高二生物选修一 专题五 DNA和蛋白质技术（35张ppt人教版）

(共35张PPT)
专题五 DNA和蛋白质技术
课题2:
多聚酶链式反应扩增DNA片段
地震和海啸
DNA指纹法在案件侦破中有重要作用，刑侦人员通过案发现场的血液、头发等样品中提取的DNA，与犯罪嫌疑人的DNA进行比较，就有可能为案件的侦破提供证据。
1.你还能说出DNA鉴定技术在其他方面的应用吗？

2.犯罪嫌疑人留在现场的样品一般都是极少量的，刑侦人员要怎样才能得到足够量的DNA呢？
用PCR技术扩增DNA
遗传病的诊断、古生物学、基因克隆、DNA序列测定
想一想
学习目标
1．体验PCR常规的分子生物学实验方法。
2．理解PCR的原理。
3．讨论PCR的应用。
★分子生物学研究中最强大的实验技术之一
★其本质是在体外模拟细胞内DNA分子复制的过程
美国科学家　穆里斯(K.B.Mullis)
发明了PCR技术　
1993年诺贝尔奖
多聚酶链式反应（PCR）
定义：是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。
意义：有效解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。
应用：广泛应用于医学、个体识别、亲子鉴定、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等各方面。
一、DNA分子的知识回顾
C、H、O、N、P
1、组成元素
脱氧核苷酸
2、基本单位
3、脱氧核苷酸结构
T
C
G
A
A
DNA分子的-OH端为3/ ; 磷酸基团的末端为5/ 。
4、脱氧核苷酸的连接
5、DNA分子的平面结构
5'端
3'端
识别 ：
-OH端为3′端; 磷酸基团的末端为5′端。
6、细胞内DNA复制的基本条件
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成子链的原料
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
DNA聚合酶特性
不能从头合成DNA，只能从DNA的3′端开始延伸DNA链，因此， DNA复制需要引物
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸
引物结合在模板链的3′端
DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链
注意
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物（ RNA）
打开DNA双链
模板
合成子链的原料
催化子链合成
使DNA聚合酶能从引物3′端开始连接脱氧核苷酸
思考：体外扩增DNA时，如何提供与体内DNA复制相似条件？
变性（ 80～100℃ ）
Taq DNA聚合酶
（耐高温）
一小段DNA，长度为20～30个核苷酸
Taq DNA聚合酶是美国微生物学家布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现的，从水生耐热细菌Taq中提取的耐高温的DNA聚合酶，称为Taq DNA聚合酶。
DNA复制前提
一定的缓冲液
体外DNA复制的条件：
四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、两种引物、 模板；缓冲溶液和严格控制温度的温控设备。
二、PCR（多聚酶链式反应）
（一）PCR原理
DNA双链
变性（加热80-100℃ ）
复性（缓慢冷却）
DNA单链
变性的目的：
解开双链
复性的目的：
有利于引物1和引物2与两条单链的结合
PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。
DNA双链的复制
(二)PCR反应的过程
1、变性：
温度上升到90℃以上时,双链DNA解聚成为单链。
2、复性（退火）：
温度下降到50℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。
3、延伸：
温度上升到72℃左右,溶液中的4种脱氧核苷酸在Taq DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对的原则合成新的DNA链。
5?
引物1
5?
引物2
5?
5?
模板DNA
25～30 次循环（复制）后，模板DNA的含量可以扩大100万（220）倍以上。
变性95oC
5?
引物1
5?
引物2
5?
5?
模板DNA
含有母链的DNA分子占：
不含有引物1（或2）的DNA分子占：
2／2n
1／2n
复制n次：
含有母链的DNA分子占：
不含有引物1（或2）的DNA分子占：
2／2n
1／2n
复制n次：
PCR的反应过程总结
每个循环包括：变性 ——复性——延伸
从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的DNA序列呈指数扩增。
循环特点：
①上一次循环的产物为下一循环的模板
②结果单链中只有最初的两条母链无引物存在两个含有最初母链的DNA分子只含一种引物，其它子代DNA分子都为双引物分子
③处于两引物之间的DNA序列呈指数增长1×2N(a×2N)
④第三轮循环开始出现等长的DNA片段（或目的基因）第二轮开始出现与目的基因等长的DNA单链
三、 PCR技术的实验操作
（1）PCR仪
1、设备及用具
（2）微量离心管
一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml
（3）微量移液器
用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次
实质上一台能够自动调控温度的仪器
(4)离心机
一种通过高速转动产生离心现象，能将固体与液体分开的设备。
(1)准备
(2)移液
按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上.
用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂.
(3)混合
盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁
2、 PCR反应的实验操作
将微量离心管放在离心机上,离心约10s
(4)离心
将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序
(5)反应
3、离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果
以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率
注意：
2、手指轻轻弹击微量离心管的管壁的目的：使反应液混合均匀.
1、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢.
循环数 变性 复性 延伸
预变性 94°C,5min － －
30次 ９4℃，30s 55℃，30s 72℃，1min
最后一次 ９4℃，1min 55℃，30s 72℃，1min
PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰，PCR操作时要注意做到：
3、操作提示（注意事项）
①隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌；
③在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。使用一次性枪头
②PCR所用的缓冲液、酶应分装成小份，并在-20℃储存，使用前将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
原因：使缓冲液中稳定性差的成分和酶的活性不被破坏
四、课题成果评价
实验中DNA含量的测定
（可以通过测量DNA含量来评价扩增的效果）
1 、原理
DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关
光吸收
波长／nm
260
240
220
280
0.1
0.2
2 、过程
①稀释
2?L PCR反应液，加入98?L蒸馏水，即将样品进行50倍稀释
②对照调零
以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零
取DNA稀释液100?L至比色杯中，测定260nm处的光吸收值
③测定并计算
DNA含量（?g/mL）＝50×(260nm的读数)×稀释倍数
50：在厚度为1cm比色杯中的吸光值为1, DNA 的含量为50?g /ml
DNA含量（?g/mL）＝50×(260nm的读数)×稀释倍数
体内DNA复制与PCR技术的区别：
体内复制 PCR技术
解旋 在解旋酶作用下，细胞提供ATP，部分解开 加热到94oC,双链全部解开，不需解旋酶
引物 一小段RNA 一般用DNA片段
DNA聚合酶 细胞自身的DNA聚合酶（不耐高温） TaqDNA聚合酶
复制特点 半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。 半保留复制，完全解旋后复制，从模板链的一端开始复制。
复制的方向 子链的5’端向 3’端延伸 子链的5’端向 3’端延伸
1.使用PCR仪的具体实验操作顺序应为( )
①设计好PCR仪的循环程序
②按配方准备好各组分
③用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分
④进行PCR反应
⑤离心使反应液集中在离心管底部
A.②③⑤④① B.①⑤③②④
C.②③⑤①④ D.④②⑤③①
C
准备 ——移液——混合——离心——反应
2、关于PCR技术的应用，错误的一项是
A 古生物学、刑侦破案、DNA序列测定
B 诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学
C DNA序列测定、基因克隆、刑侦破案
D 诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列测定
3、PCR技术最突出的优点是( )
A 原理简单 B 原料易找
C TaqDNA聚合酶有耐热性
D 快速、高效、灵活、易于操作
D
D
4、关于DNA的复制，下列叙述正确的是（ ）
A.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5’端延伸DNA链
B.DNA复制不需要引物
C.引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合
D.DNA的合成方向总是从子链的3’端向5’端延伸
C
5、下列有关PCR描述，不正确的是（ ）
A. 是一种酶促反应
B. 引物决定了扩增的特异性
C. 扩增对象是DNA序列
D. 扩增对象是氨基酸序列
D
课下作业：
整理笔记，完成课题2的分层检测卷P35—36