高二生物选修一 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数（63张ppt人教版）

(共63张PPT)
温故知新
无菌技术
消毒：煮沸消毒法、 巴氏消毒法 、化学药剂消毒法、紫外线消毒法

灭菌：灼烧灭菌、高压蒸汽灭菌、干热灭菌
制备固体培养基的步骤
定容
称量
溶化
分装
调pH
包扎
灭菌
倒平板
称量
计算
二、纯化大肠杆菌
最常用的接种方法----1、平板划线法
2、稀释涂布平板法
还包括斜面接种、穿刺接种等方法。

其核心都是要防止杂菌污染，保证培养物纯度。
（一）、平板划线法：
101
102
103
104
105
106
1、梯度稀释菌液：
（二）、稀释涂布平板法：
2、涂布平板：
1、梯度稀释菌液：
（二）、稀释涂布平板法：
浸
滴
灼
涂
平板划线法和稀释涂布平板法的比较
接种方法 优点 缺点
平板划线
法 可以观察菌落特征，对混合菌进行分离 不能计数
稀释涂布
平板法 可以计数，可以观察菌落特征 吸收量较少、较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延
土壤
土壤--“微生物的天然培养基”
土壤中微生物：数量最大、种类最多
大约70%—90%是细菌
一、课题背景
1、尿素的利用
2、细菌利用尿素的原因
芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌，及某些真菌和放线菌也能分解尿素。(了解)
NH3不能直接吸收，植物吸收其中的N是以NH4+和NO3-形式吸收的。NH3的水溶性高，在水中形成NH4+；土壤里的硝化细菌把NH3氧化为NO3-，然后以NO3-的形式被植物吸收。(记)
课题2 土壤分解尿素的细菌的分离与计数
一、研究思路
(一)筛选菌种
1、 实例：
PCR技术：要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。
耐高温的酶
耐高温生物体
耐高温环境（热泉、火山口）
寻找
寻找
Taq细菌
【筛选原因】 因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，
使耐热的Taq细菌保留下来。
美国黄石国家公园：热泉
（一）筛选菌株
【启示】寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
2 实验室中微生物的筛选原理
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
（3）土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基（P22）
碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素
只有能产生脲酶的细菌才能以尿素作为氮源而生存。
缺乏脲酶的微生物不能分解尿素，因缺乏氮源而不能生长繁殖从而受到抑制。
【 选择培养基】
在微生物学中，将允许______________________，同时_________________________生长的培养基。
特定种类的微生物生长
抑制或阻止其他种类微生物
结果：培养一定时间后，能分解尿素的细菌数量上升，再通过稀释涂布平板等方法对它进行纯化培养分离。
？怎样证明此培养基具有选择性呢？
以尿素为
唯一氮源
的培养基
牛肉膏
蛋白胨
培养基
?是
分离
尿素
细菌
判断该
培养基
有无选
择性
只生长尿素细菌
生长多种微生物
是
③改变微生物的培养条件。
例如，将培养基放在高温环境中培养-可以得到耐高温的微生物；
用普通培养基在无氧条件下--分离厌氧型和兼性厌氧型微生物。
〖归纳总结〗选择培养基的选择作用
(1)原理：根据不同微生物的特殊营养要求或其对某物理/化学因素的抗性不同而制备培养基。
(2)方法：
①在培养基中加入某种化学物质。
例如，加入青霉素---可以分离出酵母菌和霉菌，细菌不生长；
加入高浓度的食盐---可以得到金黄色葡萄球菌。
②改变培养基中的营养成分。
例如，缺乏氮源时--可以分离固氮微生物；
用含无机碳源的培养基分离自养型微生物。
例1．分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是(　　)
①加尿素　②不加尿素　③加琼脂　④不加琼脂　⑤加葡萄糖　⑥不加葡萄糖　⑦加硝酸盐　⑧不加硝酸盐

A．①③⑤⑦　 B．②④⑥⑧

C．①③⑤⑧ D．①④⑥⑦
?C
(二）如何对细菌进行计数
1、 显微镜直接计数法：
利用血球计数板(血细胞计数板），在显微镜下，计算一定容积里样品中微生物的数量。
缺点
?不能区分死菌与活菌 （总菌计数）
?个体小的细菌在显微镜下难以观察
将一定体积的饮用水，用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红-美蓝培养基（EMB培养基）上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过计算得出水样中大肠杆菌的数量。
鉴别培养基
2、滤膜法---活菌计数 P26
测定饮水中大肠杆菌数量
稀释涂布平板法
1、显微镜直接计数--不能区分死菌与活菌 2、滤膜法---活菌计数
3、间接计数法（活菌统计）---
（二）统计菌落数目
原理：（ 1个菌落←1个活菌）
稀释涂布平板法
3、成功的关键：恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。
为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在30～300的平板进行计数。
2、间接计数法（活菌统计）--
当样品的稀释度足够高时，固体培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中的活菌数。
设置重复组
--避免实验过程中偶然因素对实验结果的干扰。
1、第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。 2、第二位同学考虑到设置重复组的问题：涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果（21）与另2个结果（212,256）相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。
设置重复组---
【总结】（1）在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。（2）在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致。
?若结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。
?若三个结果比较接近，取三个平板的结果求平均值作为统计结果；
（2）然后按公式计算
每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)
M代表稀释倍数
2.如何从平板上的菌落数，推测出每克样品中的菌株数？
(1）统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计三个平板，计算出平板上菌落数的平均值，
【例1】某同学在稀释倍数为106的培养基上测得三个平板上的菌落数的为233,234,235，那么每克样品中菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL）（ ）
A.2.34×108　　B.2.34×109 C.234　　D.23.4
【解析】稀释倍数为106，0.1 mL稀释液的菌落数的平均值为234，则每克样品中菌落数就为234/0.1×106=2.34×109。
B
原因：当两个或多个细菌连在一起时，培养后平板上观察到的只是一个菌落。--【统计的菌落数往往比活菌的实际数目低】
因此统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示
1、几个菌落粘连一起，只要肉眼能区分，就算几个；
2、不管菌落大小，只要肉眼看得见，就应该计数；
注意事项
①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。
②为使结果接近真实值，可将同一稀释度的菌液涂布到至少涂布三个平板，经培养计算出三个平板上的菌落平均值作为统计值。
③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。
实例分析2
A同学和其他同学所得实验结果差异 如此之大，
请分析原因可能有哪些？
A同学和其他同学所得实验结果差异 如此之大，
请分析原因可能有哪些？
①
?
②
【可能原因】
（1）培养基污染
（2）培养基混入了
其他的含氮物质
（3）土样不同
方案三：由其他同学用与A同学相同土样进行实验
方案一：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。
方案二：配制牛肉膏蛋白胨培养基并接种A同学所用的土样，作为对照，以证明培养基是否混入了其他氮源（有选择作用）
【可能原因】（1）培养基污染
（2）培养基混入了其他的含氮物质 （3）土样不同
这个实例可以看出，
实验结果要有说服力，对照组的设置是必不可少
（三）设置对照
指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验。
1、对照实验（P23）：
自变量：
无关变量：
被测试的条件,人为加以改变。
2、设置对照的目的（意义）：
其他条件，相同且适宜。
排除非测试因素(无关变量) 对实验结果的影响，
证明确实是测试条件（自变量）引起相应的结果，提高实验结果的可信度。
实验流程：
样品稀释、涂布平板
微生物的培养与观察
菌落计数
三、实验设计
土壤取样
制备培养基
土壤中分解尿素的细菌的分离与记数
（一）土壤取样
细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，
绝大多数分布在距地表约3-8cm的土壤表层
（1）从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。（2）先铲去表层土3cm左右，再从距地表3-8cm的土壤层取样，将样品装入事先准备好的信封中。
◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封：
在使用前都要灭菌。
（二）制备培养基
相同的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，
思考？为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？
筛选出能够分解尿素的细菌
制备选择培养基（尿素为唯一氮源）
检测选择培养基是否具有选择作用
+制备牛肉膏蛋白胨培养基
(对照组）
【注意】 每个稀释度下：
需要3个选择培养基（平行重复原则），
1个牛肉膏蛋白胨培养基（对照原则）
◆应在火焰旁称取土壤10g。

◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行
（三）样品的稀释
样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。
◆分离不同的微生物,采用不同的稀释度
分离土壤中细菌， 选用104、105、106倍的稀释度
分离土壤中放线菌，选用103、104、105倍的稀释度
分离土壤中真菌， 选用102、103、104倍的稀释度
㈣.取样涂布
◆第一次实验可将稀释度放宽一点，选择103---107倍的稀释液
◆为什么分离不同的微生物采用不同的稀释度
在干旱土壤中的上层样本中（单位：株/kg）：
好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，
放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。
对于每个稀释度，还应增设一组空白对照组（牛肉膏蛋白胨培养基+土壤稀释液）
㈣.取样涂布
①由于选择的稀释倍数为103-107，每个稀释度下均需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基，因此共需要15个选择培养基，5个牛肉膏蛋白胨培养基。此外还需要准备灭菌的试管和灭菌的移液管
涂布分离
低浓度→高浓度，可不用换枪头
（按照由107～103稀释度的顺序涂布平板，不必更换移液管）。
移液的浓度由高到低时，移液管里残留的少量低浓度液对高浓度液影响极小
涂布器
移液管

细菌：30～37℃培养1～2d
放线菌：25～28℃培养5～7d
霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。
按稀释倍数捆成一摞
恒温37℃培养
4、微生物的培养与观察
培养不同微生物往往需要不同培养温度。
（五）微生物的培养与观察
在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
将涂布好的培养皿放在37℃恒温箱中培养。
比较牛肉膏培养基和选择培养基中;菌落的数量、形态等，并做好记录。　
当菌落数目稳定时，选取菌落数在30~300的平板进行计数。
在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。　
5.细菌的计数
【公式】每克样品中的菌株数=（C÷V）×M
◆如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。
◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，
【知识拓展】细菌菌落的观察
一般来说，在一定的培养条件下（相同的培养基、温度及培养时间），同种微生物表现出稳定的菌落特征（大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面）
不同形态的菌落
不同种类的细菌形成的菌落，在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等菌落特征方面具有一定的区别-
---菌落特征可作为菌种鉴定的重要依据。
[一]无菌操作
1、取土用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都需要灭菌。
2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。
3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。
[二]做好标记
注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。
[三]制定计划
三、操作提示
四.结果分析与评价
培养基未被杂菌污染
被杂菌污染
被杂菌污染或混入其他氮源
牛肉膏培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目
得到三个或三个以上菌落数目在30～300的平板
接近
内容 现象 结论
培养物是否有杂菌污染的判断 对照的培养皿中无菌落生长
对照组中有菌落生长
菌落形态多样，菌落数偏高
选择培养基
是否筛选出菌落 选择培养基具有筛选作用
样品的稀释
操作 操作成功
重复组的结果 若选取同一种土样，统计结果应
五、课题延伸
本课题只是对能分解尿素的细菌进行了初步的筛选，只是分离纯化菌种的第一步。对分离的菌种作进一步的鉴定，要借助生物化学的方法。
CO(NH2)2 + H2O CO2 + 2NH3
脲酶
原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→ 酚红变红
【课堂小结】
一、分离--选择培养基的：
分解尿素细菌的分离与计数
尿素作为唯一的氮源。
二、鉴定方法：
在培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，pH升高，说明细菌能分解尿素。
三、统计菌落数目的方法
（1）显微镜直接计数法
（2）间接计数法（稀释涂布平板计数法）
①计算公式
每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M
②操作：设置重复组，选择菌落数30～300的平板进行计数。
四、设置对照
①证明培养基未被污染---用空白培养基作对照（选择培养基+不接种土壤样品）。
②证明选择培养基的选择作用--对照组（牛肉膏蛋白胨培养基+接种等量同种菌液）
1.使用选择培养基的目的是（ 　）
A.培养细菌　　 B.培养真菌　　
C.使需要的微生物大量繁殖
D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别
【实践训练】
C
2、用来判断选择培养基是否起到了
选择作用需要设置的对照是(　　 )
A.未接种的选择培养基
B.未接种的牛肉膏蛋白胨培养基
C.接种了的选择培养基
D.接种了的牛肉膏蛋白胨培养基
D
4.下列说法不正确的是（ 　）
A.取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1ml，分别涂布于各组平板上
B.将实验组和对照组平板倒置，37℃恒温培养24-48小时
C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度
D.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值
D
3.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中
加入（　　）
A.较多的氮源物质 B.较多的碳源物质
C.青霉素类药物 D.高浓度食盐
C
5、牛等牲畜的瘤胃中生活着许多以尿素作唯一氮源的微生物。某同学从刚宰杀的牛的瘤胃中取样获得菌液，并对能分解尿素的细菌进行分离、计数和鉴定。回答下列问题：
（1）从“菌液”中分离出能分解尿素的菌：
培养基中的唯一氮源应是_______，这样的培养基通常叫做_______培养基。为了能在培养基上形成菌落，培养基中应加入_______________，可用__________________________方法进行接种。
（2）对“菌液”中能分解尿素的菌进行计数：
应用_____________培养基进行培养，应用________________方法进行接种。
尿素
选择
凝固剂（琼脂）
平板划线法(稀释涂布平板法)
固体、选择
稀释涂布平板法
（3）将稀释度104的O.l mL菌液接种在3个平板，在无氧条件培养一段时间后，3个平板的菌落数分别为45、56、37，则每升菌液的活菌数约为_________个，得到的菌落数与实际活菌数相比，结果往往偏____。稀释度104的O.l mL菌液接种3个平板的意义是____________________________。
(4）为了鉴定该菌种，在以尿素为唯一氮源的培养基需添加______作指示剂，目的菌在生长过程中产生_____酶能催化尿素分解并产生______，使pH升高，指示剂变红。
4.6×109
低
避免偶然因素对实验结果的干扰
酚红
脲
氨
1、对照课件，整理笔记
2、做《同步练习册》P19-22页
3、做《分层检测》P13-14页
认真而努力地学习，就是作为一名学生的责任与担当。
课后作业
检测培养基平板灭菌是否合格
3.8×107
将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间
污染
不正确
(2017全国1卷) 某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题：
（1）有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生＿＿＿＿。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿，但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿（打出两点即可）。
（2）为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择＿＿＿＿（填“尿素”“NH4NO3”或“尿素+NH4NO3”）作为氮源，不选择其他两组的原因是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。
（3）用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2 HPO4，其作用有＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿（答出两点即可）。
脲酶
分解尿素的细菌是异养型生物，不能利用CO2来合成有机物
为细胞生物生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料
尿素
其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用
为细菌生长提供无机营养，作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定
(2018全国1卷)将马铃薯去皮切块，加水煮沸一定时间，过滤得到马铃薯浸出液。在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂，用水定容后灭菌，得到M培养基。回答下列问题：
（3）若在M培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养，平板上长出菌落后可通过加入显色剂选出能产淀粉酶的微生物。加入的显色剂是＿＿＿＿，该方法能筛选出产淀粉酶微生物的原理是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。
（4）甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同一稀释倍数下得到以下结果：甲同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是110、140和149，取平均值133；乙同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是27、169和176，取平均值124。有人认为这两位同学的结果中，乙同学的结果可信度低，其原因是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。
碘液
淀粉遇碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈
乙同学的结果中，1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差
(2019全国1卷)已知一种有机物X（仅含有C、H两种元素）不易降解，会造成环境污染。某小组用三种培养基筛选土壤中能高效降解X的细菌（目标菌）。
Ⅰ号培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入X（5g/L）。Ⅱ号培养基：氯化钠（5g/L），硝酸铵（3g/L），其他无机盐（适量），X（15g/L）。Ⅲ号培养基：氯化钠（5g/L），硝酸铵（3g/L），其他无机盐（适量），X（45g/L）。回答下列问题。
（2）若将土壤悬浮液接种在Ⅱ号液体培养基中，培养一段时间后，不能降解 X 的细菌比例会＿＿＿，其原因是 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。
（3） Ⅱ号培养基加入琼脂后可以制成固体培养基，若要以该固体培养基培养目标菌并对菌落进行计数，接种时，应采用的方法是＿＿＿＿＿＿＿＿。
下降
不能降解X的细菌因缺乏碳源不能增殖，而能降解X的细菌能够增殖
稀释涂布平板法