高中生物人教版选修1专题2课题1：2．1微生物的实验室培养（65张PPT）

(共65张PPT)
巴斯德的曲颈瓶实验说明了什么
1862年，巴斯德设计出一个巧妙的曲颈瓶，并做试验：当把烧瓶中的肉汤煮沸时，瓶中的微生物被杀死了，水蒸汽把瓶颈中的微生物也杀死了。汤放凉时，新鲜的空气通过瓶颈进到瓶子中，而带菌的灰尘由于比空气重，在长颈向下弯曲处就被拦截住了。这样处理的肉汤放许多天也不会变质。而如果把肉汤倾斜，让它通过长颈的弯曲部，或者把长颈打断，肉汤中很快就腐败充满了微生物。这就证明了，是空气中的微生物使汤腐败，而不是汤腐败产生了微生物。

专题2 微生物的培养与应用
㈠.微生物的类群
微生物
原核类:
真核类
非细胞类：

细菌、支原体、放线菌、蓝藻等
个体微小、结构简单，通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到。
酵母菌、霉菌、食用菌

真菌：
原生生物：
显微藻类、原生动物（如：草履虫、变形虫等）
病毒、类病毒、朊病毒
◆微生物的共同特点：
微生物基础知识

大肠杆菌
霍乱弧菌
小技巧： 凡是“菌”前面有：“杆”、“球”、 “弧” 、 “螺旋”的都是细菌。
金黄色葡萄球菌
①原核类：如细菌
螺旋菌
草履虫
大变形虫

②真核类
衣藻
a:原生生物
单细胞:酵母菌



多细胞
霉菌:青霉、曲霉
大型真菌：如蘑菇、灵芝等
b:真菌


②真核类
SARS病毒、 禽流感病毒、
是由一个核酸分子（DNA或RNA）与蛋白质构成的非细胞形态的营寄生生活的生命体。
③病毒
课题1 微生物的实验室培养
（以培养大肠杆菌为例）
一、提供生长繁殖所需
营养和环境条件
二、防止杂菌污染
配制培养基
进行无菌操作
在实验室中培养纯净的微生物,培养关键？

一、基础知识分析

（一）培养基
——指微生物生存的环境和营养物质
1.基本成分：
思考：微生物“吃”什么？
水、碳源、氮源、无机盐

无机碳源：
有机碳源：
CO2、CO32-、HCO3-
牛肉膏、蛋白胨等
自养微生物
异养微生物
凡能为微生物代谢提供碳元素的物质。
①参与合成有机物
②异养微生物的能源物质
⑴.概念：
⑵.来源：
⑶.作用：
碳源
凡能为微生物代谢提供氮元素的物质。
主要用于合成蛋白质、核酸及含N的代谢产物。
氮源
⑴.概念：
⑵.来源：
⑶.作用：
水：是生命活动所必需的，生物体内含量最多的化合物
无机盐：为微生物提供除碳、氮以外的元素

无机氮源：
有机氮源：
NH4＋、N2、NO3-（为硝化细菌提供N源和能源）
牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素、氨基酸等
注：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的
碳源、氮源、能源。
⑶.常见的生长因子：
⑴.概念：
⑵.作用：
微生物生长不可缺少的微量有机物。
酶和核酸的组成成分。
维生素、氨基酸、碱基等。
有时会加一定量的氯化钠以维持一定的渗透压
2.特殊营养（生长因子）：
3.pH、氧气、渗透压的需求：
营养
物质 定义 作用 主要来源
碳源 凡能提供所需碳元素的物质 构成生物体的细胞物质和一些代谢产物，有些是异养生物的能源物质 无机化合物：CO2、NaHCO3等；有机化合物：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等
氮源 凡能提供所需氮元素的物质 合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物 无机化合物：N2、NH3、铵盐、硝酸盐等；有机化合物：尿素、牛肉膏、蛋白胨等
水 在生物体内含量很高 不仅是优良的溶剂而且可维持生物大分子结构的稳定 外界摄入
无机盐 为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素，包括大量元素 细胞内的组成成分，生理调节物质，某些化能自养菌的能源，酶的激活剂 无机化合物
生长因子 生长必不可少的微量有机物 酶和核酸的组成成分 维生素、氨基酸、碱基等
配制原则
⑴目的要明确：
⑵营养全面、浓度适宜、比例恰当
⑶适宜的pH值：
有机碳源
异养型：
根据微生物的种类、培养目的选择原料
自养型：
不加碳源
细菌偏碱，真菌偏酸
（CO2碳源）


生产
科研
（为维持相对恒定，可在培养基中加入缓冲剂）
细菌：6.5～7.5；放线菌：7.0～8.5；真菌：5.0～6.0
划分标准 培养基种类 特点 用途
物理性质


化学成分 天然培养基
合成培养基
功能
鉴别培养基
4.培养基的种类
不加凝固剂
加凝固剂，如琼脂

工业生产
观察微生物的运动、分类鉴定
微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种
含化学成分不明确的天然物质
工业生产
培养基成分明确
分类、鉴定
在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长
培养、分离出特定微生物
在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物
鉴别不同种类微生物
选择培养基
液体培养基
半固体培养基
固体培养基
加入琼脂较少
加入琼脂较多
固体培养基：菌落
液体培养基：
表面生长
均匀混浊生长
沉淀生长
半固体培养基：
无动力 有动力(弥散)


(是否运动)
选择培养基的应用
加入青霉素的培养基——分离酵母菌、霉菌等真菌
加入高浓度食盐的培养基——分离金黄色葡萄球菌
不加氮源的无氮培养基——分离固氮菌
不加含碳有机物的无碳培养基——分离自养型微生物
鉴别培养基的应用
伊红美蓝培养基——鉴别大肠杆菌
大肠杆菌在伊红美蓝培养基上典型特征：
紫黑色，并带有金属光泽
牛肉膏蛋白胨培养基 是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。
1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方
H2O 定容至1000ml
Nacl 5g
蛋白胨 10g
牛肉膏 5g
琼脂20.0g








分析营养构成？
碳源、氮源、磷酸盐和维生素
碳源、氮源和维生素
无机盐
氢元素、氧元素
1. 概念
无菌技术又称无菌操作，是指通过一定的物理、化学方法，防止实验室培养物被外来微生物污染，保持微生物的纯净培养的技术。
范围：
①实验操作空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。
④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
②用于培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。
③实验操作应在酒精灯火焰附近进行。
无菌操作的目的是：防止外来杂菌的入侵

（二）无菌技术
2.消毒与灭菌：
原理：使蛋白质变性来抑制微生物的生命活动或杀死微生物
是微生物有关工作中最普通也是
最重要的技术。
消毒：用温和的化学或物理方法，杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢、孢子）的过程。
灭菌：以强烈的理化因素杀死物体内外所有微生物（包括芽孢、孢子） ，达到完全无菌的过程。
(二)、无菌技术：
防止外来杂菌的污染

芽孢
有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。
芽孢壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。

孢子
细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的无性生殖细胞。能直接发育成新个体。
①煮沸消毒法：100℃煮沸5-6min。
②巴氏消毒法：70-75℃下煮30min 或 80℃下煮15min。
（适用于牛奶、啤酒、红酒、酱油等不耐高温的液体）
消毒的方法：
常用的消毒与灭菌的方法
③化学药剂消毒法：
用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源
④紫外线消毒：
对实验室空气消毒
接种室，接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线照射30min，以杀死物体表面或空气中 微生物。在照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液可以加强消毒效果。

微生物的接种工具 (接种环、接种针等；接种过程中试管口或瓶口也可以灼烧灭菌。
灭菌的方法
?灼烧灭菌：
?干热灭菌
耐高温需保持干燥的物品璃器皿
（吸管、培养皿)和金属用具

160～170℃ 1～2小时
100kPa 121℃
15-30min

?高压蒸汽灭菌：
最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。
培养基、无菌水及多种器材物品均可用此法。
2.消毒与灭菌：
(二)、无菌技术：
防止外来杂菌的污染
消毒 灭菌
定义
方法
较为温和理化方法，
杀死部分微生物
（不包括芽孢、孢子）
强烈的理化方法，
杀死所有微生物
（包括芽孢、孢子）
①煮沸消毒法：
②巴氏消毒法：
③化学药剂消毒法：
④紫外线消毒
?灼烧灭菌
?干热灭菌
?高压蒸汽灭菌
1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？
2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。
（1）培养细菌用的培养基与培养皿：
（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管：
（3）实验操作者的双手：
有效避免操作者自身被微生物感染。
旁栏思考：
灭菌
灭菌
消毒
3.使用后的培养基丢弃前应怎样处理？
使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。
（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
（二）纯化大肠杆菌
大肠杆菌

二、实验操作——大肠杆菌的纯化培养
（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
牛肉膏蛋白胨固体培养基配方
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
将上述物质溶解后，添加水，定容至1000mL
配制培养基的操作步骤为:
计算→称量→溶化并调pH→灭菌→倒平板→无菌检查
1.计算：
2.称量：
依配方计算100mL培养基所需各成分的用量
玻棒挑取牛肉膏于称量纸上称取。
牛肉膏：0.5g 蛋白胨：1.0g、NaCl：0.5g琼脂：2.0g
电子天平
注意：称取牛肉膏和蛋白胨时动作要迅速，称后要及时盖上瓶盖
防止吸收空气中水分


3.溶化并调PH：
牛肉膏、称量纸 、少量水加入烧杯→加热溶解→取纸→蛋白胨、NaCl→搅拌溶解→→琼脂→搅拌熔化→调pH并补水至100mL
牛肉膏黏稠，保证粘附在称量纸上的牛肉膏也溶于水中，减少误差


作为凝固剂

防止琼脂糊底而导致烧杯破裂
培养基装入锥形瓶，加棉塞，包牛皮纸扎紧，高压蒸汽灭菌；

防止污染和挥发

灭菌时避免水蒸气浸湿棉塞，取出培养基时，也起到隔绝空气中杂菌的作用
4.灭菌：
培养皿5～8套作一包，放于干热灭菌箱内灭菌。
1）
2）
3）
4）
2）右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰。
3）用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基(约10～20mL)倒入培养皿，左手立即盖上皿盖。
4）等待平板冷却凝固（约需5～10min）。然后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。
1）将培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拨出棉塞。
倒平板注意事项：
①温度：50℃左右
②操作：在酒精灯火焰附近
③冷凝后平板倒置
防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染
灼烧灭菌，
防止瓶口的微生物污染培养基
6.无菌检查：
37℃的恒温箱中培养12h～24h ，无杂菌污染才可用来接种.
培养基灭菌后，需冷却到什么时候，才能用来倒平板？
约50℃
为什么这样操作？
为什么平板需倒置？
5.倒平板：
用手触摸锥形瓶，感觉刚刚不烫手时。
2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
讨论
1.培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时，才能用来倒平板,为什么?你用什么办法来估计培养基的温度？
原因：温度过高，太烫，不易操作；温度过低，培养基易凝固。
4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
最好不要用。因为空气中的微生物可能在此滋生。
3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠。将平板倒置，既可以防止培养基表面的水分过快挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
5.如何检验制备的培养基灭菌是否合格？
如果未接种的培养基在恒温箱中保温1—2天，无菌落生长，说明培养基的制备成功；否则需要重新制备。
单个细胞
单个菌落
从混杂的微生物群体中获得只含某一种微生物的过程。
何为分离纯化？
如何纯化？

什么是菌落？
微生物群

分散或稀释
（二）纯化大肠杆菌
◇原理：
在培养基上，将细菌分散或稀释成单个细胞，使其长成单个菌落。
2.特征：
大小、形状、光泽度、
颜色、透明度等。
3.功能：
1.定义：
菌 落
菌落是鉴定菌种的重要依据（微生物的菌落特征因种而异）
单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。

大小、形状、光泽度、
颜色、透明度等。
平板划线法
如何分散成单个细胞？
稀释涂布平板法

1.微生物的接种方法
（纯化方法）
纯化大肠杆菌的方法：平板划线法和稀释涂布平板法
（二）纯化大肠杆菌
单个细胞
单个菌落

微生物群

分散或稀释
（二）纯化大肠杆菌
◇原理：
◇方法：平板划线法和稀释涂布平板法
（1）平板划线法
通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体称菌落。
























分区划线法
连续划线法
聚集的菌群
连续划线
稀释分散
单个细胞
单个菌落
生长繁殖


“平板划线”实验操作
1、将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。
2、在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞
3、将试管口通过火焰
.4、将已冷却的接种环伸入菌液中，蘸取一环菌液
.5、将试管通过火焰，并塞上棉塞
6左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基
7灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连
8、将平板倒置放入培养箱中培养。





1）一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；
2）存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。
？
划3个平板（重复实验）1个不划线（空白对照）
平板划线操作

区域一
区域二
区域三
区域四
区域五
菌种多
菌种少
菌种减少
菌种减少
菌种减少
菌种最少
思考：平板划线操作的整个过程，是如何实现纯化大肠杆菌的？
注意：平板划线法的要点：
2、接种前，每次划线前及接种后都要灼烧接种环
3、接种环灼烧后等其冷却后再进行划线
4、第二次及其之后的划线操作，总是从上一次划线的末端开始划线
1、接种环只蘸一次菌液
3个划线平板
1个不划线平板
（重复实验：避免偶然因素对实验结果造成影响）
（空白对照）
培养：倒置培养（在培养基皿底标注菌种及接种日期等信息）
放入37℃恒温箱中培养12h～24h

1、为什么在操作的第一步要灼烧接种环？每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
①避免接种环上可能存在的微生物污染培养物
②杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。
③划线结束时灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
讨论
2、在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？

避免接种环温度太高，杀死菌种
3、在做第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面,进行培养。

在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落

注：如果在接种的培养基上生长的菌落颜色、形状、大小基本一致，说明接种操作是符合要求的.
（2）稀释涂布平板法：
①系列稀释操作：
②涂布平板操作：
聚集的微生物
单个细胞
单个菌落
操作：
稀释涂布平板法
涂布器
1、将分别盛有9ml水的6支试管灭菌，并按101～106顺序编号。
2、用移液管吸取1ml菌液，注入101倍稀释的试管中，吹吸三次，使菌液与水充分混匀。依次类推，直至完成最后一支试管的稀释P19页。
注意：移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管应在离火焰1 ∽2cm处。
①系列梯度稀释操作
101
102
103
104
105
106
微量移液器
稀释倍数随菌液浓度而定
②涂布平板操作：
1、将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
滴
2、取少量稀释液（不超过0.1ml ），滴加到培养基表面
灼
3、将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8-10s。
涂
4、用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀
各梯度分别涂布3个平板
1个不涂布作空白对照
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
放入37℃恒温箱中培养12h～24h

培养：
放入37℃恒温箱中培养

（重复实验：避免偶然因素对实验结果造成影响）
稀释涂布平板法的要点
1、用移液管吸取菌液之前先摇匀
3、所有操作都应在火焰附近进行
2、涂布器从酒精中取出后，要在火焰上将其上的酒精烧掉
涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？
应从操作的各个细节保证“无菌”。
例如：酒精灯与培养皿的距离要合适、
吸管头不要接触任何其他物体、
吸管要在酒精灯火焰周围等等。
讨论
比较纯化微生物的接种方法：
比较 平板划线法 稀释涂布平板法
关键操作
优点
缺点
适用范围
接种环在固体培养基表面连续划线
①梯度稀释菌液：
②涂布平板：
可以观察菌落特征，
对混合菌进行分离
可以观察菌落特征，
可以计数
不能计数
较麻烦，平板不干燥效果不好
好氧菌
厌氧菌
兼性厌氧菌
三、课题成果评价
（一）培养基的制作是否合格
如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。
（二）接种操作是否符合无菌要求
如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。
（三）是否进行了及时细致的观察与记录
培养12 h与24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯。
临时保藏：
接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4℃冰箱保存。以后每3-6个月都要将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基。

使用范围：频繁使用的菌种
缺点：保存的时间不长，菌种容易被污染或产生变异。
四、课题延伸（菌种的保藏）
搁置斜面
长期保存：甘油管藏法
使用范围：需长期保存的菌种
在3ml的甘油瓶中，装入1ml甘油后灭菌。将1ml培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在—20摄氏度的冷冻箱保存。
（1ml甘油（灭菌）＋1ml菌液）
菌种的保藏：
搁置斜面

















临时保藏法
甘油管藏法
适用对象
培养基类型

温度
频繁使用的菌种
（易污染或变异）

长期保存的菌种
固体斜面培养基
液体培养基
4℃冰箱
-20℃的冷冻箱
微生物的培养

基础
知识

实验操作
结果分析与评价
培养基

定义：
分类：
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配置出供其生长繁殖的营养物质
固体培养基
液体培养基

无菌技术
培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法

定义：
消毒与灭菌
常用灭菌方法
制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
纯化大肠杆菌
课堂小结
1、有关微生物营养物质的叙述中，正确的是（ ）
A.是碳源的物质不可能同时是氮源
B.凡碳源都提供能量
C.除水以外的无机物只提供无机盐
D.无机氮源也能提供能量
D
学以致用
营养类型 能源 氢的供体 基本碳源 微生物举例




代谢类型
光能无机营养(光能自养型)
光能有机营养(光能异养型)
化能无机营养(化能自养型)
化能有机营养(化能异养型)
光
光
无机物
有机物
无机物
有机物
无机物
有机物
二氧化碳
二氧化碳及简单有机物
二氧化碳
有机物
大多数已知细菌和全部真核微生物
硝化细菌
氢细菌
紫色非硫细菌
蓝细菌
绿色硫细菌
藻类
2、下图甲、乙是微生物接种常用的两种方法，请回答相关问题：





(1)图甲是利用________法进行微生物接种，图乙是利用________________法进行微生物接种。这两种方法所用的接种工具分别是________和________；对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是________和酒精消毒。
平板划线
稀释涂布平板
接种环
涂布器
灼烧灭菌
(2)接种操作为什么一定要在火焰附近进行？
_____________________________
(3)接种后，在固体培养基上培养细菌时为什么进行倒置培养？
_________________________________________。
(4)如图是采用上述接种方法接种后培养的效果图解，其接种方法是________(填图甲或图乙)。
火焰附近存在着无菌区域。
避免培养过程产生的水分影响微生物的生长
图乙