高中生物人教版选修1专题5.2 多聚酶链式反应扩增DNA片段 课件 （32张PPT）

(共32张PPT)
资料一：刑侦破案杀手锏——法医DNA鉴定技术，需要用到大量凶手DNA。
资料二：肝炎病毒感染初期症状并不明显，抽取的血液中病毒含量也很少，在检测技术比较落后的时期常常造成误诊。
资料三：新型冠状病毒(2019-nCoV)抗体检测、新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸检测。新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测试剂盒是用于快速进行体外定性检测新型冠状病毒(RdRp基因、N基因、E基因)的医疗检测用品。它的工作原理是通过提取病人样本中的RNA，进行反转录聚合酶链反应(RT-PCR)，通过扩增反应将样本中微量的病毒信息进行放大，最后以荧光的方式读取信号。如果PCR之后信号为阳性，那么就可以认为样本中存在病毒(已经感染)，反之表明样本中没有病毒(未感染)。
资料四：在刑事侦破案件或遗传病的诊断过程中常需要对样品DNA进行分析，PCR技术能快速扩增DNA片段，在几个小时内复制出上百万份的DNA拷贝，有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。现在PCR技术已广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和基因测序。
专题5
DNA和蛋白质技术
课题2
多聚酶链式反应扩增DNA片段
华师附中汕尾学校
杨宇涛
一、基础知识
（一）PCR原理
1.多聚酶链式反应（PCR）：一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝。
2.细胞内的DNA复制（回顾）
①DNA的基本单位：脱氧核糖核苷酸
②DNA分子的结构：
含氮碱基
磷酸
5
脱氧
核糖
O
1
2
3
4
5
DNA的羟基(-OH)末端称为3'端，而磷酸基团的末端称为5'端。
3'
3'
5'
5'
一、基础知识
（一）PCR原理
2.细胞内的DNA复制（回顾）
①DNA的基本单位：脱氧核糖核苷酸
②DNA分子的结构：（两条链）反向平行，双螺旋结构
③DNA复制的时间：发生在有丝分裂的间期和减数第一次分裂间期
④DNA复制的场所：细胞核（主要）、线粒体、叶绿体
⑤DNA复制的特点：边解旋边复制、半保留复制、多起点复制
一、基础知识
（一）PCR原理
2.细胞内的DNA复制（回顾）
⑥DNA复制的条件
参与的组分
在DNA复制中的作用
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成子链的原料
催化合成DNA子链
工作需要消耗ATP
催化脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键
不能从头开始合成，只能从3'端延伸DNA链
子链只从引物3'端开始延伸；
子链的合成方向总是5’端向
3’端。
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
作为DNA复制的起点
一、基础知识
（一）PCR原理
3.PCR(体外的DNA复制)的条件
①DNA分子的热变性原理
在80-100
℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链重新结合成双链，这个过程称为复性。
参与的组分
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
DNA双链
单链
变性（加热80-100℃）
复性（缓慢冷却）
√
√
一、基础知识
（一）PCR原理
3.PCR(体外的DNA复制)的条件
②耐高温的Taq
DNA聚合酶
高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的Taq
DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化。
自然引物（细胞内的DNA复制）：RNA
③引物
人工引物（PCR）：DNA单链（主要）或RNA
分别与两条模板链相结合的两种引物（引物Ⅰ和引物Ⅱ）
参与的组分
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
√
√
√
√
一、基础知识
（一）PCR原理
3.PCR(体外的DNA复制)的条件
①控制温度，但不需解旋酶；
②DNA模板；
③四种脱氧核苷酸；
④耐高温的聚合酶（Taq
DNA聚合酶）；
⑤分别与两条模板链相结合的两种引物（引物Ⅰ和引物Ⅱ）；
⑥需要在一定的缓冲液中进行。
一、基础知识
（二）PCR的反应过程
1.PCR的反应步骤：
一般要经历三十多次循环，每次循环分为变性、复性和延伸三步
2.循环过程
①变性
解旋，94℃
一、基础知识
（二）PCR的反应过程
1.PCR的反应步骤：
一般要经历三十多次循环，每次循环分为变性、复性和延伸三步
2.循环过程
①变性
解旋，94℃
②复性
引物与模板链结合，55℃
不考虑模板链重新结合：
模板DNA比引物复杂的多；
加入引物的量足够多而模板链数量少；
引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。
一、基础知识
（二）PCR的反应过程
1.PCR的反应步骤：
一般要经历三十多次循环，每次循环分为变性、复性和延伸三步
2.循环过程
①变性
解旋，94℃
②复性
引物与模板链结合，55℃
③延伸
DNA新链由5′端向3′端延伸（引物端为新链5'端），72℃（Taq
DNA聚合酶最适温度）
第1个
PCR
循环完成后
：得到两个拷贝的靶序列
靶序列
靶序列
5?
引物Ⅰ
5?
引物Ⅱ
第二次循环
第一次循环
5?
5?
5?
5?
5?
5?
模板DNA
5?
5?
5?
5?
5?
5?
5?
5?
25～30
次循环（复制）后，模板DNA的含量可以扩大100万（220）倍以上。
引物数=新增单链数=2·2n-2
5?
引物Ⅰ
5?
引物Ⅱ
第二次循环
第一次循环
5?
5?
5?
5?
5?
5?
模板DNA
5?
5?
5?
5?
5?
5?
5?
5?
5?
引物Ⅰ
5?
引物Ⅱ
第三次循环
5?
5?
5?
5?
5?
5?
5?
5?
5?
5?
5?
5?
一、基础知识
（二）PCR的反应过程
1.PCR的反应步骤：
一般要经历三十多次循环，每次循环分为变性、复性和延伸三步
2.循环过程
①变性：解旋，94℃
②复性：引物与模板链结合，55℃
③延伸：DNA新链由5′端向3′端延伸，72℃
3.PCR的反应结果
①从第二轮循环开始，前一轮循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸。
②
DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，等长DNA从第三轮循环开始出现，这段固定长度的序列呈指数扩增。
例：PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是（
）
①PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA
②PCR过程不需要DNA聚合酶
③PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的
④PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制
A．③④
B．①②
C．①③
D．②④
C
例：PCR一般要经过三十多次循环，从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时将（
）
A．仍与引物Ⅰ结合进行DNA子链的延伸
B．与引物Ⅱ结合进行DNA子链的延伸
C．同时与引物Ⅰ和引物Ⅱ结合进行子链的延伸
D．无需与引物结合，在酶的作用下从头合成子链
B
解析：当有引物Ⅰ延伸而成的DNA单链做模板时，此单链引物端为5'端，与它互补的子链此端为3'端，因此新子链应从另一端开始合成，即由引物Ⅱ结合延伸DNA的子链。
5?
5?
二、实验操作
（一）设备与用具
1.PCR仪
一台能够自动调控温度的仪器
2.微量离心管
进行PCR反应的场所，一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml
3.微量移液器
用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次
（二）实验操作步骤
二、实验操作
准备
↓
移液
↓
混合
↓
离心
↓
反应
（二）实验操作步骤
二、实验操作
准备
↓
移液
↓
混合
↓
离心
↓
反应
按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上。p62（PCR反应体系的配方）
（二）实验操作步骤
二、实验操作
准备
↓
移液
↓
混合
↓
离心
↓
反应
用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂。
（二）实验操作步骤
二、实验操作
准备
↓
移液
↓
混合
↓
离心
↓
反应
①过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。
②注意：
A.离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢。
B.手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀。
（二）实验操作步骤
二、实验操作
准备
↓
移液
↓
混合
↓
离心
↓
反应
①过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s。
②目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。
（二）实验操作步骤
二、实验操作
准备
↓
移液
↓
混合
↓
离心
↓
反应
将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。
以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率
（二）实验操作步骤
二、实验操作
准备
↓
移液
↓
混合
↓
离心
↓
反应
【注意事项】
避免外源DNA等因素的污染
①隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；
②分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头。
例：在PCR实验操作中，下列说法不正确的是(　　)
A．在微量离心管中添加各种试剂时，只需一个枪头
B．离心管的盖子一定要盖严，防止液体外溢
C．用手轻弹离心管壁的目的是使反应液充分混合
D．离心的目的是使反应液集中在离心管部，提高反应效果
A
三、课题成果评价
（一）理论上DNA扩增数目的计算
1.一条DNA，复制n次，
DNA为2n
2.a条DNA，复制n次，
DNA为a
·2n
三、课题成果评价
（二）实验中DNA含量的测定
1.原理
可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关
2.过程
①稀释：
2?LPCR反应液，加入98?L蒸馏水，即将样品进行50倍稀释
②对照调零：以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零
三、课题成果评价
（二）实验中DNA含量的测定
1.原理
可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关
2.过程
③测定：取DNA稀释液100?L至比色杯中，测定260nm处的光吸收值
④计算：DNA含量（?g/mL）＝50×(260nm的读数)×稀释倍数
50（常数）：1?g
/ml的DNA在厚度为1cm比色杯中的吸光值为0.02
紫外分光光度计
比色杯
B
1．如图表示细胞内DNA复制和细胞外PCR扩增两个过程，两反应过程的条件中相同的是(　　)
A．模板　　
B．原料
C．酶　　　
D．能量供应
解析：本题主要考查细胞内DNA复制和细胞外PCR扩增的知识，意在考查考生对细胞内外DNA复制条件的理解。选项A模板不同，胞内DNA复制以整个DNA分子作为模板，PCR扩增却以一段目的DNA作为模板。选项B原料相同，均以4种脱氧核苷酸为原料。选项C酶不相同，胞内DNA解旋需要解旋酶，延伸需要DNA聚合酶等；胞外PCR扩增通过高温解旋而不需要解旋酶，延伸只需热稳定的Taq
DNA聚合酶。选项D能量供应不同，胞内DNA复制过程由ATP提供能量，而PCR扩增主要由外界供能。
D
2．下列关于PCR的描述中，正确的是(　　)
①PCR是一种酶促反应　
②引物决定了扩增的特异性　
③扩增DNA利用了热变性的原理　④扩增的对象是氨基酸序列
A．①②④
B．②③④
C．①③④
D．①②③
解析：PCR技术的概念是PCR全称为多聚酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术，原理是DNA复制，前提条件是要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物，条件还包括模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)，具体过程有①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。