人教生物选修1专题2课题3分解纤维素的微生物的分离(共50张PPT)

(共50张PPT)
知识回顾——土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
一、菌株的筛选与选择培养基
1、原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件，
同时抑制或阻止其他微生物的生长。
2、方法：利用选择培养基分离；
设置特殊的理化培养条件。
3、选择培养基：以尿素为唯一氮源的培养基
（只有能产生脲酶的微生物才能在
该培养基上生长）
怎样证明此培养基具有选择性呢？
1、显微镜直接计数--不能区分死菌与活菌，又称总菌计数法
2、滤膜法---活菌计数
3、稀释涂布平板法（活菌计数法）
成功的关键：恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。
为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在30～300的平板进行计数。（重复实验）对照实验
设置两组对照：
未接种的培养基（判断
培养基是否合格）
牛肉膏蛋白胨的培养基（判断培养基是否具有选择作用）
二、测定微生物数量的方法
（2）然后按公式计算
每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)
M代表稀释倍数
1.为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。
2.重复组的设置及作用：为使结果接近真实值，可将同一稀释度的菌液
涂布到至少三个平板，经培养计算出三个平板上的菌落平均值作为统
计值。
3.统计的菌落往往比活菌的实际数目低。
菌落计数
样品的稀释与涂布平板
制备培养基
土壤取样
微生物的培养与观察
无菌操作（取土壤的器具和盛土壤的信封要灭菌，土壤的称取和稀释都要在火焰旁）
分离不同的微生物采用不同的稀释度（不同微生物在土壤中含量不同）





分解尿素的细菌的进一步鉴定

原理：细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的
碱性增强，pH升高。
方法：以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。
分离土壤中细菌， 选用104、105、106倍的稀释度
分离土壤中放线菌，选用103、104、105倍的稀释度
分离土壤中真菌， 选用102、103、104倍的稀释度
三、实验操作步骤
纤维素生物燃料：最有希望替代石油能源
第二代生物燃料主要以纤维素质材料为原料，如富含纤维素、生长迅速的草本植物。
可转化为草油的原料有很多，从木材废料（锯木屑 、木质建筑残片）到农业废弃物 （玉米秸秆、小麦茎秆），再到“能源作物”。
这些原料作物耕作成本低（与每桶石油有等价能效的草油为10到40美元）、量大，具备与60美元/桶的原油竞价的能力。
更关键的是，这些作物的种植生产不会干扰和危及粮食生产。
分解纤维素的微生物的分离
课前准备：
课本（选修一） 双色笔
高二生物
纤维素：
棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物；
纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过70亿吨；分布植物的根、茎、叶中；

能分解纤维素的微生物，有各种细菌、真菌和少数放线菌。
由葡萄糖相连而成的高分子化合物
由C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶组成的复合酶
植物的根、茎、叶等器官，木材、作物秸秆等
某些微生物
与果胶构成植物的细胞壁，用于纺织业、造纸业，食品中的膳食纤维具有通便清扫的作用
一.纤维素和纤维素酶
纤维素 纤维素酶
组成
分布
作用

草食性动物是怎样消化食物中纤维素的？
除自然环境中存在的分解纤维素的微生物外，在草食性动物等的消化道内，也共生有分解纤维素的微生物，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素的能力。
一.纤维素和纤维素酶
下列生物能分解纤维素的是（ ）
①人 ②兔 ③牛 ④蘑菇 ⑤纤维杆菌
A.①②③④⑤ B.②③⑤
C.②③④⑤ D.③⑤
C
本实验的自变量：

自变量的操纵方法：
对照原则
单一变量原则
等量原则
纤维素酶的有无
在一支试管中添加适量（1mL）的纤维素酶溶液，在另一支试管不添加纤维素酶，但需加入等量的缓冲液，不能加入蒸馏水，否则会影响溶液的pH。
实验验证：纤维素酶能分解纤维素
①取二支20mL的试管
实验验证：纤维素酶能分解纤维素
②各加入一张滤纸条
③分别加入pH4.8，物质量为0.1mol/L的醋酸－醋酸钠缓冲液11ml和10ml
⑤两支试管固定在锥形瓶中，放在
140r/min的摇床上振荡1h
⑥结果：乙试管的滤纸条消失
讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？
④在乙试管中加入1mL纤维素酶（70-80U/mL）
1.筛选方法
2.筛选原理
刚果红染色法：这种方法能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选 。
即：可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
二.纤维素分解菌的筛选
练一练：
1.下列关于纤维素酶的说法，错误的是
A. 纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种
B. 纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖
C. 纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁
D. 葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖
2.利用刚果红法可以筛选出纤维素分解菌，下列说法错误的是
A. 刚果红能与纤维素形成红色复合物
B. 刚果红能与纤维二糖形成红色复合物
C. 刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物
D. 若培养基上产生了透明圈，则说明已筛 　选出了纤维素分解菌
三.实验操作——实验流程图
三.实验操作——注意事项
【操作一】土壤取样
①分布环境：
富含纤维素的环境中
②原因：
生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的菌的几率要高于普通环境。
③实例：
树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等。
三.实验操作——注意事项
讨论:如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？
将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约10cm左右的腐殖土壤中。
三.实验操作——注意事项
【操作二】选择培养
1、选择培养的目的：
增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物
2、制备选择培养基：
选择培养基成分分析
培养基组成 提供的主要营养物质

纤维素粉 5g 碳源（能源）
NaNO3 1g 氮源、无机盐
KCl 0.5g； Na2HPO4·7H2O 1.2g
KH2PO4 0.9g；MgSO4 ·7H2O 0.5g 无机盐
酵母膏 0.5g 生长因子、氮源、碳源（极少）
水解酵素 0.5g 氮素、生长因子
溶解后，蒸馏水定容至1000mL 水
②这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？
③你能否设计一个对照实验，说明选
择培养基的作用。
液体培养基，原因是配方中无凝固剂。
有选择作用，本配方中的主要碳源是纤维素（粉），所以能分解纤维素的 微生物可以大量繁殖。
自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,或者将纤维素改为葡萄糖。
①右边的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？
为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？
在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。
3.选择培养的操作方法
将土样加入装有30 mL___________的锥形瓶中，将锥形瓶固定在_____上，在一定温度下振荡培养1～2 d，直至培养液变_____ ，也可重复选择培养。
选择培养基
摇床
混浊
三.实验操作——注意事项
三.实验操作——注意事项
【操作三】梯度稀释
按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释101～107倍。
三.实验操作——注意事项
【操作四】将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
1、制备鉴别培养基：
2、涂布平板：将稀释度为104～106的菌悬液各取0.1ml涂布在培养基上，30～37℃倒置培养
鉴别纤维素分解菌的培养基配方 CMC-Na 酵母膏 KH2PO4 琼脂 土豆汁
5～10g 1g 0.25g 15g 100mL
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000mL
(水溶性羧甲基纤维素钠)
鉴别纤维素分解菌的培养基
培养基组成分 提供的主要营养物质
CMC-Na 5~10g
碳源
酵母膏 1g 碳源、氮源、生长因子
KH2PO4 0.25g 无机盐
土豆汁 100mL 碳源
琼脂 15g 凝固剂
上述物质溶解后，加蒸馏水定容至1000mL 水
三.实验操作——注意事项
【操作五】挑选产生透明圈的菌落
参照课本刚果红染色法，挑选产生透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落
方法一：先 ，
再加入刚果红进行颜色反应。


方法二：在 时就加入刚果红。
培养微生物
倒平板
◎方法一加入中NaCl溶液的作用？
漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。
〖思考2〗
〖思考1〗
◎这两种方法各有哪些优点与不足？
颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用
1、操作繁琐
2、刚果红会使菌落之间发生混杂
操作简便，不存在菌落混杂问题
1.产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈
2.有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。
染色法 优点 缺点
方法一

方法二
区分：纤维素分解菌的
选择培养基和鉴别培养基
选择培养基：液体，常利用其 增加纤维素分解菌的浓度；

鉴别培养基：固体，可根据是否产生透明圈进行筛选，以获得较纯净的纤维素分解菌。
（一）如何了解培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出目的菌落？
（二）分离的结果是否一致
设置空白对照，若对照的培养基在培养过程中无菌落生长则说明培养基制作合格。
如果观察到产生明显透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。
如果不同，分析产生不同结果的原因。
四.结果分析与评价
为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行_______________实验。
纤维素酶的发酵方法有______ 发酵和______ 发酵。
纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的________ 含量进行定量测定。
发酵产纤维素酶
液体
固体
葡萄糖
五.课题延伸
葡萄糖与斐林试剂在50-65℃水浴条件下加热1-2min，可产生砖红色沉淀，以此判断微生物是否产生了纤维素酶。
将细菌涂布在尿素为唯一氮源的选择
培养基上
将细菌涂布在纤维素粉为主要碳源的
选择培养基上
固体培养基
液体培养基
筛选菌株
选择培养
归纳一：比较本实验的流程与课题2有哪些异同？
比较项目 分解尿素的细菌 纤维素分解菌
选
择
培养
基 原理
培养基类型
目的
在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高。在培养基中加入酚红指示剂，如果pH升高指示剂会变红
刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶催化分解后红色复合物无法形成，培养基上就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈
土壤取样 样品梯度稀释
涂布平板 培养与观察
土壤取样 选择培养 梯度稀释 涂布培养 挑取菌落
进一步鉴定
脲酶检测法
刚果红染色法
归纳二：课题2和课题3的鉴别方法有何区别？
比较项目 分解尿素的细菌 纤维素分解菌
鉴
定
培养基 原理
方法
使用步骤



归纳三：鉴别和分离微生物的实验设计
1. 利用选择培养基分离纯化某种微生物
在培养基中加入青霉素，以抑制细菌、放线菌的生长，从而分离到酵母菌和霉菌；在培养基中加入高浓度的食盐可以抑制多种细菌的生长，分离出耐盐的金黄色葡萄球菌；
普通培养基在无氧条件下可分离出厌氧型、兼性厌氧型微生物。
无氮培养基：分离纯化固氮菌。
不含有机碳源的培养基：分离纯化自养型细菌。
将石油作为唯一碳源的培养基可分离出能分解石油的细菌。
归纳三：鉴别和分离微生物的实验设计
2. 利用鉴别培养基检验某种微生物是否存在
在培养基中加入伊红和美蓝，可以用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌。如果有大肠杆菌，其代谢产物就与伊红和美蓝结合，使菌落呈黑色。
酚红培养基：鉴别分解尿素的细菌，若分解则出现NH4+，碱性变红
归纳三：鉴别和分离微生物的实验设计
3. 实验设计：探究微生物生长所必需的某种特殊营养物质
某种微生物在基本培养基中不能生长，添加某物质后能正常生长，而添加其他物质均不能正常生长，则添加后能使某种微生物正常生长的物质就是该种微生物生长所必需的特殊营养物质。
分解纤维素的微生物的分离
纤维素酶
种类、作用、催化活力
刚果红染色
筛选原理
实验设计
土壤取样
选择培养
涂布培养
纯化培养
前置染色法
后置染色法
富含纤维素土壤
增大分解菌含量
染色鉴别
分离出分解菌
挑战高考：
植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。回答下列问题：
（1）分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分组成的复合酶，其中的葡萄糖苷酶可将__________ 分解成___________。
（2）在含纤维素的培养基中加入刚果红（CR）时，CR可与纤维素形成______色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的____________。
纤维二糖
葡萄糖
红
透明圈
挑战高考：
（3）为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基（成分见下表）
据表判断，培养基甲_____（填“能”或“不能”）用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是_ ______________________________；培养基乙______（填“能”或“不能”）用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是___________________________________________________。
注：“+”表示有，“-”表示无
培养基中没有纤维素，不会形成CR-纤维素红色复合物，即使出现单菌落也不能确定其为纤维素分解菌
不能
液体培养基不能用于分离单菌落
不能
酵母膏 无机盐 淀粉 纤维素粉 琼脂 CR溶液 水
培养基甲 + + + + + + +
培养基乙 + + + - + + +
作 业
1.整理并熟练掌握笔记内容
2.完成配套练习作业
3.预习专题三·课题一
???
??? 酵母膏实际上是膏状的酵母抽提物，酵母抽提物是国家行业标准的规定名称。 ??? 酵母抽提物以酵母为原料，采用自溶法或加酶水解法工艺，经分离、脱色（或精制浓缩、喷雾干燥）而成的，含氨基酸、肽、多肽及酵母细胞水溶性成分的产品。包含粉状、与膏状的产品。 ??? 酵母膏可以有食品调味与生物发酵培养基两大类用途。在生物发酵行业应用还有一种习惯叫法是酵母浸膏。
【酵母膏】
微生物培养基的氨基酸氮源，由酪蛋白水解得到，常见商品名称为水解酪素或酶解酪素。酪蛋白水解后富含21种氨基酸，氨基酸种类齐全。因此常用于制备培养基。
【酪素】
D
1、下列材料中纤维素含量最高的是 ( )
A．杨树 B．小麦
C．玉米 D．棉花
C
2、纤维素酶能够分解 ( )
A．纤维素的微生物
B．淀粉的微生物
C．纤维素
D．淀粉
B
3、刚果红能与哪项物质形成红色复合物 ( )
A．纤维二糖 B．纤维素
C．葡萄糖 D．麦芽糖
D
5、纤维素分解菌的选择培养基有选择作用，原因在于其含有 ( )
A．NaNO3 B．KCl
C．酵母膏 D．纤维素粉
A
6、下列哪种生物能产生纤维素酶 …( )
A．纤维素分解菌 B．牛 C．羊 D．兔
B
8、选择培养的结果：培养液变 ( )
A．清澈 B．浑浊
C．红色 D．产生透明圈
C
9、刚果红染色时，加入刚果红可在 ( )
①制备培养基时 ②梯度稀释时
③倒平板时 ④涂布时
⑤培养基上长出菌落时
A．①③ B．②⑤
C．③⑤ D．④⑤