2．3分解纤维素的微生物的分离（共29张PPT）

(共29张PPT)
1.纤维素
纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。
植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。其中棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。
一、基础知识
(一）纤维素与纤维素酶
纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%-60%能被土壤中能产生纤维素酶的微生物所利用，不会大量积累。
在草食性动物等的消化道内，也共生有分解纤维素的微生物，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素的能力。
人类可应用分解纤维素的微生物将秸秆等废弃物转变成酒精，用纤维素酶处理服装面料等。
纤维素酶
(一）纤维素与纤维素酶
纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即
，前两种酶使纤维素分解成
，第三种酶将纤维二糖分解成
。
C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶
纤维二糖
葡萄糖
①取二支20mL的试管
实验：纤维素酶分解纤维素的实验
②各加入一张滤纸条
③各加入pH4.8，物质量为0.1mol/L的醋酸－醋酸钠缓冲液11ml和10ml
④在乙试管中加入1mL纤维素酶
⑤两支试管固定在锥形瓶中，放在
140r/min的摇床上振荡1h
⑥结果：
乙试管的滤纸条消失
乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？
纤维素酶分解
对照
本实验的自变量是:
纤维素酶的有无
刚果红染色法
刚果红能与纤维素形成
色复合物，而不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。
（二）纤维素分解菌的筛选
当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红-纤维素的复合物就无法形成，培养基中就会出现
，这样我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
红
以纤维素分解菌为中心的透明圈
二、实
验
设
计
请你根据实验流程图和提供的三个资料以及“操作提示”，在思考有关问题的基础上，设计出一个详细的实验方案。
本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？
课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。
本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在刚果红鉴别培养基上。其他步骤基本一致。
①分布环境
1、土壤取样：
富含纤维素的环境中
操作步骤
在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。
为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？
如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？
将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约10cm左右的土壤中。
2、选择培养
增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。
①目的：
②制备选择培养基：
③操作：
将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养1～2天，直至培养液变浑浊。可重复选择培养。
培养基组成
提供主要的营养物质
纤维素粉
5g
碳源（能源）
NaNO3
1g
氮源、无机盐
KCl
0.5g
Na2HPO4.7H2O
1.2g
KH2PO4
0.9g
MgSO4
.7H2O
0.5g
无机盐
酵母膏
0.5g
生长因子、碳源、氮源
水解酵素
0.5g
氮素、生长因子
溶解后，蒸馏水定容至1000mL
水
自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,或者将纤维素改为葡萄糖。
A、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？
是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）
B、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？
有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能分解纤维素的微生物可以大量繁殖。
C、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用
在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。
为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？
按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释101～107倍。
3.梯度稀释
4.将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养
基上
（1）制备鉴别培养基:
（2）涂布平板：
将稀释度为104～106的菌悬液各取0.1ml涂布到平板培养基上，30℃倒置培养。
鉴别纤维素分解菌的培养基
(水溶性羧甲基纤维素钠)
碳源
碳源、氮源、生长因子
无机盐
碳源、生长因子
凝固剂
氢元素、氧元素
从物理状态分，属于什么培养基？
固体培养基
培养基组成
提供的主要营养物质
CMC-Na
5~10g
酵母膏
1g
KH2PO4
0.25g
土豆汁
100mL
琼脂
15g
上述物质溶解后，加蒸馏水定容1000mL
方法一：先
，再加入刚果红进行颜色反应。
培养微生物
倒平板
5.刚果红染色法
挑选产生
的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。
透明圈
方法二：在
时就加入刚果红。
NaCl溶液的作用？
漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。
这两种方法各有哪些优点与不足？
颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用
操作繁琐，刚果红会使菌落之间发生混杂
操作简便不存在菌落混杂问题
有些微生物长时间培养能降解色素，形成明显的透明圈。
染色法
优点
缺点
方法一
方法二
为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行_____________
实验，纤维素酶的发酵方法有______
发酵和______
发酵。纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的________
含量进行定量测定。
发酵产纤维素酶
液体
固体
葡萄糖
五、课题延伸
学完这个专题后,你能否总结出分离培养微生物的一般方法?请用流程图表示.
土壤取样
选择培养
梯度稀释
将菌液涂布到选择或鉴定作用的培养基上
挑选单菌落
发酵培养
分解纤维素的微生物的分离
纤维素酶
种类、作用、催化活力
刚果红染色
筛选原理
实验设计
土壤取样
选择培养
前置染色法
后置染色法
富含纤维素土壤
增大分解菌含量
染色鉴别
分离出分解菌
课堂总结
四、结果分析与评价
1.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落
对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。
如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。
2.分离的结果是否一致
由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。
在细菌分解尿素的化学反应
中，细菌合成的脲酶将尿素
分解成了氨，氨会使培养基
的碱性增强，pH升高。在培
养基中加入酚红指示剂，如
果pH升高指示剂会变红
刚果红可以与纤维素形成
红色复合物，当纤维素被
纤维素酶催化分解后红色
复合物无法形成，培养基
上就会出现以纤维素分解
菌为中心的透明圈
观察菌落周围是否有着色的
环带出现来鉴定尿素分解菌
观察菌落周围是否出现
透明圈来筛选纤维素分解菌
脲酶检测法
刚果红染色法
比较
项目
分解尿素的细菌
纤维素分解菌
选
择
培养
原理
培养基类型
目的
鉴
定
培养基
原理
现象
方法
C1酶：外切酶，从糖链末端开始切掉两个葡萄糖
分子，产生纤维二糖
CX酶：内切酶，使纤维素断裂成片断。
葡萄糖苷酶：将纤维二糖分解成葡萄糖。
说明：分析“纤维素分解菌的选择培养基配方”可知，该配方中的酵母膏也能够提供少量的碳源，因此其他微生物也能在该培养基中生长繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，因此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。
1.产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈
2.
在产生明显的透明圈的菌落，挑取并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在300C－
370C培养，可纯化。
6、纯化培养