高中生物人教版选修1 专题2 课题2 土壤中分离尿素的细菌的分离与计数 （共44张PPT）

(共44张PPT)

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上一节课我们已经学习了培养基的配制以及接种技术，现在我们就来学习如何从土壤中将我们需要的微生物进行分离。

土壤
微生物
尿素是由碳、氮、氧和氢组成的有机化合物。外观是白色晶体或粉末。
尿素化学式
尿素
尿素通常作为一种植物的氮肥，广泛应用于各种作物和土壤。但是，农作物不能直接吸收尿素，必须先通过土壤中的细菌将尿素分解为氨和二氧化碳，才能被植物利用。
CO(NH2)2+H2O → 2NH3+CO2
脲酶
这种细菌能够分解尿素，是因为他们能够合成脲酶。
脲酶
脲酶是一种蛋白质，能溶于水，不溶于醇、醚、丙酮等有机溶剂。加热和重金属离子都能抑制或降低脲酶的活性。
你能想一想怎样能将分解尿素的细菌从土壤中分离出来吗？
想一想
课题2
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
专题2 微生物的培养与应用
一、研究思路
二、实验设计
三、操作提示
四、结果分析与评价
五、课题延伸
研究培养基对微生物的选择作用。
从土壤中分离出能够分解尿素的细菌；
统计每克土壤样品中含有多少这样的细菌。
知识与能力
过程与方法

教学目标
从感性上认识分离尿素的细菌，了解其具有的作用。
情感态度与价值观
1. 课题重点
对土样的选取和选择培养基的配制。
2. 课题难点
对分解尿素的细菌的计数。

重点与难点
（一）筛选菌株
一 研究思路

耐热微生物
温泉

耐寒微生物
冰川

分解石油的细菌
油田
筛选原则：
根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
实例：Taq DNA聚合酶的发现
DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术。此项技术的自动化，要求使用耐高温的DNA聚合酶，该去哪里寻找？
科学家是从水生耐热细菌 Taq中分离到耐高温的Taq DNA聚合酶的。
为什么Taq细菌能从热泉中被筛选出来呢？
这是因为热泉70~80℃的高温条件淘汰了绝大多数微生物，而使耐热的Taq细菌脱颖而出。实验室中微生物的筛选，也应用了同样的原理，即人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。
1、什么是微生物的选择培养？
利用培养基的组成使适宜生长的特定微生物得到较快繁殖的技术。
2、选择培养基
定义
允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，叫做选择培养基。
选择培养基配方
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H20 0.2g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000ml
在左图的培养基配方中，碳源和氮源分别是什么？
碳源——葡萄糖
氮源——尿素
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。请你分析该培养基的配方，想一想这种培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？
答：这种培养基具有选择作用。微生物的生长需要氮源，该培养基中只加入了一种氮源——尿素，只有能分解尿素的微生物才能生长，所以具有选择性。
（二）统计菌落数目
理论依据：
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
恰当的稀释度是成功统计菌落数目的关键。
样品稀释培养示意图
菌落数目在30-300个之间的平板最适宜计数
思考
如何根据平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？
答：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板上的菌落数的平均值，然后按公式进行计算。
每克样品中 菌株数＝
某一稀释度下的平均菌落数
涂布时用到的稀释液体积 mL
×稀释倍数

（三）设置对照
排除实验组中非测试因素对实验结果的影响。
目的
什么是对照实验？
除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，称为对照实验。
通过书中的案例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。
二 实验设计
菌落计数
配制土壤溶液
系列稀释
涂布平板与培养



土壤中细菌分离与计数示意图
实验具体操作步骤：
1、土壤取样

从富含有机物、潮湿、酸碱度适中的土壤中取样。铲去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。
2、制备培养基
准备牛肉膏蛋白胨培养基和用尿素作为氮源的选择培养基
牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用;
选择较为宽泛的稀释范围，稀释倍数为103-107;
每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基，共需要15个选择培养基，5个牛肉膏蛋白胨培养基；
准备8个灭菌试管和1个灭菌移液管。
探究
为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？
答：这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株/g）是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性的提供选择培养的条件。
3、微生物的培养与观察

将土样以1、101、102……依次等比稀释至107稀释度，按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。

注明培养基种类、培养日期以及平板培养样品的稀释度。将涂布好的培养皿放在30℃下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。
比较牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。
挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，观察能否产生红色反应。
不同形态的菌落
不同形态的菌落
4、细菌的计数

当菌落数目稳定时，选取菌落数在30-300的平板进行计数。在同一稀释度下至少对3个平板进行重复计数，求出平均值，然后根据平板对应的稀释度计算样品中细菌的数目。
三 操作提示
（一）无菌操作
1. 取土样用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都需要灭菌。
2. 应在火焰旁称取土壤，在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。
3. 在稀释土壤溶液过程中，每一步都要在火焰旁操作。
（二）做好标记
1. 在标记培养皿时，应注明培养基种类、培养日期及平板上培养样品的稀释度等。
2. 进行系列稀释时，将已经进行过稀释操作的试管，按稀释度递增的顺序，依次放置在试管架的另一行。
（三）制定计划
1. 第一天进行实验器材的灭菌以及制备培养基。
2. 第二天进行稀释涂布平板的操作。
3. 第三、四、五天进行实验结果的观察与记录。
四 结果分析与评价
1、培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落？
对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显大于选择培养的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。
2、样品的稀释度操作是否成功？
如果得到了2个或2个以上菌落数目在30-300的平板，说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。
3、重复组的结果是否一致？
如果选取的土样一致，统计的结果应该接近；如果结果相差太远，分析产生差异的原因。
阴性
阳性
五 课题延伸
在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨。氨会使培养基的碱性增强，pH升高。
以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。
化学方法检测分解尿素的细菌：
研究思路

实验设计
筛选菌株
选择培养




筛选原则
统计菌落数目
操作提示

无菌操作
做好标记

选择培养基
定义
配方

目的
定义

土壤取样
配制培养基
制定计划
结果分析与评价
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数


设置对照
微生物培养与观察
细菌的计数

课堂小结
1. 用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中.得到以下几种统计结果，正确的是（ ）
A. 涂布了一个平板，统计的菌落数是230
B. 涂布了两个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238
C. 涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和196，取平均值143
D. 涂布了三个平板，统计的菌落数分别是2l0、188和250，取平均值216
答案：C

课堂练习
2. 在一个“淀粉—琼脂”培养基的5个圆点位置，分别用不同方法处理，将此实验装置放在37℃恒温箱中，保温处理24h后，将碘液滴在培养基的5个圆点上，其实验结果记录于下表：
淀粉圆点 实验处理方法 碘液处理后的颜色反应
① 新鲜唾液与盐酸混合 蓝黑色
② 经过煮沸的新鲜唾液 蓝黑色
③ 接种面包霉 棕黄色
④ 只有新鲜的唾液 ？
⑤ 只有一定浓度的蔗糖溶液 ？
请指出④和⑤所发生的颜色反应，
以及③接种的面包霉的分泌物分别是（ ）
A. 棕黄色、棕黄色、淀粉酶
B. 蓝黑色、棕黄色、麦芽糖
C. 棕黄色、蓝黑色、淀粉酶
D. 棕黄色、蓝黑色、麦芽糖酶
答案：C