多的是SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳，D项正确。
答案 D
8．从细胞中提取某种特定的蛋白质比提取DNA难度大，其原因不是
A．蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件更敏感，更易失活
B．蛋白质的空间结构多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的提取没有统一的方法
C．提取某种特定的蛋白质需据其特性摸索提取的程序
D．提取血红蛋白程序可分为样品处理、粗分离、纯化、纯度的鉴定四大步
解析 蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件更敏感，更易失活，而DNA分子相对来讲比较稳定，这些区别是提取某种特定的蛋白质比提取DNA难度大的原因之一，A项不符合题意；蛋白质的空间结构多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的提取没有统一的方法，而且还需要依据蛋白质的特性摸索提取的程序，这些也是提取蛋白质的难度较大的原因，B、C项不符合题意；提取血红蛋白程序可分为样品处理、粗分离、纯化、纯度的鉴定四大步，这是提取蛋白质的步骤，不是提取蛋白质难度大的原因，D项符合题意。
答案 D
9．蛋白质的分离与提纯技术是蛋白质研究的重要技术，下列有关叙述不正确的
A．根据蛋白质分子不能通过半透膜的特性，可将样品中各种不同蛋白质分离
B．根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小，可通过电泳分离蛋白质
C．根据蛋白质相对分子质量的大小，可通过凝胶色谱法分离蛋白质
D．根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法分离蛋白质
解析 蛋白质分子不能通过半透膜，但溶液中的小分子物质则可以透过半透膜，因此可以将蛋白质和溶液中的小分子物质分离，A项错误；电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小，可通过电泳使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现蛋白质分子的分离，B项正确；凝胶色谱法的原理是：分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快，而分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢，所以可以根据蛋白质相对分子质量的大小，通过凝胶色谱法使大分子的蛋白质先洗脱出来，小分子的蛋白质后洗脱出来，从而实现蛋白质分子的分离，C项正确；根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法使不同密度的蛋白质分子位于不同层次的离心液中，从而实现蛋白质的分离，D项正确。
答案 A
10．已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种物质，其分子大小、电荷的性质和数量情况如图所示。下列叙述正确的是
A．将样品以2000 r/min的速度离心10 min，若分子戊存在于沉淀中，则分子甲也一定存在于沉淀中
B．若五种物质为蛋白质，则用凝胶色谱柱分离时，甲的移动速度最快
C．将样品装入透析袋中透析12 h，若分子乙保留在袋内，则分子甲也保留在袋内
D．若五种物质为蛋白质，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白质分子，则分子甲和分子丙形成的电泳带相距最远
解析 分子戊分子量大于甲，以2000 r/min的速度离心10 min，若分子戊存在于沉淀中，则分子甲不一定存在于沉淀中，A错。丙的分子量最大，用凝胶色谱柱分离时，丙的移动速度最快，B错。透析12h，由于甲分子量较小，若分子乙保留在袋内，则分子甲不一定保留在袋内，C错。分子甲和分子丙相差最大，移动速度相差最大，D正确。
答案 D
二、非选择题(共3小题，共30分)
11．(10分)红细胞含有大量的血红蛋白，我们可以选用猪、牛、羊或其他哺乳动物的血液来提取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题：
(1)实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，经处理并离心，收集血红蛋白溶液。
①加入柠檬酸钠的目的是________________________。
②以上所述的过程为样品处理，它包括________________、______________、分离血红蛋白溶液。
(2)收集的血红蛋白溶液可以在透析袋中透析，这就是样品的粗分离。
①透析的目的是________________。
②透析过程中需要用到________缓冲液。
(3)通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。
①凝胶色谱法是根据________________分离蛋白质的方法。
②加入SDS可以使蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率完全取决于________________。
解析 (1)柠檬酸钠是一种抗凝血剂，加入柠檬酸钠可以防止血液凝固；样品处理包括红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液。(2)透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内，透析可以去除样品中分子量较小的杂质。(3)凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法。
答案 (1)①防止血液凝固 ②红细胞的洗涤 血红蛋白的释放 (2)①去除分子量较小的杂质 ②磷酸 (3)①相对分子质量的大小 ②分子的大小
12．(10分)下面是某研究小组开展的“猪血浆某白蛋白的提取及分子量测定”的研究，请完成下列有关问题。
材料仪器：新鲜猪血、低速冷冻离心机、透析袋、电泳仪等。
化学试剂：pH为7.4的缓冲液、柠檬酸钠、奈氏试剂(与NH反应出现黄色或红棕色沉淀)、饱和度为55%的(NH4)2SO4溶液、生理盐水等。
实验步骤：
(1)样品获取：向新鲜猪血中加入________________以防止血液凝固，静置一段时间后取上层血浆。
(2)盐析法粗提蛋白质：
①向血浆中加入一定体积的饱和度为55%的(NH4)2SO4溶液，充分混合后静置、离心，取沉淀物，向沉淀物中加入适量生理盐水使之溶解；
②重复步骤①2～3次，最后用生理盐水将沉淀溶解即得到粗提品，盐析粗提“血浆某白蛋白”的主要原理是
____________________________________________________________________________________________________________________________________，
重复步骤①的主要目的是_________________________________________。
(3)透析除盐：将粗提品装入透析袋，以pH为7.4的缓冲液作透析液，每隔4 h更换一次透析液，每次更换前利用奈氏试剂检测透析液中NH的量。利用缓冲液作透析液的原因是_________________________________________________
_______________________________________________________________。
检测中，若观察到透析液___________________________________________时，
即可终止透析。
(4)凝胶色谱法分离：透析后的样品经凝胶柱洗脱，获得纯净血浆某白蛋白样品。
(5)分子量测定：化学物质SDS能使蛋白质变性并解聚成单条肽链。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中加入一定量的SDS，使电泳迁移率完全取决于肽链的分子大小。如图为本实验中用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血浆某白蛋白的结果。根据电泳结果，某同学得到“提取的血浆某白蛋白有两条肽链”的结论，这种说法可靠吗？理由是：________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
解析 (1)为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝剂柠檬酸钠。(2)盐析粗提“血浆某白蛋白”的主要原理是该血浆白蛋白在饱和度为55%的(NH4)2SO4溶液中溶解度低；重复步骤①的主要目的是除去更多的杂蛋白。(3)强酸、强碱、温度过高都会使蛋白质发生变性，利用缓冲液作透析液的原因是避免pH发生变化对蛋白质结构造成破坏；检测中，若观察到透析液中不出现黄色或红棕色沉淀时，即可终止透析。(5)电泳的原理是待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子的大小、形状等的不同，使带电分子产生不同的迁移速率；本实验只能判断提取的血浆某白蛋白有两种大小不同的肽链，而不能判断肽链的条数。
答案 (1)(适量的)柠檬酸钠
(2)该血浆白蛋白在饱和度为55%的(NH4)2SO4溶液中溶解度低 除去更多的杂蛋白
(3)避免pH发生变化对蛋白质结构造成破坏 不出现黄色或红棕色沉淀
(4)不可靠，结果只能说明提取的血浆某白蛋白含有两种大小不同的肽链，不一定是两条
13．(10分)随着人类基因组计划的进展和多种生物基因组测序工作的完成，人类跨入了后基因组和蛋白质组时代。对蛋白质进行研究时，首先要获得纯度较高的蛋白质。下图是某生物兴趣小组在“蛋白质的提取和分离”实验中，准备从猪的血液中初步提取血红蛋白，设计的“血红蛋白提取、分离流程图”：
―→―→―→
请回答下列有关问题：
(1)样品处理中红细胞的洗涤要用____________反复冲洗、离心。向红细胞悬液中加入一定量的低浓度pH 7.0的缓冲液并充分搅拌，可以破碎红细胞，破碎细胞的原理是________________。
(2)血红蛋白粗分离阶段，透析的目的是____________________，若要尽快达到理想的透析效果，可以________________________(写出一种方法)。
(3)血红蛋白的纯化是通过________法将相对分子质量大的杂质蛋白除去。
(4)电泳利用了待分离样品中各种分子的________________________等的差异，而产生不同迁移速度，实现各种分子的分离。
(5)一同学通过血红蛋白醋酸纤维薄膜电泳，观察到正常人和镰刀型细胞贫血症患者的血红蛋白电泳结果如上图所示。由图可知携带者有________种血红蛋白，从分子遗传学的角度作出的解释是________________________________。
解析 试题分析：(1)样品处理中红细胞的洗涤要用生理盐水反复冲洗、离心。向红细胞悬液中加入一定量的低浓度pH＝7.0的缓冲液并充分搅拌，可以破碎红细胞，破碎细胞的原理是渗透原理(当外界溶液浓度低于动物细胞内液浓度时，细胞吸水涨破)。
(2)血红蛋白粗分离阶段，透析的目的是除去小分子杂质。
(3)电泳利用了待分离样品中各种分子的带电性质以及分子大小、形状等的差异，而产生不同的迁移速度，实现各种分子的分离。
(4)由如图2可知携带者有2种血红蛋白，因为携带者具有(控制血红蛋白的)一对等位基因，可以控制合成两种不同的蛋白质。
答案 (1)生理盐水 渗透(作用)原理(当外界溶液浓度低于动物细胞内液浓度时，细胞吸水涨破)
(2)除去小分子杂质 增加缓冲液的量或及时更换缓冲液
(3)凝胶色谱法 (4)带电性质以及分子大小、形状
(5)2 携带者具有一对等位基因，可以控制合成两种不同的蛋白质
课件50张PPT。课题3 血红蛋白的提取与分离1．分离原理：
根据蛋白质各种特性的差异分离不同种类的蛋白质，如分子的___________，所带电荷的____________、_______、_________和_____________________等。一、蛋白质的分离原理及方法 ［基础梳理］形状和大小性质和多少溶解度吸附性质对其他分子的亲和力分配色谱法 相对分子质量的大小 多孔球体 多糖类化合物 贯穿的通道 (3)分离原理凝胶外部较短较快凝胶内部较长较慢3.缓冲溶液：
(1)组成：通常由1～2种_________溶解于水中配制而成。
(2)作用：抵制外界的酸和碱对________的影响而保持其________。缓冲剂溶液pH稳定4．电泳：
(1)概念：指__________在电场的作用下发生______的过程。
(2)原理：电泳利用了待分离样品中各种分子_______________以及分子本身的____________的不同，使带电分子产生_______________，从而实现样品中各种分子的分离。
(3)两种常用方法：_______________和聚丙烯酰胺凝胶电泳。带电粒子迁移带电性质的差异大小、形状不同的迁移速度琼脂糖凝胶电泳1．血红蛋白的提取与分离实验流程：
样品处理：红细胞的洗涤―→__________的释放―→分离血红蛋白溶液
↓二、血红蛋白的提取与分离实验操作血红蛋白粗分离：用________法除去血红蛋白溶液中相对分子质量________的杂质
↓
纯化：用__________法分离相对分子质量不同的蛋白质
↓
纯度鉴定：一般用_______________________方法来测定蛋白质的纯度透析较小凝胶色谱SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳2．凝胶色谱操作：
(1)凝胶色谱柱的制作。
准备材料―→加工_________―→安装_________。
(2)凝胶色谱柱的装填。
①材料：本实验使用的是__________________。
②方法：凝胶用________充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，一次性缓慢倒入色谱柱内。橡皮塞玻璃管交联葡聚糖凝胶蒸馏水③注意事项。
a．商品凝胶使用前需直接___________________；
b．装填时可_______________，使凝胶装填均匀；
c．不能有气泡存在，防止其______________________________，降低分离效果；
d．不能发生_________________________的现象。
④检验：如果红色区带__________地移动，说明色谱柱制作成功。放在洗脱液中膨胀轻轻敲动色谱柱搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序洗脱液流干，露出凝胶颗粒均匀一致(3)样品的加入与洗脱。
调整缓冲液面：与_____________
↓
滴加透析样品：用吸管将1 mL透析后的样品加到色谱柱的___________
↓凝胶面平齐顶端样品渗入凝胶床：打开下端出口，使__________________
↓
洗脱：打开下端出口，用_____________洗脱
↓
收集：待_______________接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集样品渗入凝胶床内磷酸缓冲液红色的蛋白质1．凝胶色谱法分离蛋白质时利用了蛋白质相对分子质量大小和形状的不同。
解析 凝胶色谱法只利用了蛋白质相对分子质量大小的不同，形状的不同不影响蛋白质的迁移速度。
答案 ×［即时反馈］2．电泳时带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
解析 带电分子与其所带电荷相反的电极相互吸引导致移动。
答案 √3．猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少。
解析 哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核和众多的细胞器，提纯时杂蛋白较少。
答案 √4．用于透析的薄膜具有选择透过性。
解析 透析袋一般是用硝酸纤维素制成的，是一种半透膜，不具有选择性。
答案 ×5．可通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。
解析 相对分子质量较大的杂蛋白先流出，从而与相对分子质量较小的蛋白质分离。
答案 √6．若红色区带不均匀地移动，说明色谱柱制作成功。
解析 若红色区带不均匀地移动，说明色谱柱制作不合格。
答案 ×1．凝胶色谱法：知识点一 蛋白质的分离原理及方法 ［互动探究］结合上图，说出凝胶色谱法分离不同物质的依据并填表比较蛋白质的运动情况。
(1)依据：___________________。相对分子质量的大小(2)蛋白质在凝胶中的运动情况：垂直向下运动无规则的扩散运动较快较短较长先从凝胶柱中洗脱出来2.电泳：
(1)从电荷方面分析适合电泳法分离的各种分子应具备的条件是：
____________________________________。各种分子应带有不同种类和不同量的电荷(2)SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质是否依据蛋白质所带电荷的差异？为什么？
提示：否。因为SDS能与蛋白质结合，它所带负电荷的量远大于蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全由蛋白质分子的大小决定。1．下列关于物质提取、纯化原理的叙述中，不正确的是［对点训练］A．采用凝胶色谱法分离蛋白质的原理是不同蛋白质分子的相对分子质量不同，在色谱柱中的移动速度不同
B．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
C．不能选用猪、牛、羊或其他哺乳动物的血液进行实验来提取和分离血红蛋白
D．将血红蛋白溶液进行透析，其目的是去除相对分子质量较小的杂质解析 凝胶色谱法分离蛋白质的原理是不同蛋白质分子的相对分子质量不同，在色谱柱中的移动速度不同，A正确；电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程，B正确；由于哺乳动物的成熟红细胞内无细胞核和众多的细胞器，所以常常选用猪、牛、羊等哺乳动物的血液进行实验来提取和分离血红蛋白，C错误；透析的原理是小分子能够通过半透膜，因此，利用透析法可以去除样品中相对分子量较小的杂质，D正确。
答案 C2．以下关于血红蛋白提取和分离的过程及原理叙述正确的是
A．红细胞洗涤过程中要加入5倍体积的蒸馏水，重复洗涤3次
B．将血红蛋白溶液放在质量分数为0.9%的NaCl溶液中透析12小时
C．凝胶装填在色谱柱内要均匀，不能有气泡存在
D．蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较大的移动速度慢解析 低渗溶液中细胞会吸水涨破，所以红细胞的洗涤过程应该用生理盐水洗涤，不能用蒸馏水洗涤，A错误；将血红蛋白溶液通过透析进行粗分离时应该选用磷酸缓冲液，B错误；装填色谱柱时，凝胶填在色谱柱内要均匀，不能有气泡存在，因为气泡会影响蛋白质洗脱的次序，C正确；蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较大的移动速度快，D错误。
答案 C1．实验操作：
(1)哺乳动物成熟的红细胞适用于进行蛋白质的分离的原因有哪些？知识点二 血红蛋白的提取与分离实验
操作 ［互动探究］提示：①哺乳动物成熟红细胞内没有细胞核和各种复杂的细胞器，排除了其他物质对实验结果的干扰。②血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。(2)请分析洗涤红细胞的目的，总结判断红细胞洗涤干净的依据。
①目的：____________。
②依据：_________________________。去除杂蛋白离心后的上清液中没有黄色(3)探究血红蛋白释放过程中蒸馏水和甲苯的作用。
①蒸馏水的作用：
_______________________________________；
②甲苯的作用：
_________________________________。使红细胞吸水破裂，释放细胞内的血红蛋白溶解细胞膜，有助于血红蛋白的释放甲苯层 脂溶性物质的沉淀层 血红蛋白溶液层 杂质沉淀层 (5)将收集的血红蛋白溶液放在透析袋中进行透析，透析的目的是什么？
提示：血红蛋白是大分子物质，不能透过透析袋，这样可以去除相对分子质量较小的杂质。2．凝胶色谱操作：
(1)在制作凝胶色谱柱时，若凝胶色谱柱的高度不足，则___________________。
(2)试从凝胶色谱的分离原理分析凝胶若装填得不够紧密、均匀，则会
__________________________________________________________________________________________________________________。达不到分离效果 在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果(3)气泡对蛋白质分离产生的影响是
___________________________________________。搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果(4)推测样品洗脱时，红色区带可能会出现哪些情况？
提示：①如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；②如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。提取和分离血红蛋白的过程及目的［核心归纳］3．红细胞中含有大量血红蛋白，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验来提取和分离血红蛋白。下列对血红蛋白提取和分离的叙述，错误的是［对点训练］A．血红蛋白提取和分离一般按照“样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定”的顺序进行
B．纯化过程中要用生理盐水充分溶胀凝胶来配制凝胶悬浮液
C．粗分离时透析的目的是去除相对分子质量较小的杂质
D．可经SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定解析 凝胶应用蒸馏水充分溶胀来配制凝胶悬浮液，B错误。
答案 B4．凝胶色谱法可测定蛋白质的相对分子质量，现有A、B两种蛋白质，请运用凝胶色谱法完成下列实验，确定A、B两种蛋白质相对分子质量的大小。
(1)凝胶色谱法的原理是____________________。
(2)材料用具：玻璃管，橡皮塞，打孔器，移液管，尼龙网，螺旋夹，凝胶，缓冲液。(3)实验步骤：
①凝胶色谱柱的制作：注意底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的______________，否则难以铺实_________，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。
②凝胶色谱柱的装填：装填时轻轻敲动色谱柱的原因是：________________________________。
③样品的加入和洗脱：
________________________________________。
(4)预期结果及结论：
________________________________________。解析 (1)凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。(3)制作凝胶色谱柱时，选择橡皮塞打孔，然后将橡皮塞切出锅底状凹穴，然后插入玻璃管，注意不能超出橡皮塞凹穴底面，否则难以铺实尼龙网。装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填均匀。用吸管取混合液沿壁环绕加样后，即可用缓冲液洗脱。 (4)相对分子质量较小的蛋白质进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。
答案 (1)根据相对分子质量的大小分离蛋白质
(3)①凹穴底面 尼龙网 ②使凝胶装填均匀
③将A、B两种蛋白质的混合液加到凝胶色谱柱的上端，用缓冲液进行洗脱，检测它们洗脱的先后顺序(4)若A先于B洗脱出来，则A的相对分子质量大于B；若B先洗脱出来，则B的相对分子质量大于A本讲结束
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