人教版高中生物选修一2．3分解纤维素的微生物的分离（共36张PPT）

(共36张PPT)
分解纤维素的
微生物的分离
本节课标：
1.简述纤维素酶的种类及作用。
2.学习从土壤中分离出分解纤维素的微生物的方法。
3.谈论这类微生物的应用价值。
基础知识
实验设计
操作提示
结果分析与评价
课题延伸
课题背景
纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，是天然有机高分子化合物：自然界中纤维素含量最高的天然产物是棉花，含量达92％～95％，亚麻达80％，此外木材、作物秸秆也富含纤维素。
许多商品纤维素都是由天然纤维素制得：如水溶性的羧甲基纤维素钠（CMC---Na）；不溶于水的微晶纤维素等食品添加剂。
①纤维素含量
一、基础知识
1、纤维素
葡萄糖
②基本单位
③简式
（C6H10O5)n
④应用
纤维素可用于纺织工业，可造纸
⑤思考：纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过70亿吨，但却不会在地球上大量的积累，为什么？
40～60%能被土壤中的某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶
2、纤维素酶
水解纤维素生成纤维二糖和葡萄糖的一类酶的总称
①定义
②组分
纤维素酶不是单一酶，是复合酶，包括C1酶、CX酶、葡萄糖苷酶。
C1酶：(外切酶)
从糖链的末端开始切掉两个葡萄糖分子，产生纤维二糖。
葡萄糖苷酶：将纤维二糖分解为葡萄糖
CX酶：(内切酶)
作用于糖链的内部使之断裂成糖链片段。
A、人能不能对纤维素消化吸收？为什么？
答：不能，因为人体不能合成纤维素酶。人以淀粉为主要的能量来源。
③思考：
B、食物中的纤维素有什么作用？
答：食物中的膳食纤维可刺激胃肠蠕动和分泌消化液，有助于食物的消化和排泄。
C、反刍动物能利用纤维素吗？为什么？
答：能，在反刍动物的瘤胃中生活着大量可以分解纤维素的微生物，能产生大量的纤维素酶
方法：滤纸崩溃法
3、纤维素酶活性的测定实验：
二、纤维素分解菌的筛选
2、筛选原理：
1、筛选方法：刚果红染色法
刚果红（CR）是一种染料，它可以与象纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应
3、筛选过程：
4、纤维素分解菌的选择培养基和鉴别培养基
①纤维素分解菌的选择培养基
答：液体培养基，因培养基中无凝固剂，利用液体培养基培养以增加纤维素分解菌的浓度
B、培养基具有选择作用的原因
答：能够产生纤维素酶的微生物才能分解纤维素作为碳源和能源，并大量繁殖；不能分解纤维素的微生物由于缺乏碳源受到抑制而不能正常生长繁殖，因此培养基具有选择作用
A、物理性质上看选择培养基的类型及原因
思考：
C、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用？
答：用牛肉膏蛋白胨培养基与其对照
D、为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？
答：在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速的繁殖。而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到浓缩的作用。
②纤维素分解菌的鉴别培养基
纤维素分解菌的选择培养中，碳源为纤维素。能够生长纤维素酶、水解纤维素的细菌大量增殖，而不能利用纤维素为碳源的微生物的生长受抑制。经过一次培养后，再取少量的培养液转移到新鲜的培养液中重新培养，该过程经数次培养后能利用纤维素为碳源的微生物比例在培养液中将大大提高，将培养液涂布在以纤维素为唯一碳源的鉴别培养基的琼脂板上，得到的微生物菌落大部分是纤维素分解菌，此种方法为富集培养
三、实验设计
1、实验流程
①分布环境
（1）土壤取样：
富含纤维素的环境中
2、操作步骤
由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。
②原因
③实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等。
④讨论:如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？
答：将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约10cm左右的土壤中。
（2）选择培养
①目的：增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离所需要的微生物
②操作：称取土样20
g，在无菌条件下加入装有30
mL培养基的摇瓶中。将摇瓶置于摇床上，在30
℃下振荡培养1～2
d，至培养基变混浊。吸取一定的培养液（约5
mL），转移至另一瓶新鲜的选择培养基中，以同样的方法培养到培养液变浑浊。
（3）梯度稀释：
吸取上清液1
mL富集后的培养液，注入盛有9
mL的无菌水的无菌大试管中，充分混匀；然后再用一只1
mL无菌吸管从此试管中吸取1
mL注入另一盛有9
mL无菌水的试管中，依次等比稀释至106稀释度。
（4）涂布培养
将鉴别培养基平板和不含纤维素的培养基平板分别标号，分别将稀释度为106～104的菌悬液各取0.1mL，对号滴加到鉴别培养基平板和不含纤维素的培养基平板上，并用涂布器均匀涂布。将培养基平板于300C倒置培养,至菌落长出。每个稀释度下需涂布3个平板
1、刚果红染色法:
（5）筛选菌株：
常用的刚果红染色法有两种，一种是先培养微生物，再加入刚果红进行染色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红
方法一：在长出菌落的培养基上，覆盖质量浓度为1mg/ml的CR溶液，10～15分钟后，倒去CR溶液，加入物质量浓度为1mol/L的NaCL溶液，15分钟后倒掉NaCL溶液，此时，产生纤维素酶的菌落周围就会出现透明圈。
①方法
方法二：配制质量浓度为10mg/mL的CR溶液，灭菌后，按照每200mL培养基加入1mL的比例加入CR溶液，混匀后倒平板。等培养基上长出菌落后，产生纤维素酶的菌落周围将会出现明显的透明圈
②试验结果
实验组：
经刚果红染色法，菌落周围将会出现明显的透明圈
对照组：
不含纤维素的培养基经刚果红染色法，菌落周围不出现明显透明圈
③讨论：这两种方法各有哪些优点与不足？
答：方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。
方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂的问题，缺点是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应，但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊，因为培养基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分。
在产生明显的透明圈的菌落，挑取并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在300C－
370C培养，可获得纯培养。
方法二的另一缺点是：有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间的培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。
2、挑菌
四、课题延伸
本课题对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选。但是这还只是分离纯化的第一步为确定得到是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。
1、固体发酵：指微生物在没有或几乎没有游离水的固态的湿培养基上发酵的过程。
例：农村的堆肥、青饲料和做酒曲。
2、液体发酵：呈液体的微生物发酵过程。
现代微生物工业多为液体发酵，因适用面广，可精确调控、效率高、可机械化和自动化。
3、纤维素酶的测定
一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定
4、葡萄糖的测定
葡萄糖分子结构中含有还原性基团，可与斐林试剂发生作用，生成砖红色沉淀。
请用流程图总结出分离微生物的一般方法：
土壤取样
选择培养（此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定）
梯度稀释
将样品涂布到有特定选择作用的培养基上
挑选单菌落
发酵培养