课题3 酵母细胞的固定化课件（25张PPT）

(共25张PPT)
课题3学习目标
1．简述固定化酶的概念
2．说出酶固定化的方法
3．尝试用包埋法制备固定化酵母细胞
4．探讨固定化酶的应用价值
阅读教材P49课题背景部分，回答酶制剂存在哪些缺陷？
1.酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易失活；
2.溶液中的酶很难回收，提高了生产成本；
3.反应后会混在产物中，可能影响产品质量。
人们解决这些缺陷的设想和措施是什么？
固定化酶技术和固定化细胞技术
一、基础知识
（一）固定化酶的应用实例
1.利用固定化酶技术生产高果糖浆的实例
（1）高果糖浆的生产需要酶
葡萄糖异构酶
（2）葡萄糖异构酶的优点
稳定性好、可以持续发挥作用
（3）在生产中直接使用酶有什么缺点？
酶溶解于葡萄糖溶液后，无法回收，造成浪费
含淀粉的浆液
α-淀粉酶
糊精
糖化酶
葡萄糖
葡萄糖异构酶
葡萄糖的异构化
42%～45%
转化成果糖
果葡糖浆
果糖和葡萄糖分离
葡萄糖再次异构化
反复多次
果糖含量70%～90%
高果糖浆
固定化酶技术生产高果糖浆生产流程
2.固定化酶的反应柱示意图
使用固定化酶技术，将葡萄糖异构酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这种酶颗粒装在一个反应柱内，柱子底端装有分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应溶液却可以自由出入。
3.固定化酶在生产实践中的优点：
反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。
酶既能与反应物接触，又容易与产物分离，提高产品质量；同时固定在载体上的酶还可以反复利用，节约成本。
（1）概念：固定化酶和固定化细胞是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。
（二）固定化细胞技术
（2）常用方法：包括包埋法、化学结合法和物理吸附法。
酶适合采用化学结合法和物理吸附法固定化，而细胞多采用包埋法固定化。这是因为细胞个大，而酶分子很小；个大的细胞难以被吸附或结合，而个小的酶容易从包埋材料中漏出 。
（3）酶的几种固定方式
(1)包埋法
(2)化学结合法
(3)物理吸附法
方法 原理 适用对象

包埋法
是将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进剂(包括交联剂)的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化
酶或细胞
化学
结合法 酶蛋白的侧链基团和载体表面上的功能基团之间形成共价键而固定的方法
酶

物理
吸附法
通过氢键、疏水作用和π电子亲和力等物理作用，将酶固定于水不溶载体上．从而制成固定化酶
酶
【P50课堂讨论】
1．从操作角度来考虑，你认为固定化酶技术与固定化细胞技术哪一种方法更容易？哪一种方法对酶活性的影响更小？

2．固定化细胞固定的是一种酶还是一系列酶？

3．如果想将微生物的发酵过程变成连续的酶反应，应该选择哪种方法？

4．如果反应物是大分子物质，又应该选择哪种方法？
固定化细胞技术
固定化细胞固定的是一系列酶
固定化细胞技术
固定化酶技术
固定化细胞技术
1.酵母细胞的活化：
1g干酵母＋10mL蒸馏水→50mL烧杯→搅拌均匀→放置1h，使之活化。
活化是指让处于休眠状态的微生物重新恢复正常生活状态的过程。
一般是将干酵母放在蒸馏水中进行活化。
二、实验操作
（一）制备固定化酵母细胞
2.配制CaCl2溶液：
0.83gCaCl2＋150mL蒸馏水→200mL烧杯→溶解备用。
3.配制海藻酸钠溶液：
0.7g海藻酸＋10mL水→50mL烧杯→酒精灯小火或间断加热，并不断搅拌，使之溶化→蒸馏水定容到10mL。
防止海藻酸钠焦糊。
思考：
(1)小火或间断加热并不断搅拌的目的是什么？
(2)海藻酸钠的浓度对凝胶珠的形成可能有哪些影响？
如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；
如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目太少，影响实验效果。
4.海藻酸钠溶液与酵母细胞的混合：
将溶化的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入活化酵母细胞液，搅拌后吸入到注射器中。
思考：
为什么要海藻酸钠溶液冷却后才能加入酵母细胞？
防止高温杀死酵母细胞。
5.固定化酵母细胞：
以恒定速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到CaCl2溶液中，形成凝胶珠状颗粒。
思考：
CaCl2溶液有什么作用？

为什么要让凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30min左右？
CaCl2溶液使胶体聚沉
让凝胶珠形成稳定的结构
（二）固定化酵母细胞的发酵
1.冲洗：将固定的酵母细胞凝胶珠用蒸馏水冲洗2～3次。
2.发酵：150mL10％葡萄糖＋固定化酵母细胞→200mL锥形瓶→密封→25℃发酵24h。
为何将固定好的凝胶珠要用蒸馏水冲洗2~3次？

发酵过程中锥形瓶为什么要密封？

锥形瓶中的气泡和酒精是怎样形成的？

在利用固定化酶或固定化细胞进行生产的过程中，需要无菌操作吗？

利用固定的酵母细胞发酵24h后，会有什么实验现象？

采用哪种化学试剂检测有无酒精的生成？有无CO2的生成？

酵母菌的酒精发酵需要缺氧条件。
酵母菌进行无氧呼吸产生的。
需要。
洗去CaCl2和杂菌
有气泡，有酒味
橙色的酸性重铬酸钾，
灰绿色
澄清石灰水
思考：
海藻酸钠在水中溶解的速度较慢，需要通过加热促进其溶解。溶解海藻酸钠，最好采用小火间断加热的方法。例如，加热几分钟后，从石棉网上取下烧杯冷却片刻，并不断搅拌，再将烧杯放回石棉网继续加热，如此重复数次，直至海藻酸钠完全溶化。如果加热太快，海藻酸钠会发生焦糊。
三、操作提示 详教材见P51
1.观察凝胶珠的颜色和形状
如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海
藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；
如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明
海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。
*
浅黄色
四、结果分析与评价
(1)评价制备的凝胶珠是否合格
(2)挤压法
用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。
(3)摔打法
在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。
你认为影响实验成败的关键步骤是哪一步？
配制海藻酸钠溶液
2.观察利用经酵母细胞发酵的葡萄糖溶液，看看是否有气泡产生，闻闻是否有酒味。
类型
优点
不足
直接
使用
酶
催化效率高，低耗能、低污染等
对环境条件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本；反应后酶会混在产物中，可能影响产品质量

固定
化酶
酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用
一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形成都通过一系列的酶促反应才能得到的
固定
化细
胞
成本低、操作容易、对酶活性的影响更小、可以催化一系列的反应、容易回收
固定后的酶或细胞与反应物不容易接近，可能导致反应效果下降由于大分子物质难以自由通过细胞膜，因此固定化细胞的应用也受到限制
酶制剂、固定化酶和固定化细胞催化的对比
*
1.结合专题2的无菌操作技术，想一想如果要求制作反复使用的固定化酵母细胞，应该在实验过程中注意那些问题？
2.试一试：请你结合专题1中的课题1，尝试利用固定化细胞发酵制作果酒和果醋，并观察能否连续生产。
*
五、课题延伸
⑴海藻酸钠溶液、CaCl2溶液和各种操作器具都要灭菌；⑵实验过程进行无菌操作。
1,下列有关固定化技术的叙述，正确的是（ ）
A．固定化酶只是在细胞内才能发挥作用
B．固定化酶能提高酶的利用率
C．酶的固定是酶分离纯化的常用方法
D．固定化酶的固定化方式就是吸附在固体表面上。
B
2.关于固定化细胞的叙述，正确的是（ ）
A．催化效率高，低耗能、低污染
B．对环境的条件非常敏感，容易失活
C．既能与反应物充分接触，又能与产物分离
D．成本低、操作简单，但反应效果可能很低
C
习题训练
3.关于酵母菌的叙述，正确的是（ )
A．酵母菌在营养物质充足时、环境适宜时， 依靠有性生殖进行繁殖
B．酵母菌的代谢类型时异养厌氧型
C．酵母菌的生物膜系统包括细胞膜、核膜、各种的细胞器膜等膜
D．用酵母菌酿酒时，应先密封后通气
C
4.某一实验小组的同学，欲通过制备固定化酵母细胞进行葡萄糖溶液发酵实验，实验材料及用具齐全。
(1)酵母细胞的固定采用的方法是________。
(2)请完善该实验小组的同学在制备固定化酵母细胞过程的步骤：
①配制氯化钙溶液时应用蒸馏水。
②海藻酸钠溶液应用______________加热。
③海藻酸钠溶液必须____________________才能加入酵母细胞。
④注射器中的海藻酸钠和酵母细胞的混合物应滴入________ 中形成____________。
包埋法
小火或间断
冷却至室温
氯化钙溶液
凝胶珠
(3)该实验小组用如图所示的装置来进行葡萄糖发酵。
①为使该实验中所用到的固定化酵母细胞可以反复运用，实验过程中，一定要在________条件下进行。
②加入反应液后的操作是关闭_______________。
③装置的长导管起到什么作用？_____________________________。

④实验过程中，可能会出现的现象：_______________________


无菌
活塞1和活塞2
释放CO2 ，减小反应柱内压力并可防止其他微生物污染
有气泡产生、有酒味散发