2020年 空中课堂高二生物选修三课件：基因工程（2）PCR技术及其应用（共43张PPT）
文档属性
| 名称 | 2020年 空中课堂高二生物选修三课件：基因工程（2）PCR技术及其应用（共43张PPT） |  | |
| 格式 | zip | ||
| 文件大小 | 10.1MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 人教版（新课程标准） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2020-04-27 07:54:48 | ||
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文档简介
(共43张PPT)
基因工程（2）
——PCR技术及其应用
2020年空中课堂 高二生物学
Polymerase Chain Reaction，PCR
聚合酶链式反应
Kray Mullis，1944-2019
因发明PCR技术，于1993年获得诺贝尔化学奖。
PCR诞生的理论基础：DNA的半保留复制。
细胞内复制过程：解旋-子链延伸-复旋
PCR的条件
在进行PCR的操作时，科研人员需要向试管中加入：目的基因分子，引物，dNTP，缓冲液，热稳定DNA聚合酶，并在高温条件下进行操作。
由细胞内DNA复制的过程推测，这些材料分别充当了DNA复制过程中的哪些条件？
PCR的条件
1. DNA复制需要解旋，细胞中这一过程如何实现？在试管中如何实现？
细胞中，DNA的解旋由DNA解旋酶催化完成。
在试管中，可以通过加热断开氢键完成解旋。所需温度一般为90-95℃。
PCR的条件
2. 催化DNA子链合成的酶是哪一种酶？PCR反应过程需要较高的温度，所使用的酶需要具有什么样的特点？
催化DNA合成的是DNA聚合酶。
该酶由中国科学家钱嘉韵于黄石公园热泉微生物中分离得到，70℃条件下反应2h活性残余>90%。
PCR过程中，需要热稳定DNA聚合酶（Taq酶）催化完成。
PCR的条件
3. DNA聚合酶的特点：在已有核苷酸链的3’端添加单个核苷酸。据此推测，PCR还需要提供什么样的条件？
根据目的基因两条链 端的碱基序列，设计并添加相应引物。
两种引物序列往往既不相同，也不互补。
PCR过程中，需要提供一小段已有核苷酸链，我们称为引物。
3’
请同学们思考，子链的延伸方向是什么？
自身的5’→3’
5’端
3’端
4. 细胞内DNA复制利用 提供能量，并以 作为原料。
PCR过程中，利用dATP、dTTP、dCTP、dGTP同时提供原料和能量。统称为dNTP。
d代表脱氧核糖，dATP：脱氧腺苷三磷酸。
PCR的条件
ATP
脱氧核苷酸
PCR的条件
5. 利用PCR复制DNA的过程中，所需要的模板是什么？
目的基因的双链作为复制的模板。
6. 适宜的PH值和液体环境：试管内加入缓冲液。
? 胞内复制 PCR反应
解旋 在 酶作用下，细胞提供 ，双链 解开 加热至 ℃，双链 解开，不需要 酶
特点
酶
复制次数
相同点 都需要 ， ， ，都需要在一定的
中进行，都遵循 。
DNA解旋
ATP
部分
90-95
DNA解旋
边解旋边复制，半保留复制
体外迅速扩增
DNA解旋酶，DNA聚合酶
热稳定DNA聚合酶
细胞自身控制
一般30多次
模板
原料与能量
引物
液体环境
碱基互补配对原则
小结：胞内DNA复制与PCR的异同
例题1：PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，其基本原理和过程与细胞内DNA的复制类似。下列不是两者共同点的是
①边解旋边复制 ②遵循碱基互补配对原则
③需要引物 ④反应条件需要高温
A．①② B．②③ C．③④ D．①④
D
PCR的过程
加热解旋（90-95℃）
冷却，引物结合（55-60℃）
升温，合成子链（70-75℃）
1个循环
变性-退火-延伸
观看视频，跟随视频画出前三个循环的过程，并思考：
PCR的过程
几轮循环后会出现只有目的基因片段的DNA分子？
理论上讲，N个循环后，会出现多少个DNA片段？
资料
PCR的过程
几轮循环后会出现只有目的基因片段的DNA分子？
理论上讲，N个循环后，会出现多少个DNA片段？
3轮循环后会出现只有目的基因片段的DNA分子。
产物的计算公式：2N
例题2：
请为下列目的基因选择引物序列，并标出子链延伸的方向。
引物2：←
引物3：→
例题3：PCR过程一般经历下述三十多次循环：95℃下使模板DNA变性、解链→55℃下复性（引物与DNA模板链结合）→72℃下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。下列有关PCR过程的叙述，不正确的是
A．变性破坏的是碱基对之间的氢键
B．引物与DNA模板链的结合依靠碱基互补配对原则完成
C．延伸需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸
D．PCR与胞内复制相比所需酶的最适温度较高
C
PCR的应用
电泳：DNA分子在电场作用下发生迁移，一段时间后停止通电，越小的DNA片段距离出发点越远。
片段相同的DNA分子会停留在相同的条带，因此可以鉴别PCR的产物是否为目的基因。
（1）凝胶电泳法检测PCR的产物
1.以DNA扩增为基础的应用
PCR的应用
1.Marker：标准大小的DNA分子
1 2 3 4 5 6
2：目的基因
6：清水
3-5：不同循环次数的PCR产物
1.以DNA扩增为基础的应用
（2）在刑侦学中，只要能获取痕量DNA，就可以应用PCR技术，大量扩增，结合凝胶电泳，判断个体之间的亲缘关系。
法医及刑侦学也被形象地划分为“没有PCR的时代”和“有PCR的时代。”
谁是凶手？
PCR的应用
相信同学们都看过电影《侏罗纪公园》。影片中科学家通过琥珀中保存的少量恐龙血液，扩增DNA，复制了恐龙。在电影上映的同一个月，Nature杂志发表了利用PCR技术扩增1亿年琥珀化石中象鼻虫DNA并进行基因测序的论文。
这种手段有助于我们进一步了解进化史上各物种间的亲缘关系，为扩展和修正进化树提供了可信的依据。
可以相信，假以时日，PCR也会成为保护珍稀动物的有力手段。
（3）协助诊断
RT-PCR：逆转录PCR
reverse transcription PCR
利用提取的样本RNA分子逆转录后进行PCR扩增。
例题4：研究者用PCR技术获得一个亨廷顿氏舞蹈症（HD，常染色体显性遗传病，随年龄增长发病，人群中罕见）家族部分成员IT15基因中的CAG重复序列片段，通过检测确定不同个体该基因的差异。检测结果如图2所示，据此结果推测Ⅳ1 ___（有/无）出现HD症状的可能，依据是__ ______。
有
Ⅳ1与患者基因型一样，带有致病基因
PCR的应用
（3）协助诊断
荧光定量PCR：可以定量分析样本中的模板分子数量。
加入特定荧光探针，每一轮循环都释放带荧光的报告基团。通过检测荧光强度的增长情况，可知模板中DNA分子数。
乙肝是我国重要的传染病之一，由乙肝病毒引起。目前，检测患者是否感染乙肝病毒，及感染程度，主要有抗体检测法和荧光定量PCR法。
此外，流行性感冒、艾滋病等多种病毒感染性疾病，也都可以通过这种方法进行有效的诊断，为后续治疗提供依据。
例题5：肾上腺-脑白质营养不良是一种伴X染色体的隐性遗传病（用d表示），图1为某患者家系图。
首先提取四名女性与此基因有关的DNA片段并进行PCR，产物酶切后进行电泳（正常基因含一个限制酶切位点，突变基因增加了一个酶切位点），结果如图2。
（1）其中II-2的基因型是 。
XdY
（2）科研人员提取家系中四名女性的DNA片段并进行PCR，产物酶切后进行电泳（正常基因含一个限制酶切位点，突变基因增加了一个酶切位点）。
首先提取四名女性与此基因有关的DNA片段并进行PCR，产物酶切后进行电泳（正常基因含一个限制酶切位点，突变基因增加了一个酶切位点），结果如图2。
由图可知突变基因新增的酶切位点位于 （310bp/217bp/118bp/93bp）DNA片段中。
310bp
（3）已知女性细胞所含两条X染色体中的一条总是保持固缩状态而失活，推测失活染色体上的基因无法表达的原因是 。
固缩状态染色体无法正常解旋转录
分别提取四名女性的mRNA作为模板， 进行PCR，计算产物量的比例，结果如表1。
逆转录
综合图2与表1，推断II-3、II-4发病的原因是来自 （父方/母方）的X染色体失活概率较高，以 基因表达为主。
父方
Xd
PCR的应用
2.PCR是Sanger测序法的重要环节
第一步：扩增足够待测样本，加热解旋，保留单链作为模板链。
第二步：模板链结合引物后，分别加入4个试管。
第三步：每个试管中分别加入足量DNA聚合酶、四种dNTP和一种特定的ddNTP（双脱氧核糖核苷酸）。
第四步：在进行DNA扩增时，一旦ddNTP与模板链发生互补结合，子链延伸就停止了，因此得到长度不同的扩增产物。将产物进行电泳，按从下向上的顺序读取，即可完成测序。
例题6：科学家把一段T-DNA插入到A基因中，从而诱发突变，获得a基因，用PCR法确定T-DNA插入位置时，应从图1中选择的引物组合是 。
3.应用特定引物，进行基因定位
Ⅱ，Ⅲ
PCR的应用
例题7：用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物Ⅰ、Ⅱ，其连接部位如左下图所示，x为不能与模板链引物结合部位互补配对的序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段应是右下图中的
d
PCR的应用
4.在已有基因上增加片段
PCR的应用
5.应用PCR技术进行基因敲除或增加基因
例题8：为研究基因A与四膜虫对DDT的耐药性是否有关，科研人员提取耐药四膜虫个体的DNA，用下图所示的引物组合，分别扩增A基因的A1片段、A3片段。
重叠延伸PCR第一轮
X
Y
5’
3’
A1-X
5’
3’
3’
5’
重叠延伸PCR第二轮：上一轮的产物分子作为本轮的引物
N基因的a链→
←N基因的b链
A1+X↑
A3+Y↓
←N基因的a链
N基因的b链→
3’
3’
5’
5’
重叠延伸PCR第三轮：上一轮的产物作为本轮的模板
A3+Y↓
A1+X↑
A3+Y↓
A1+X↑
将大量N基因片段与扩增得到的A1片段、 A3片段置于PCR反应体系中进行扩增，得到的绝大多数扩增产物是____________。
回收的PCR扩增产物通过基因工程方法转入耐药四膜虫细胞中，并用加入____________的培养液筛选，获得A基因____________的四膜虫。
A1-N-A3
巴龙霉素
被敲除
PCR的应用
6.应用PCR技术诱导基因的定点突变
小结
PCR技术
原理
催生
变性-退火-延伸
过程
扩增
目的基因
敲除或增加基因、转基因操作、诱发定点突变、基因测序等
应用
谢谢同学们！再见！
基因工程（2）
——PCR技术及其应用
2020年空中课堂 高二生物学
Polymerase Chain Reaction，PCR
聚合酶链式反应
Kray Mullis，1944-2019
因发明PCR技术，于1993年获得诺贝尔化学奖。
PCR诞生的理论基础：DNA的半保留复制。
细胞内复制过程：解旋-子链延伸-复旋
PCR的条件
在进行PCR的操作时，科研人员需要向试管中加入：目的基因分子，引物，dNTP，缓冲液，热稳定DNA聚合酶，并在高温条件下进行操作。
由细胞内DNA复制的过程推测，这些材料分别充当了DNA复制过程中的哪些条件？
PCR的条件
1. DNA复制需要解旋，细胞中这一过程如何实现？在试管中如何实现？
细胞中，DNA的解旋由DNA解旋酶催化完成。
在试管中，可以通过加热断开氢键完成解旋。所需温度一般为90-95℃。
PCR的条件
2. 催化DNA子链合成的酶是哪一种酶？PCR反应过程需要较高的温度，所使用的酶需要具有什么样的特点？
催化DNA合成的是DNA聚合酶。
该酶由中国科学家钱嘉韵于黄石公园热泉微生物中分离得到，70℃条件下反应2h活性残余>90%。
PCR过程中，需要热稳定DNA聚合酶（Taq酶）催化完成。
PCR的条件
3. DNA聚合酶的特点：在已有核苷酸链的3’端添加单个核苷酸。据此推测，PCR还需要提供什么样的条件？
根据目的基因两条链 端的碱基序列，设计并添加相应引物。
两种引物序列往往既不相同，也不互补。
PCR过程中，需要提供一小段已有核苷酸链，我们称为引物。
3’
请同学们思考，子链的延伸方向是什么？
自身的5’→3’
5’端
3’端
4. 细胞内DNA复制利用 提供能量，并以 作为原料。
PCR过程中，利用dATP、dTTP、dCTP、dGTP同时提供原料和能量。统称为dNTP。
d代表脱氧核糖，dATP：脱氧腺苷三磷酸。
PCR的条件
ATP
脱氧核苷酸
PCR的条件
5. 利用PCR复制DNA的过程中，所需要的模板是什么？
目的基因的双链作为复制的模板。
6. 适宜的PH值和液体环境：试管内加入缓冲液。
? 胞内复制 PCR反应
解旋 在 酶作用下，细胞提供 ，双链 解开 加热至 ℃，双链 解开，不需要 酶
特点
酶
复制次数
相同点 都需要 ， ， ，都需要在一定的
中进行，都遵循 。
DNA解旋
ATP
部分
90-95
DNA解旋
边解旋边复制，半保留复制
体外迅速扩增
DNA解旋酶，DNA聚合酶
热稳定DNA聚合酶
细胞自身控制
一般30多次
模板
原料与能量
引物
液体环境
碱基互补配对原则
小结：胞内DNA复制与PCR的异同
例题1：PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，其基本原理和过程与细胞内DNA的复制类似。下列不是两者共同点的是
①边解旋边复制 ②遵循碱基互补配对原则
③需要引物 ④反应条件需要高温
A．①② B．②③ C．③④ D．①④
D
PCR的过程
加热解旋（90-95℃）
冷却，引物结合（55-60℃）
升温，合成子链（70-75℃）
1个循环
变性-退火-延伸
观看视频，跟随视频画出前三个循环的过程，并思考：
PCR的过程
几轮循环后会出现只有目的基因片段的DNA分子？
理论上讲，N个循环后，会出现多少个DNA片段？
资料
PCR的过程
几轮循环后会出现只有目的基因片段的DNA分子？
理论上讲，N个循环后，会出现多少个DNA片段？
3轮循环后会出现只有目的基因片段的DNA分子。
产物的计算公式：2N
例题2：
请为下列目的基因选择引物序列，并标出子链延伸的方向。
引物2：←
引物3：→
例题3：PCR过程一般经历下述三十多次循环：95℃下使模板DNA变性、解链→55℃下复性（引物与DNA模板链结合）→72℃下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。下列有关PCR过程的叙述，不正确的是
A．变性破坏的是碱基对之间的氢键
B．引物与DNA模板链的结合依靠碱基互补配对原则完成
C．延伸需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸
D．PCR与胞内复制相比所需酶的最适温度较高
C
PCR的应用
电泳：DNA分子在电场作用下发生迁移，一段时间后停止通电，越小的DNA片段距离出发点越远。
片段相同的DNA分子会停留在相同的条带，因此可以鉴别PCR的产物是否为目的基因。
（1）凝胶电泳法检测PCR的产物
1.以DNA扩增为基础的应用
PCR的应用
1.Marker：标准大小的DNA分子
1 2 3 4 5 6
2：目的基因
6：清水
3-5：不同循环次数的PCR产物
1.以DNA扩增为基础的应用
（2）在刑侦学中，只要能获取痕量DNA，就可以应用PCR技术，大量扩增，结合凝胶电泳，判断个体之间的亲缘关系。
法医及刑侦学也被形象地划分为“没有PCR的时代”和“有PCR的时代。”
谁是凶手？
PCR的应用
相信同学们都看过电影《侏罗纪公园》。影片中科学家通过琥珀中保存的少量恐龙血液，扩增DNA，复制了恐龙。在电影上映的同一个月，Nature杂志发表了利用PCR技术扩增1亿年琥珀化石中象鼻虫DNA并进行基因测序的论文。
这种手段有助于我们进一步了解进化史上各物种间的亲缘关系，为扩展和修正进化树提供了可信的依据。
可以相信，假以时日，PCR也会成为保护珍稀动物的有力手段。
（3）协助诊断
RT-PCR：逆转录PCR
reverse transcription PCR
利用提取的样本RNA分子逆转录后进行PCR扩增。
例题4：研究者用PCR技术获得一个亨廷顿氏舞蹈症（HD，常染色体显性遗传病，随年龄增长发病，人群中罕见）家族部分成员IT15基因中的CAG重复序列片段，通过检测确定不同个体该基因的差异。检测结果如图2所示，据此结果推测Ⅳ1 ___（有/无）出现HD症状的可能，依据是__ ______。
有
Ⅳ1与患者基因型一样，带有致病基因
PCR的应用
（3）协助诊断
荧光定量PCR：可以定量分析样本中的模板分子数量。
加入特定荧光探针，每一轮循环都释放带荧光的报告基团。通过检测荧光强度的增长情况，可知模板中DNA分子数。
乙肝是我国重要的传染病之一，由乙肝病毒引起。目前，检测患者是否感染乙肝病毒，及感染程度，主要有抗体检测法和荧光定量PCR法。
此外，流行性感冒、艾滋病等多种病毒感染性疾病，也都可以通过这种方法进行有效的诊断，为后续治疗提供依据。
例题5：肾上腺-脑白质营养不良是一种伴X染色体的隐性遗传病（用d表示），图1为某患者家系图。
首先提取四名女性与此基因有关的DNA片段并进行PCR，产物酶切后进行电泳（正常基因含一个限制酶切位点，突变基因增加了一个酶切位点），结果如图2。
（1）其中II-2的基因型是 。
XdY
（2）科研人员提取家系中四名女性的DNA片段并进行PCR，产物酶切后进行电泳（正常基因含一个限制酶切位点，突变基因增加了一个酶切位点）。
首先提取四名女性与此基因有关的DNA片段并进行PCR，产物酶切后进行电泳（正常基因含一个限制酶切位点，突变基因增加了一个酶切位点），结果如图2。
由图可知突变基因新增的酶切位点位于 （310bp/217bp/118bp/93bp）DNA片段中。
310bp
（3）已知女性细胞所含两条X染色体中的一条总是保持固缩状态而失活，推测失活染色体上的基因无法表达的原因是 。
固缩状态染色体无法正常解旋转录
分别提取四名女性的mRNA作为模板， 进行PCR，计算产物量的比例，结果如表1。
逆转录
综合图2与表1，推断II-3、II-4发病的原因是来自 （父方/母方）的X染色体失活概率较高，以 基因表达为主。
父方
Xd
PCR的应用
2.PCR是Sanger测序法的重要环节
第一步：扩增足够待测样本，加热解旋，保留单链作为模板链。
第二步：模板链结合引物后，分别加入4个试管。
第三步：每个试管中分别加入足量DNA聚合酶、四种dNTP和一种特定的ddNTP（双脱氧核糖核苷酸）。
第四步：在进行DNA扩增时，一旦ddNTP与模板链发生互补结合，子链延伸就停止了，因此得到长度不同的扩增产物。将产物进行电泳，按从下向上的顺序读取，即可完成测序。
例题6：科学家把一段T-DNA插入到A基因中，从而诱发突变，获得a基因，用PCR法确定T-DNA插入位置时，应从图1中选择的引物组合是 。
3.应用特定引物，进行基因定位
Ⅱ，Ⅲ
PCR的应用
例题7：用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物Ⅰ、Ⅱ，其连接部位如左下图所示，x为不能与模板链引物结合部位互补配对的序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段应是右下图中的
d
PCR的应用
4.在已有基因上增加片段
PCR的应用
5.应用PCR技术进行基因敲除或增加基因
例题8：为研究基因A与四膜虫对DDT的耐药性是否有关，科研人员提取耐药四膜虫个体的DNA，用下图所示的引物组合，分别扩增A基因的A1片段、A3片段。
重叠延伸PCR第一轮
X
Y
5’
3’
A1-X
5’
3’
3’
5’
重叠延伸PCR第二轮：上一轮的产物分子作为本轮的引物
N基因的a链→
←N基因的b链
A1+X↑
A3+Y↓
←N基因的a链
N基因的b链→
3’
3’
5’
5’
重叠延伸PCR第三轮：上一轮的产物作为本轮的模板
A3+Y↓
A1+X↑
A3+Y↓
A1+X↑
将大量N基因片段与扩增得到的A1片段、 A3片段置于PCR反应体系中进行扩增，得到的绝大多数扩增产物是____________。
回收的PCR扩增产物通过基因工程方法转入耐药四膜虫细胞中，并用加入____________的培养液筛选，获得A基因____________的四膜虫。
A1-N-A3
巴龙霉素
被敲除
PCR的应用
6.应用PCR技术诱导基因的定点突变
小结
PCR技术
原理
催生
变性-退火-延伸
过程
扩增
目的基因
敲除或增加基因、转基因操作、诱发定点突变、基因测序等
应用
谢谢同学们！再见！