高中生物人教版选修1 专题5 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段 上课课件

(共44张PPT)
小时候，我们经常为魔术师的经典魔术所惊叹，他们可以把一只鸽子放入帽子里，然后变出许多鸽子。
新课导入
美国科学家穆里斯就变了这样一个魔术，不过他变魔术的材料不是鸽子，而是是DNA。
他发明的PCR技术可以使DNA在反应30次后变为现在的109倍。
专题五 DNA和蛋白质技术
课题2
多聚酶链式反应扩增DNA技术
教学目标
知识目标
1.理解PCR原理。
2.了解PCR的应用。
3.掌握PCR的基本步骤。
能力目标
1.掌握PCR技术的基本操作。
2.体验分子生物学实验方法。
过程与方法

1.PCR基本知识的阐述。
2.学生在实验过程中巩固。
情感态度与价值观
1.激发学生对科学的兴趣。
2.培养学生善于思考的创新精神。
教学重难点
课题重点
1.PCR的原理。
2.PCR的基本操作。
课题难点
PCR的原理。


内容解析
基础知识
DNA复制的条件
解旋酶： 打开DNA双链
DNA母链： 提供DNA复制模板
4种脱氧核苷酸： 合成子链的原料
DNA聚合酶： 催化合成DNA子链
引物： 使DNA连接脱氧核苷酸
思考：
能否在体外模拟体内DNA复制条件，进行DNA扩增？
PCR技术
PCR技术的原理
打开DNA双链
在80-100℃温度范围内，DNA变性，双螺旋结构解体，双链打开
DNA母链
解体后的双链为两条母链
合成子链原料
四种脱氧核苷酸

引物
与两条模板链结合的两种引物
DNA聚合酶
耐高温的TaqDNA聚合酶

温度
变性温度 94℃
复性温度 72℃
延伸温度 55℃
温度＞90℃，双链解旋为两条单链
PCR过程



















变性
90℃
温度≈50摄氏度，两种引物分别与两条单链DNA结合









复性












50℃
温度≈70℃，在DNA聚合酶的作用下，根据碱剂互补配对原则合成新的DNA链
延伸































70℃
PCR反应详细解析



















第一轮
变性
Ａ
Ｂ












复性
Ａ
Ｂ




















延伸
Ａ
Ｂ
第二轮









Ａ

变性









Ａ1
Ａ2
A链PCR











复性


Ａ1
Ａ2

延伸









Ａ1
Ａ2










PCR终产物
B链PCR











变性





B





B1
B2

复性










B1
B2



PCR终产物

延伸




















B1
B2
第三轮
A1



















B2
同A链第二轮PCR反应
同B链第二轮PCR反应
试验设计
利用PCR技术扩增双歧杆菌的DNA的片段
实验器材
双歧杆菌
培养基
离心机
微量移液器
化学试剂
PCR仪
1.双歧杆菌的培养
培养24h
培养基配方：
大豆蛋白胨 5g 酵母提取物 10g
微量盐溶液 40ml 葡萄糖 10g
半膀氨酸盐酸盐 0.5g 0.1%胰胨 5g
刃天青 1ml PH=7

实验过程
2.PCR操作
菌液离心，保留底部双歧杆菌沉淀
在双歧杆菌沉淀中加入0.2ml裂解液，使细胞裂解，释放DNA
3.DNA处理
2.提取DNA
55℃加热孵育3h 90℃加热10min 冷冰中冷却 离心
1.菌体处理

4.其它组分添加


DNA上清液10μL






10倍扩增缓冲液 5μL
25mmol/L MgCl2溶液3μL
20mmol/L4种脱氧核苷酸的均匀混合液1μL
Taq聚合酶1μL
两种引物各0.5μL
蒸馏水29μL
预变性
94℃，5min
30次重复反应
94℃，30s
55℃，30s
最后一次
94℃，1min
55℃，30s
72℃，1min
72℃，1min
5.PCR反应
变性
复性
延伸


6.PCR产物检验
分光光度计法
取2μL PCR DNA溶液，加入98μL H2O，使DNA５０倍稀释
以蒸馏水为对照，在260nm处测样品DNA的光吸收值
根据公式计算DNA含量
DNA含量（μg/mL）=
50×（260nm度数）×稀释倍数


结果分析与评价
　　根据公式计算DNA片段的含量比扩增前增加了了多少倍。
相关链接
琼脂糖凝胶电泳法检测DNA含量
1.配制浓度为１％的琼脂糖凝胶，倒入电泳槽中，插好梳子









2.向电泳槽中加入电泳缓冲溶液，移去梳子







3.在DNA中加入载样缓冲液，混匀后，滴加到样品孔中













4.接通电源，电泳20-40min



















+
-




5.EB 溶液染色，在紫外仪上观察电泳带及其位置，判断扩增情况
观察电泳带的粗细以及分布评价扩增的效果。
课堂小结
在体外制造与体内相同的环境，进行DNA复制反应
缓冲溶液
DNA模板
与两条模板链结合的两种引物
PCR原理
PCR反应条件
四种脱氧核苷酸
耐热的DNA聚合酶
合适的温度

变性
复性
延伸
PCR反应过程







































DNA含量检测
紫外分光光度计法
凝胶电泳法
针对性练习
1、下列关于基因工程应用的叙述，正确的是（ ）
A．基因治疗就是把缺陷基因诱变成正常基因
B．基因诊断的基本原理是DNA分子杂交
C．一种基因探针能检测水体中的各种病毒
D．原核基因不能用来进行真核生物的遗传改良
B
解析：
基因治疗是把健康的外源基因导入到有缺陷基因的细胞中；一种基因探针能检测相应的某一种特定的病毒；原核基因可以用来进行真核生物的遗传改良，例如用苏云金芽孢杆菌的抗虫基因改良棉花。
2、检测基因序列所必须的酶是（ ）
A.解旋酶
B.DNA连接酶
C.限制性内切酶
D.RNA聚合酶
C
解析：
A. 解旋可以用加热法。
B. DNA连接酶是在取得目的基因、并打开运载体后把它们组合起来时使用的。
D. RNA聚合酶是在转录或者RNA自我复制时使用
3、判断：DNA复制中单个脱氧核苷酸在DNA酶的作用下连接合成新的子链
( )
×
解析
DNA酶包括DNA聚合酶、DNA解旋酶、DNA内切酶等，此处应当指DNA聚合酶。
课堂练习
填空题
1.PCR仪加热使（ 　 　）变性, 复性使引物与模板DNA（ ）,延伸需将反应温度升至中温( ),在（ ）的作用下,以（ ）为原料合成新链。
2.PCR经（ ）三个阶段为一个循环。
DNA
互补
72℃
Tap酶
4种dNTP
变性、复性、延伸
选择题
1.PCR反应产物的特异性取决于( )
A退火温度 B引物碱基组成和长度
C循环次数 D.A+B+C
D
2. PCR实验的特异性主要取决于（ ）
A.DNA聚合酶的种类
B.反应体系中模板DNA的量
C.引物序列的结构和长度　
D.四种dNTP的浓度

C
简答题
1. PCR反应包括引物与DNA模板链间的解链与复性。讨论循环温度范围对引物-DNA双螺旋稳定性的影响及对PCR产率的影响。
答：由于GC对间是三个氢键的作用力，比两个氢键作用力的AT对要稳定，因此DNA的解链与退火都是依赖于G+C的含量与A+T的含量的比例。GC对普遍比AT对更倾向于非特异性的复性，所以GC含量高的引物比AT含量高的引物更适合于PCR反应。

2.你打算扩增下图所示的两段序列之间的DNA，请从所列出引物中选出合适的一对，
5’-GACCTGTGGAAGC CATACGGGATTG-3’
3’-CTGGACACCTTCG GTATGCCCTAAC-5’
引物1 引物2
5’-GACCTGTGGAAGC 5’-CATACGGGATTG
5’-CTGGACACCTTCG 5’-GTATGCCCTAAC
5’-CGAAGGTGTCCAG 5’-GTTAGGGCATAC
5’-GCTTCCACAGGTC 5’-CAATCCCGTATG
答：引物1：5’-GACCTGTGGAAGC
引物2：5’-CAATCCCGTATG
3.PCR的基本原理是什么？用PCR扩增某一基因，必须预先得到什么样的信息？
答：
（1）利用DNA半保留复制的原理，在体外进行DNA的变性、复性和引物延伸。
（2）至少要预先知道足够合成一对引物的靶DNA序列。
再见