课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 课件 （42张PPT）

(共43张PPT)
课题2
土壤中分解尿素的细菌的
分离与计数
上一节课我们学习了如何配制培养基以及接种微生物的方法，这一节课我们学习如何从土壤中分离出我们所需要的微生物。
导入新课：
1．明确用培养基对微生物进行选择的原理。
2．学会统计微生物数量的方法。
3．能进行实验设计与操作，并对实验结果进行分析与评价。
学习目标
尿素[CO(NH2)2]——重要的农业氮肥。但是尿素并不能直接被农作物吸收。只能被土壤中细菌分解为NH3才能被植物吸收利用，土壤中细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶。
课题背景：
目的：分离产生脲酶的细菌
一、研究思路
（一）如何筛选菌种？
提出的问题
—如何寻找耐高温的酶？
解决问题的思路
—寻找耐高温环境；
原理
—高温淘汰其他菌，选出耐高温细菌，
耐高温菌种提取耐高温酶。
1、如筛选Taq菌种：
PCR技术：DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。
Taq细菌
3、筛选原因:因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大多数微生物，只有Taq细菌被筛选出来。
2、思路：根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
（二）自然界中目的菌株的筛选
1、原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
2、方法：利用选择培养基分离
（三） 实验室中目的菌株的筛选
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL。
3、举例：一个培养基的配方如下：
②该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？
碳源：葡萄糖、尿素。氮源：尿素
③此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？
能。只有产生脲酶的细菌能利用尿素作为氮源而生存。
思考：
①从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上属于哪类培养基？
固体培养基、选择培养基
1、制备培养基：
①制备选择培养基（尿素为唯一氮源）
②制备牛肉膏蛋白胨培养基
思考？为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？对照作用
④怎样证明此培养基具有选择性呢？
2、实验设计：
实验组 对照组
培养基类型 以尿素为唯一氮源的培养基
牛肉膏蛋白胨培养基

是否接种 是 是
目的 分离尿素细菌
判断该培养基有无选择性

结果 只生长尿素细菌
生长多种微生物


3、实验结果：
相同的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。
二、统计菌落数目：
1、常用的方法---稀释涂布平板
（1）操作方法：
稀释涂布平板→统计菌落数
（2）原理：
①在稀释度足够高时，在固体培养基表面生长的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表一个活菌。1个菌落→1个活菌
②通过统计平板上的菌落数来推测样品中大约含有的活菌数。
（3）计算公式：
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。
（4）统计原则
①选择菌落数在30～300的平板上计数。
②每个稀释度取3个平板取其平均值。
③统计的菌落往往比活菌的实际数目低，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
例：两位同学用稀释涂布平板法测定同
一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为
106的培养基中，得到以下两种统计结果。
1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。
2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。
你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？
甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）
乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值
计算公式的应用：
某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml） ( )
A. 2.34×108
B. 2.34×109
C. 234
D. 23.4
B
（5）设置对照
设置对照的目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

对照实验是指除了 被测试 的条件外，其他条件都 相同 的实验。
例： 利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中，从对应稀释倍数为106的培养基中，A、B两同学分别得到以下两种统计结果。
1、A同学筛选出150个菌落。
2、B同学筛选出50个菌落。
B认为A的培养基被杂菌污染了，或培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基中生长。A确认自己的操作无误，但也拿不出能令人信服的证据。
请你帮助A同学改进实验，提供具有说明了的证据。
(1)A同学出现此结果的可能原因？
⑴土样不同
⑵培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质)
(2)设置对照实验，帮助A同学排除上述两个可能影响实验结果的因素？
小结：这个实例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少
方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验
方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。
结果预测：如果结果与A同学一致，则证明______；如果结果不同，则证明A同学存在__________________
___________________
A无误
操作失误
或培养基的配制有问题。
2、其他方法：
利用显微镜直接计数：
利用血球计数板(血细胞计数板），在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。
缺点:
不能区分死菌与活菌；
3、样品稀释
5、微生物的培养与观察
6、菌落计数
1、土壤取样
2、制备培养基
四、实验过程
4、涂布平板
（一）土壤取样
①取样原因：土壤有“微生物的天然培养基”之称，同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大、种类最多，大约70%—90%是细菌。
②土壤要求：富含有机质，PH接近中性且潮湿。
③取样部位：距地表约3~8㎝的土壤层。
具体做法：找到肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。（取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。）
（二）制备培养基：
准备选择培养基，以尿素为唯一氮源制备9个平板培养基。
（三）样品稀释
（1）稀释原因：样品的稀释程度直接影响平板上生长的菌落数目。（2）稀释标准：选用一定范围的样品液进行培养，保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板。
（3）稀释倍数：
①测细菌数：一般用104、105、106稀释液
②测放线菌数：一般用103、104、105稀释液
③测真菌数：一般用102、103、104稀释液
（4）分离不同的微生物采用不同的稀释度的原因：
不同微生物在土壤中含量不同。
稀释倍数为 101 ～106。每个稀释度均用3个选择培养基和1个蛋白胨培养基。用无菌吸管分别吸取0.1毫升土壤稀释液放入对应的平板中，用无菌涂布器在培养基表面轻轻地涂抹均匀。
（四）涂布平板：
（五）微生物的培养与观察
（1）培养：不同微生物往往需要不同培养温度和培养时间。
细菌：30～37℃培养1～2d
放线菌：25～28℃培养5～7d
霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。
（2）观察：在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定（稳定菌落）时的记录作为结果
注：如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。
关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等，都是区分细菌的重要手段。
（六）计数 当菌落数目稳定时，取同一稀释度下的3个平板进行计数，求出平均值并根据所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。 　　
（1）无菌操作
1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。
2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。
3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。
（2）做好标记
注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。

五、注意事项：
1.培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落？
对照的培养皿无菌落说明培养基没有污染。
牛肉膏培养基的菌落数目多余选择培养基的菌落数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。
2.获得某一稀释度下，菌落数30～300的平板，在这以稀释度下,是否至少有两个平板的菌落数相接近？相接近，说明操作成功。
六、结果分析与评价：
七、菌种鉴定：（筛选后必鉴定）
1、鉴别培养基：不影响微生物的生存
2、酚红培养基：鉴定分解尿素的细菌(酚红在低PH值时呈现黄色，在高PH值时呈现红色即酚红遇碱变红色)。
3、原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→ 酚红变红
4、方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。
巩固练习
1．下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是 ( A )
A．KH2PO4、Na2HP04、MgS04·7H20、葡萄糖、尿素、琼脂、水
B．KH2PO4、Na2HP04、MgS04·7H20、葡萄糖、琼脂、水
C．KH2PO4、Na2HP04、MgS04·7H20、尿素、琼脂、水
D．KH2PO4、Na2HP04、MgS04·7H20、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水；
一、选择题：
2.关于土壤取样的叙述错误的是 ( C )
A．土壤取样，应选取肥沃、湿润的土壤
B．先铲去表层土3cm左右，再取样
C．取样用的小铁铲和信封在使用前不用灭菌
D．应在火焰旁称取土壤

3.下列关于从土壤中分离细菌的操作步骤中，正确的是 ( A )
①土壤取样 ②称取10g土壤取出加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中 ③吸取0.1mL进行平板涂布 ④依次稀释至101、102、103、104、105、106、107稀释度
A． ①→②→④→③ B．①→③→②→④
C． ①→②→③→④ D．①→④→②→③
4.某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均值为235，那么每克样品中的菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( C )
A．2.35×108 B．2.35×107
C． 2.35×109 D．235

5.在做分离分解尿素的细菌实验时，A同学从对应106培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。A同学的结果产生原因( A )
①由于土样不同 ②由于培养基污染 ③由于操作失误 ④没有设置对照
A．①②③ B．②③④
C．①③④ D．①②④
6.下列说法不正确的是（ B　）
A.科学家从70－80度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚 合酶。
B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、 M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值。
C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度
D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。

7.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（　C　）
A.较多的氮源物质 B.较多的碳源物质
C.青霉素类药物 D.高浓度食盐
8.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是( D )
A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3　　
C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素
9.使用选择培养基的目的是（ C　）
A.培养细菌　　
B.培养真菌　　
C.使需要的微生物大量繁殖
D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别
10.下列可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是 ( A )
A．以尿素为唯一氮源的培养基中加人酚红指示剂
B．以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂
C．以尿素为唯一氮源的培养基中加入苏丹Ⅲ试剂
D．以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂

11.土壤取样时最好选择哪种环境中的土壤做分离细菌的实验 ( D )
A．街道旁 B．花盆中 C．农田中 D．菜园里
12、用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中．得到以下几种统计结果，正确的是（ A ）
A．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是2l0、240和250，取平均值233.
B．涂布了两个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238.
C．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和206，取平均值163.
D．涂布了一个平板，统计的菌落数是230.


13．用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是 ( C )
A．未接种的选择培养基
B．未接种的牛肉膏蛋白胨(全营养)培养基
C．接种了的牛肉膏蛋白胨(全营养)培养基
D．接种了的选择培养基
14.下列关于测定土壤中细菌数量的叙述，正确的是 ( B )
A．一般选用103～107倍的稀液分别涂布
B．测定放线菌的数量，一般选用103、lO 4和105倍稀释
C．测定真菌的数量，一般选用103、104和105倍稀释
D．当第一次测量某种细菌的数量，可以将101～107倍的稀释液分别涂布到平板上培养

15.下列关于微生物的培养叙述错误的是( D )
A．细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2 d
B．放线菌一般在25～28℃的温度下培养5～7 d
C．霉菌一般在25～28℃的温度下培养3～4 d
D．不同种类的微生物，一般需要相同的培养温度和培养时间
16.下列操作需要在火焰旁进行的一组是( C )
①土壤取样 ②称取土壤 ③稀释土壤溶液 ④涂布平板 ⑤微生物的培养
A．①②③④⑤
B．②③④⑤④⑤
C．②③④
D．③④⑤
17．要将从土壤中提取的自生固氮菌与其他的细菌分离出来，应将它们接种在（ D ）
A．加入氮源和杀菌剂的培养基上
B．不加入氮源和加杀菌剂的培养基上
C．加入氮源，不加杀菌剂的培养基上
D．不含氮源和杀菌剂的培养基上

18．将圆褐固氮菌接种到彻底灭菌的固体培养基上，经过一段时间培养，就能够得到（ C ）
A．菌丝 B．无一定形态的群体 C．菌落 D．单个细菌
19．在接种操作的过程中，不正确的是 （ C ）
A．要将接种环灼烧灭菌
B．取下棉塞后要将试管口灼烧灭菌
C．将接种环伸入试管内，先接触长菌多的部位
D．接种后还要将管口灭菌加塞
20．高压蒸气灭菌的原理是 （ B ）
A．高压使细菌DNA变性
B．高压使细菌蛋白质凝固变性
C．高温烫死细菌
D．高温使细菌DNA变性
21．尿素是尿素分解菌的氮源，因此在配制培养基时 （ D ）
A．葡萄糖在培养基中含量越多越好
B．尿素在培养基中含量越少越好
C．尿素分解菌有固氮能力，故培养基中尿素为无机氮
D．尿素分解菌无固氮能力，故培养基中的尿素为化合态氮