2020年春季学期高中生物人教选修1同步课件：5．3 血红蛋白的提取和分离（共49张PPT）

(共49张PPT)
专题五 NDA和蛋白质技术
课题三 血红蛋白的提取和分离
1.说出从血液中初步获取血红蛋白的原理和方法；
2.说明凝胶色谱法的原理和方法；
3.说出电泳的基本原理和方法；
4.运用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离纯化。
导入新课
蛋白质是生命活动不可缺少的
物质。随着人类基因组计划的
进展以及多种生物基因组测序工作的完成，人类跨入了后基因组和蛋白质组时代。对蛋白质的研究与应用，首先需要获得纯度较高的蛋白质。因此，从复杂的细胞混合物中提取、分离高纯度的蛋白质是生物科学研究中经常要做的工作。
血红蛋白
含量
组成元素
分子质量
基本单位
氨基酸连接方式
细胞中含量最多的有机物
C、H、O、N等
高分子化合物，分子量很大
氨基酸
结构通式：
种类：20种
脱水缩合
一个氨基酸的氨基（—NH2）和另一个氨基酸的羧基（—COOH）相结合，同时脱去一分子H2O
钛键
分子结构
蛋白质结构的多样性
①氨基酸的种类不同；②数目成百上千；
③排列顺序变化多端；④多肽链的空间结构千差万别
蛋白质功能的多样性
运输、调节、免疫、催化等，生命活动的承担着
（一）蛋白质提取与分离的依据－－

蛋白质的物理化学性质差异
1.分子的形状、大小
2.电荷性质和多少
3.溶解度
4.吸附性质
5.对其他分子亲和力
根据相对分子质量的大小分离蛋白质
根据分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同分离蛋白质
1.凝胶色谱法
（1）材料：凝胶
微小的多孔性球体，如葡聚糖或琼脂糖。内部有许多贯穿的通道。
方法 原理
凝胶色谱法
电泳法
（2）原理：
小蛋白质
大蛋白质
混合物
上柱
洗
脱
大分子流动快
小分子流动慢
收集
大分子
收集
小分子
当不同的蛋白质通过凝胶时
相对分子质量较小
相对分子质量较大
凝胶内部的通道
容易进入
无法进入凝胶内部的通道
只能在凝胶外部移动
路程较长
移动速度较慢
路程较短
移动速度较快
相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离
2.缓冲溶液
(1)概念：
在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的溶液。
(2)作用：
能够抵制外界的酸或碱的对溶液的pH的影响，维持pH基本不变。
(3)配制：通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。
(4)本实验使用的是磷酸缓冲液(NaH2PO4 /Na2HPO4 ),目的是利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和科学研究（活性）。
由弱酸和相应的强碱弱酸盐溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等。
3.电泳法
（1）概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。
（2）原理：
分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
（3）类型：
由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子在电场中迁移速度决定于所带电荷性质的差异及分子的大小、形状的不同
在凝胶中加入SDS，使蛋白质解聚成单链，与各种蛋白质形成蛋白质－SDS复合物，使其迁移速度完全取决于分子的大小
琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳

1.洗涤红细胞
血液
100mL
重复洗涤3次，直至上清液没有黄色
（一）样品处理
2.释放血红蛋白
洗涤好的红细胞导入烧杯
加蒸馏水到原血样体积
加40 ﹪体积苯
充分搅拌10分钟
3.分离血红蛋白
红细胞
混合液
滤纸
过滤
脂类物质
有机溶剂
血红蛋白
烧杯
(4)透 析：
①过程：
取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。
②目的：
除去样品中分子量较小的杂质。
（二）凝胶色谱操作
1.凝胶色谱柱的制作
2.凝胶色谱柱的装填
3.样品的加入和洗脱
1.凝胶色谱柱的制作
打孔→挖穴→安管→覆网→纱包→插管

2.凝胶色谱柱的装填
50cm高
固定色谱柱－配凝胶悬液－装填色谱柱－洗涤平衡
沸水浴加热
紧密 不得有气泡
磷酸缓冲液
(pH为7.0）
①凝胶的选择：
A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）
②凝胶的前处理：
配置凝胶悬浮液：
计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。
凝胶色谱柱的装填
③凝胶色谱柱的装填方法：
A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。
B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱 内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。
C、洗涤：用300ml缓冲液充分洗涤12h
注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在。因为空隙或气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。
①加样前
打开下端出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。
样品的加入与洗脱
注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面2、贴壁加样 3、使吸管管口沿管壁环绕移动
②加透析样品
样品渗入凝胶床
加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内。等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。
洗脱和收集
小心加入物质的量浓度为20mmol／L的磷酸缓冲液(pH为7.0)到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。
待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）。
血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。
你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？
操作提示
红细胞的洗涤
色谱柱填料的处理
凝胶色谱柱的装填
蛋白质的分离
观察你处理的血液样品离心后是否分层，如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。
1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？
2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？
由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。
如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。
3、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？
3.样品的加入和洗脱
1.调液面
2.加样
3.再调液面
4.洗脱
5.收集
红色区带均匀一致地移动。
1.红细胞的洗涤：
洗涤次数不能过少；低速、短时离心。
2.色谱柱的装填：
装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。
3.凝胶的预处理：
沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡。
4. 色谱柱成功标志：
1.血液样品的处理
分层明显→样品处理完成
2.凝胶色谱柱的装填
放一支与凝胶柱垂直的日光灯?直接检查加入大分子有色物质如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，若色带均匀、狭窄、平整→装填成功。
3.血红蛋白的分离
血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随洗脱液缓慢流出，分离成功。
1.以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确的是（ ）
A．洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂
B．猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少
C．血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测
D．在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢
D
【方法点拨】
1.血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。
2.血红蛋白的分子量比杂蛋白大，质量越大的，通过凝胶色谱柱的速度越快。
A
2.蛋白质的分离与提纯技术是蛋白质研究的重要技术，下列有关叙述不正确的( )
A．根据蛋白质分子不能通过半透膜的特性，可将样品中各种不同蛋白质分离
B．根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小，可通过电泳分离蛋白质
C．根据蛋白质相对分子质量的大小，可通过凝胶色谱法分离蛋白质
D．根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法分离蛋白质
【方法点拨】
蛋白质分子不能通过半透膜，但溶液中的小分子物质则可以透过半透膜，因此可以将蛋白质和溶液中的小分子物质分离。
3.下列关于DNA粗提取实验和血红蛋白的提取实验,叙述正确的是(　　)
A.前者选择鸡血细胞作为实验材料较好,后者选择哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料较好
B.样品预处理时,前者静置1天处理除去上清液;后者需要加入清水,反复低速短时间离心洗涤,至上清液无黄色
C.在DNA粗提取实验中,往2 mol/L氯化钠溶液中加入蒸馏水析出DNA时,应该缓慢加入,直到出现黏稠物即止
D.洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐等
A
1.提取血红蛋白的实验中,洗涤红细胞时,不能加清水,应该加入生理盐水,否则细胞会提早释放出血红蛋白与杂质混合,加大提取难度。
【方法点拨】
2.洗涤红细胞的目的是去除杂质蛋白,以利于血红蛋白的分离和纯化。
血红蛋白的提取和分离
【课堂小结】
1.以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确的是(　　)
A．洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂
B．猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂
蛋白较少
C．血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测
D．在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小
的杂蛋白移动慢
【解析】　洗涤红细胞时，洗涤的目的是去除杂蛋白以利于后续步骤的分离纯化，加入的是生理盐水，可防止红细胞破裂，A正确；哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核与众多的细胞器，提纯时杂蛋白较少，B正确；血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液，C正确；在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白的分子量比杂蛋白大，质量越大的，通过凝胶色谱柱的速度越快，D错误。
【答案】　D
2.将处理破裂后的红细胞混合液以2000 r/min的速度离心10 min后，离心管中的溶液分为四层，从上到下的顺序依次是(　　)
A．血红蛋白、甲苯层、脂质物质层、细胞破碎物沉淀层
B．甲苯层、细胞破碎物沉淀层、血红蛋白、脂质物质层
C．脂质物质层、血红蛋白、甲苯层、细胞破碎物沉淀层
D．甲苯层、脂质物质层、血红蛋白、细胞破碎物沉淀层
【解析】　将处理破裂后的红细胞混合液以2000 r/min的速度离心10 min后，离心管中的溶液分为四层，从上到下的顺序依次甲苯层、脂质物质层、血红蛋白、细胞破碎物沉淀层，D正确。
【答案】　D
3.在血红蛋白分离过程中如果红色带区歪曲、散乱、变宽，与其有关的是 (　　)
A．凝胶色谱柱的制作
B．色谱柱的装填
C．洗脱过程
D．样品的处理
【解析】　色谱柱装填时不能有气泡的存在，气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，若色谱柱装填得很成功、分离操作也正确，则能清楚的看到红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓缓流出，如果出现红色带区域歪曲、散乱、变宽的现象，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关，B项正确，A、C、D三项均错误。
【答案】　B