人教版选修一课件：5．2多聚酶链式反应（PCR）扩增DNA片段（共28张PPT）

(共28张PPT)
多聚酶链式反应扩增DNA片段
人教版高二选修1 生物
DNA指纹法在案件侦破中有重要作用，刑侦人员通过案发现场的血液、头发等样品中提取的DNA，与犯罪嫌疑人的DNA进行比较，就有可能为案件的侦破提供证据。
犯罪嫌疑人留在现场的样品一般都是极少量的，刑侦人员要怎样才能得到足够量的DNA呢？


一种体外迅速扩增DNA片段的技术，其本质是在体外模拟细胞内DNA分子复制的过程。


多聚酶链式反应（PCR）
美国　穆里斯（K.B.Mullis）
1993年获诺贝尔化学奖
广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA测序等方面。


一个核苷酸上的磷酸基团上的“－OH”和另一个核苷酸分子的第3位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成磷酸二酯键。
脱氧核苷酸
脱氧核苷酸链的形成
磷酸
脱氧核糖
含氮碱基
1
2
3
4
5
5'端
3'端
5'端
3'端
DNA的羟基“－OH”末端称为3'端
DNA的磷酸基团的末端称为5'端




细
胞
内DNA的
复
制
能量
解旋
两条螺旋的双链
DNA聚合酶
碱基互补配对
双螺旋结构
母链
脱氧核苷酸
在DNA复制中的作用 参与的组分
打开DNA双链
提供复制的模板
合成子链的原料
催化合成DNA子链
DNA复制需要的基本条件
小资料
DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上。


解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。
引物Ⅰ
引物 Ⅱ
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
DNA聚合酶只能从引物的3′ 端开始连接脱氧核苷酸。
DNA的合成方向总是从子链的5 ′端向3 ′端延伸。
复制方向


在DNA复制中的作用 参与的组分
打开DNA双链 解旋酶
提供复制的模板 DNA母链
合成子链的原料 4种脱氧核苷酸
催化合成DNA子链 DNA聚合酶
使DNA聚合酶能从引物的
3′端开始连接脱氧核苷酸 引物


思考：体外扩增DNA 如何提供类似环境？
两种引物（长度通常为20-30个核苷酸）
DNA模板
4种脱氧核苷酸
在80-1000C的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程就称为变性。

当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链，这称为复性。
PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。


PCR扩增仪


在DNA复制中的作用 参与的组分
打开DNA双链 解旋酶
提供复制的模板 DNA母链
合成子链的原料 4种脱氧核苷酸
催化合成DNA子链 DNA聚合酶
使DNA聚合酶能从引物的
3′端开始连接脱氧核苷酸 引物


思考：体外扩增DNA 如何提供相似环境？
两种引物（长度通常为20-30个核苷酸）
DNA模板
4种脱氧核苷酸
变性（ 80-100℃ ）


美国黄石国家公园中的热泉
耐高温的Taq DNA聚合酶
在DNA复制中的作用 参与的组分
打开DNA双链 解旋酶
提供复制的模板 DNA母链
合成子链的原料 4种脱氧核苷酸
催化合成DNA子链 DNA聚合酶
使DNA聚合酶能从引物的
3′端开始连接脱氧核苷酸 引物


思考：体外扩增DNA 如何提供相似环境？
两种引物（长度通常为20-30个核苷酸）
DNA模板
4种脱氧核苷酸
变性（ 80-100℃ ）
Taq聚合酶（耐高温）
一、PCR原理
PCR反应需要在一定的 中才能进行，并需要提供： 、
、 、
，同时通过
使DNA复制在体外反复进行。
缓冲溶液
DNA模板
两种引物
四种脱氧核苷酸
耐热的DNA聚合酶
控制温度


在循环之前常要进行一次预变性（目的是增加模板DNA彻底变性的概率）。
重复30轮
二、PCR的反应过程


变性（30s）
复性（30s）
延伸（1min）
1．变性：当温度上升到 0C以上时，双链DNA解聚为单链。
90


二、PCR的反应过程
2．复性（退火）：温度下降到 0C左右，两种引物通过 与两条单链DNA结合。
50
碱基互补配对
引物Ⅰ
引物Ⅱ
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’


二、PCR的反应过程
3．延伸：温度上升到 0C左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在 的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
72
DNA聚合酶


二、PCR的反应过程


从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸。


二、PCR的反应过程
DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。


二、PCR的反应过程
1、PCR仪
（一）设备及用具
2、微量离心管
一种薄壁塑料管，总容积为0.5mL
3、微量移液器
用于定量转移PCR配方中的液体
实质上是能够自动调控温度的仪器
三、PCR的实验操作


不同规格的移液器配套使用不同大小的枪头。
每吸取一种试剂后，移液器上的一次性枪头都必须更换。
4、离心机
一种利用离心力，分离液体与固体颗粒或液体与液体的混合物中各组分的机械。


1、将所需仪器和试剂摆放在实验桌上（准备）
2、用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（移液）
3、盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合）
4、将微量离心管放在离心机上离心约10s（离心）
5、将离心管放入PCR仪中，设置好PCR仪的循环程序（反应）
（二）操作步骤


三、PCR的实验操作
（三）结果分析与评价
可以通过测量DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关。


三、PCR的实验操作
DNA的紫外吸收光谱
紫外分光光度计
比色杯

多聚酶链式反应扩增DNA片段
PCR原理
DNA的复制需要模板、引物、原料、Taq酶
DNA的变性和复性受温度影响


PCR过程
90℃变性
50℃复性
72℃延伸




实验操作
配制PCR反应体系
混合、离心
放入PCR仪
设置循环程序
DNA扩增








课 堂 小 结