人教高中生物选修一5.2多聚酶链式反应扩增DNA片段 课件（25张ppt）

(共25张PPT)
多聚酶链式反应(PCR技术)，
是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为DNA体外扩增技术。
课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段
1、DNA分子的组成成分和结构
DNA 分子的基本组成单位是 .共有 种,每个基本单位是由一分子的 、一分子的 、和一分子的 构成。
脱氧核甘酸
4
磷酸
碱基
脱氧核糖
那么DNA分子的平面结构怎样呢？
二 、基础知识
A
G
C
T
1、DNA的基本单位－脱氧核苷酸
多脱氧核苷酸链结构简图
一个核苷酸上的磷酸基团上的“－OH”和另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成磷酸二脂键，即在相邻的两个脱氧核苷酸的3’和5’碳原子之间形成磷酸二脂键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3’、5’、磷酸二脂键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基“－OH”末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端
4、多脱氧核苷酸链得形成
2、DNA分子的平面结构
5'端
3'端
识别 ：
DNA分子的3′ 端与5′ 端
-OH端为3′ ; 磷酸基团的末端为5′。
2、DNA分子复制的过程
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶 打开DNA双链
DNA母链 提供DNA复制的模板
4种脱氧核苷酸 合成子链的原料
DNA聚合酶 催化合成DNA子链
引物 使DNA聚合酶能够从引物的
3′ 端开始连接脱氧核苷酸
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物（ RNA）
打开DNA双链
模板
合成子链原料
催化子链合成
使DNA聚合酶能从引物3′端开始连接脱氧核苷酸
思考：体内DNA复制的条件是什么？ 体外扩增DNA 如何提供相似环境？
变性（ 80-100℃ ）
Taq聚合酶（耐高温）
20—30个核苷酸构成DNA或RNA
DNA双链
单链
变性（加热80-100℃ ）
复性（缓慢冷却）
4、DNA 分子的热变性原理：
变性的目的：
复性的目的：
解开双链
有利于引物Ⅰ和引物Ⅱ与两条单链的结合
一、PCR的原理（ PCR的技术原理）
时间（min）
温度
（℃）
适温延伸
高温变性
低温复性
重复1~3步30轮
3、DNA复制的方向
DNA的合成方向总是从子链的5’端向3’端延伸
2、步骤：变性 ——复性——延伸
PCR技术的原理总结
利用DNA分子的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解旋与结合，从而完成体外DAN分子的扩增。
体外DNA复制的条件： 四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、引物、 模板；缓冲溶液、严格控制温度的温控设备。
复制的方向：子链的5’端向 3’端延伸。
二、PCR的反应过程
变性95oC
5?
引物1
5?
引物2
5?
5?
模板DNA
25～30 次循环（复制）后，模板DNA的含量可以扩大100万（220）倍以上。
每个循环包括：变性 ——复性——延伸
从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。
PCR的反应过程总结
三、 PCR反应的实验操作
1、PCR仪
设备及用具
2、微量离心管
一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml
3、微量移液器
用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次
实质上一台能够自动调控温度的仪器
三、 PCR反应的实验操作
（1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备）
（2）用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（移液）
（3）盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合）
（4）将微量离心管放在离心机上（离心）
（5）将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序（反应）
循环数 变性 复性 延伸
第一次 94°C,10min － －
30次 ９4℃，30s 55℃，30s 72℃，1min
最后一次 ９4℃，1min 55℃，30s 72℃，1min
四、结果分析与评价
DNA 含量的测定：稀释→对照调零→
测定→计算（公式见P63）
波长260nm处读数
蒸馏水做对照
50倍
（一）理论上DNA扩增数目的计算
四、课题成果评价
1 、一条DNA，复制n次， DNA为2 n
2 、 a条DNA，复制n次， DNA为a x2 n
（二）实验中DNA含量的测定
1 、原理
可以通过测量DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关
2 、过程
①稀释
2?L PCR反应液，加入98?L蒸馏水，即将样品进行50倍稀释
②对照调零
以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零
取DNA稀释液100?L至比色杯中，测定260nm处的光吸收值
③测定并计算
DNA含量（?g/mL）＝50×(260nm的读数)×稀释倍数
50：在厚度为1cm比色杯中的吸光值为1, DNA 的含量为50?g /ml的
体内DNA复制与PCR的技术区别：
体内复制 PCR技术
解旋 在解旋酶作用下，细胞提供ATP，部分解开 加热到94oC,双链全部解开，不需解旋酶
引物 一小段RNA 一般用DNA片段
DNA聚合酶 细胞自身的DNA聚合酶（不耐高温） TaqDNA聚合酶
复制特点 半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。 半保留复制，完全解旋后复制，从模板链的一端开始复制。
复制的方向 子链的5’端向 3’端延伸 子链的5’端向 3’端延伸
课堂小结
练习巩固
1、关于PCR技术的应用，错误的一项是
A 古生物学、刑侦破案、DNA序列测定
B 诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学
C DNA序列测定、基因克隆、刑侦破案‘
D 诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列测定
2、DNA的合成方向总是从子链的哪一端向哪一端延伸？
3、PCR技术最突出的优点是
A 原理简单 B 原料易找
C TaqDNA聚合酶有耐热性
D 快速、高效、灵活、易于操作
从子链的5’端向3’端延伸
4、做PCR使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是
A 反复洗涤 B 不怕外源DNA污染
C 高压灭菌 D 在—20 ℃储存