人教版高二选修1：5．2多聚酶链式反应扩增DNA片段课件21PPT

(共29张PPT)
多聚酶链式反应
扩增DNA片段
——
PCR实验
分子生物学研究中最强大的实验技术之一

美国科学家　穆利斯(K.B.Mullis)
发明了PCR技术　1993年诺贝尔奖
多聚酶链式反应（PCR）

定义：是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。
意义：有效解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。
应用：广泛应用于医学、个体识别、亲子鉴定、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等各方面。
（一）PCR原理
在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似。
一、基础知识
DNA双链复制
PCR定义：是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。
1.1、DNA分子的组成成分和结构
DNA 分子的基本组成单位是 .共有 种,每个基本单位是由一分子的 、一分子的 、和一分子的 构成。
脱氧核甘酸
4
磷酸
碱基
脱氧核糖
1、DNA的复制
脱氧
核糖
含氮碱基
磷酸



碱基
1
2
3
4
5
O
ATGC
DNA的基本单位－脱氧核苷酸
5
4
3
2
1









O
O

P
O


HO
碱基
O
OH











O
O

P
O


HO
OH


碱基
5
3
3
5








碱基


脱氧核糖
磷酸基团







碱基

脱氧核糖







碱基
脱氧核糖

5’
3’
多脱氧核苷酸链结构简图
1.2、DNA分子的平面结构





A





T





G







C

A




G




C





T
















氢键
5'端
3'端
识别 ：
DNA分子的3′ 端与5′ 端
-OH端为3′ ; 磷酸基团的末端为5′。
5'端
3'端
1.3 细胞内DNA的复制过程
DNA反向平行的双螺旋结构
DNA的复制方向
DNA聚合酶不能从头开始开始合成DNA，而只能从3’端延伸DNA链，因此DNA复制需要引物。

当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3’端开始延伸DNA链，因此DNA的合成方向总是从子链的5’端向3’端延伸。
DNA母链




引物
DNA的复制方向
DNA的复制过程
1.DNA解旋：解旋酶在局部展开双螺旋结构的DNA分子为单链，
2.引物合成：引物酶辨认起始位点，以解开的一段DNA为模板，按照5'到3'方向合成RNA短链。形成RNA引物。
3.DNA片段的生成：在引物提供了3'-OH末端的基础上，DNA聚合酶催化DNA的两条链同时进行复制过程。
4.RNA引物的水解：当DNA合成一定长度后，DNA聚合酶水解RNA引物，在引物部位换上DNA片段(冈崎片段)。
5.DNA的连接：DNA连接酶将DNA片段(冈崎片段)的磷酸二酯键连接起来，形成完整的DNA分子。
引物：引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。
1.4 细胞内DNA复制条件
参与的组分
解旋酶
DNA母链

4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
在DNA复制中的作用
打开DNA的双链
提供DNA复制的模板
合成子链的原料
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
酶：解旋酶、DNA聚合酶

模板：DNA两条链
原料：4种脱氧核苷酸
引物：一小段RNA
思考：体内DNA复制的条件是什么？ 体外扩增DNA 如何提供相似环境？
体内DNA复制
PCR反应
能量：ATP
模板：
原料：
引物：
能量：
酶：
目的DNA
4种脱氧核苷酸
Taq聚合酶（耐高温）
一小段RNA（或一小段单链DNA
DNA双链
单链

变性（加热80-100℃ ）

复性（缓慢冷却）
PCR仪
PCR技术的原理总结
利用DNA分子的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解旋与结合，从而完成体外DAN分子的扩增。
体外DNA复制的条件： 四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、引物、 模板；缓冲溶液、严格控制温度的温控设备。
复制的方向：子链的5’端向 3’端延伸。
(二)PCR的反应过程(三十多次循环)

变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，称为变性。
复性：温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，称为复性。
延伸：温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。






1
2
3
4
5





22
55
72
94
时间（min）
温度
（℃）








适温延伸
高温变性
低温复性

重复1~3步30轮
步骤：变性 ——复性——延伸
（二）PCR的反应过程

5/
3/



3/
5/



5/
3/

引物Ⅰ
5/
3/


引物Ⅱ


变性95oC

复性55oC

延伸72oC

5/
3/



3/
5/



5?
引物1

5?
引物2

第二次复制

第一次复制

5?

5?


5?

5?


5?
5?
模板DNA


5?

5?


5?

5?


5?

5?



5?


5?

25～30 次循环（复制）后，模板DNA的含量可以扩大100万（220）倍以上。
每个循环包括：变性 ——复性——延伸
从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。
PCR的反应过程总结
二、 实验操作
1、PCR仪
设备及用具
2、微量离心管
一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml
3、微量移液器
用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次
实质上一台能够自动调控温度的仪器
二、 实验操作
（1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备）
（2）用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（移液）
（3）盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合）
（4）将微量离心管放在离心机上（离心）
（5）将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序（反应）
循环数 变性 复性 延伸
第一次 94°C,10min － －
30次 ９4℃，30s 55℃，30s 72℃，1min
最后一次 ９4℃，1min 55℃，30s 72℃，1min
三、 操作提示
1.为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。
2.PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份,并在-20℃储存。使用前,将所需试剂从冰箱拿出,放在冰块上缓慢融化。
3.在微量离心管中添加反应成分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换。所有的成分都加入后,盖严离心管口的盖子,用手指轻轻弹击管的侧壁,使反应液混合均匀,再将微量离心管放在离心机上,离心约10s,使反应液集中在离心管底部,再放入PCR仪中进行反应
目的?
（一）理论上DNA扩增数目的计算
四、结果分析与评价
1 、一条DNA，复制n次， DNA为2 n
2 、 a条DNA，复制n次， DNA为a x2 n
（二）实验中DNA含量的测定
1 、原理
可以通过测量DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关
2 、过程
①稀释
2?L PCR反应液，加入98?L蒸馏水，即将样品进行50倍稀释
②对照调零
以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零
取DNA稀释液100?L至比色杯中，测定260nm处的光吸收值
③测定并计算
DNA含量（?g/mL）＝50×(260nm的读数)×稀释倍数
课堂小结

多聚酶链式反应扩增DNA片段
PCR原理
DNA的复制需要酶、原料、能量、引物
DNA的变性和复性受温度影响


PCR过程
变性
复性
延伸




操作步骤
配制PCR反应体系
移入离心管
放入PCR仪
设置工作参数
DNA扩增





测定含量

稀释
调零
测定并读数
计算