2．2土壤中分离尿素的细菌的分离和计数 课件（35张PPT）

(共35张PPT)
专题二：微生物的培养和应用
课题2：土壤中分离尿素的细菌的分离与计数
尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。
土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶
课题背景
尿素的利用
细菌能利用尿素的原因
芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素
①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌
②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
常见的分解尿素的微生物
课题目的
（一）筛选菌株
1、实例：PCR技术
DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制(PCR)的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶
DNA聚合酶有什么作用？那些细胞中存在这种酶？如何寻找能耐高温的DNA聚合酶？
一.研究思路
1966年美国微生物学家鲁克在黄石国家公园的热泉中发现一种耐热细菌Taq；并从该细菌体内分离出了耐高泉中温的DNA聚合酶
对微生物的筛选有何启示？
因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来
寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
为什么Taq细菌能从热泉中被筛选出来？
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长
2、实验室中微生物的筛选原理
方法：要分离一种微生物，必须根据该微生物的特
点，包括营养、生理、生长条件等；如：不
同的微生物，所需营养物质有较大差别，要
针对微生物的具体情况分析。
⑴抑制大多数微生物的生长
⑵促进目的菌株的生长
结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平
板稀释等方法对它进行纯化培养分离。
3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：
①从物理性质看此培养基属于哪类？
固体培养基
②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？
碳源：葡萄糖
氮源：尿素
尿素是唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。
4、培养基选择分解尿素的微生物的原理
允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，叫做选择培养基
5、怎样证明此培养基具有选择性呢？
培养基类型
是否
接种
目的
结果
实验组
以尿素为
唯一氮源
的培养基
是
分离
尿素
细菌
只生长能分离尿素细菌
对照组
牛肉膏
蛋白胨
培养基
?是
判断该培养基有无选择性
生长多种微生物
思考：
1、利用尿素作为唯一氮源的培养基分离出的微生物
①只是一种微生物吗？
②都是能分解尿素的微生物吗？
芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素
不一定。因为有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物进行生长繁殖，因此要进行进一步的鉴定
思考：
2、请你提供一种方法，判断分解尿素的细菌确实能将尿素分解成氨？
方法：在以尿素作为唯一氮源的培养基中加入酚酞指示剂，接种培养该细菌，若指示剂变红，说明该种菌分解了尿素
1、显微镜直接计数法
这种方法是利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量
㈡统计菌落数目：
每毫升原液所含细菌数
＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数
缺点：
不能区分死菌与活菌
不适于对运动细菌的计数
2、间接计数法（活菌计数法）
原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。
其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数
2、间接计数法（活菌计数法）
方法：稀释涂布平板法
计算：每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
计数原则：一般选择菌落数在30—300个的平板上进行计数（50个左右为最佳）。
两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
1.第一位同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。
2.第二位同学在该深度下涂布了三个平板，统计的菌落数分别为21、212和256，该同学以这三个平板菌落数的平均值163作为统计结果。
思考：
你认为哪位同学的结果更接近真实值？这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？
　　第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。
第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。
?
设置重复组的重要性：在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。
某同学在稀释倍数为106
的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）（
）
A.
2.34×108
B.
2.34×109
C.
234
D.
23.4
B
练一练
每克样品中的菌株数
=（C÷V）×M
（三）设置对照
判断培养基中是否有杂菌污染：
将未接种的培养基同时进行培养作对照。
判断选择培养基是否具有筛选作用：
完全培养基（营养成分齐全）接种后培养观察菌落数目与实验组作对照。
主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。
实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因：
原因：
⑴土样不同
⑵培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质)
如何通过设置对照来确定真实原因？
小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的
方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验
方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。
结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。
土壤是“微生物的天然培养基”，数量最大、种类最多，大约70%—90%是细菌。
注意：取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌
二、实验设计
1、土壤取样
土壤中分解尿素的细菌的分离与记数
从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。
由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。
准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基（作对照）。还需要8个灭菌试管和1个灭菌移液管
。
将稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。
2、样品的稀释
◆应在火焰旁称取土壤10g。
◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行
◆分离不同的微生物采用不同的稀释度
原因：不同微生物在土壤中含量不同
目的：保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板
（1）样品稀释
注意：实验时要对培养皿作好标记注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。
如果得到了2个或2个以上菌落数目在30—300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大表明试验不精确，需要重新实验。
（2）取样涂布
在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目
培养不同微生物往往需要不同培养温度：
细菌：30～37℃
培养1～2d
放线菌：25～28℃
培养5～7d
霉菌：25～28℃
培养3～4d
3、培养和观察
微生物的培养与观察
1、无菌操作
1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。
2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。
3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。
2、做好标记
注明培养基种类、培养日期、平板培养样品
的稀释度等。
3、规划时间
三、操作提示
1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。
2.提示：选择每个平板上长有30—300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确
四、结果分析与评价
1.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素
五、课题延伸
2.测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后将滤膜放到伊红-美蓝培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。
大肠杆菌呈深紫色,中心有或无金属光泽
大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征
本课题知识小结:
课后练习
1.在微生物学中,将允许特定种类的微生物生长,同时抑制或者阻止其他种类微生物生长的培养基称做(　　)
A.鉴别培养基　　　　
B.加富培养基
C.选择培养基　
D.基础培养基
2.测定土壤中某细菌和真菌数量的过程中,和真菌相比,细菌需要选用稀释倍数更高的稀释液进行平板培养的原因是(　　)
A.细菌个体小,真菌个体大
B.细菌易稀释,真菌不易稀释
C.在土壤中细菌比真菌多
D.随机的,没有原因
C
C
3.下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是(　　)
A.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水
B.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、琼脂、水
C.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、尿素、琼脂、水
D.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水
A
4.能够测定样品活菌数的方法是(　　)
A.稀释涂布平板法
B.直接计数法
C.重量法
D.比浊法
5.下列关于微生物分离和培养的叙述,错误的是(　　)
A.微生物培养前,需对培养基进行消毒
B.测定土壤样品中的细菌数目,常用菌落计数法
C.分离土壤中不同的微生物,要采用不同的稀释度
D.分离能分解尿素的细菌,要以尿素作为培养基中唯一的氮源
A
A