转录

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第三章 从DNA到RNA——转录
在RNA聚合酶的催化下，以一段DNA链为模板合成RNA，从而将DNA所携带的遗传信息传递给RNA的过程称为转录（Transcription）。
RNA有多种，主要有rRNA，tRNA，mRNA，除此之外还有大量的小RNA。
第一节 转录的特征
一、不对称性
二、单向性
三、连续性
四、有特定的起始和终止位点
能够转录RNA的那条DNA链称为模板链(template strand) ，也称作无义链, 反义链。 而与之互补的另一条DNA链称为编码链(coding strand)，也称为有义链。
一、转录的不对称性
模板链
编码链
5’
5’
3’
3’
5’
5’
5′···GCAGTACATGTC ···3′
3′··· c g t g a t g t a c a g ···5′
编码链
模板链
mRNA
5′···GCAGUACAUGUC ···3′
转录
N······Ala · Val · His · Val ······C
蛋白质
翻译
模板链、编码链与转录及翻译的关系
5
3
3
5
模板链
编码链
编码链
模板链
转录方向
转录方向
模板链和编码链的相对性
RNA转录合成时，在RNA聚合酶的催化下，连续合成一段RNA链,合成过程中没有缺口的填补与连接。
二、转录的连续性
RNA转录时，只能向一个方向进行聚合，所依赖的模板DNA链的方向为3'→5'，而RNA链的合成方向为5'→3'。
三、转录的单向性
RNA转录合成时，只以DNA分子中的某一段作为模板。转录事件的发生存在特定的起始位点和特定的终止位点。
特定起始点和特定终止点之间的DNA链构成一个转录单位，通常由转录区和有关的调节顺序构成。
四、有特定的起始和终止位点
第二节 转录机器的主要成分
一、RNA聚合酶
二、转录因子
三、终止因子
是一种以DNA为模板的RNA聚合酶。
该酶在单链DNA模板以及四种三磷酸核苷酸存在的条件下，不需要引物，即可从5'→3'聚合RNA。
一、RNA聚合酶（RNA pol）
原核生物中的RNA聚合酶全酶由五个亚基构成，即 2 ' 。
亚基与转录起始点的识别有关，在转录合成开始后被释放；余下的部分（ 2 ‘）被称为核心酶，与RNA链的聚合有关。
（一）原核生物的RNA聚合酶
核心酶 (core enzyme)
全酶 (holoenzyme)
原核生物RNA聚合酶的全酶和核心酶
大肠杆菌有不同的 因子，分别识别不同的启动子。
枯草杆菌 因子的更替：枯草杆菌噬菌体SPO1能合成替代宿主菌 因子的蛋白质，使RNA聚合酶识别病毒启动子。
真核生物中的RNA聚合酶可按其对 -鹅膏蕈碱的敏感性而分为三种，它们均由10～12个大小不同的亚基所组成，结构非常复杂，其功能也不同。
（二）真核生物的RNA聚合酶
在真核生物中，转录的起始过程较为复杂。现已发现数百种蛋白因子与RNA转录合成有关，这些蛋白因子被统称为反式作用因子(trans-acting factor)。
在反式作用因子中，直接或间接参与转录起始复合体的形成的蛋白因子被称为转录因子（transcriptional factor, TF)。
二、转录因子
真核生物RNA聚合酶Ⅱ转录因子及其功能
原核生物中的终止因子ρ蛋白是一种六聚体的蛋白质，亚基的分子量为50kd，有NTP酶活性。
该蛋白因子能识别转录终止信号，导致RNA的释放与RNA聚合酶的解离。
三、终止因子
第三节 启动子与转录起始
一、原核启动子与转录起始
二、真核启动子与转录起始
启动子（Promoter）指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。
转录起始：（1）RNA聚合酶结合在转录模板的起始区域（启动子）。（2） DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。
与新生RNA链第一个核苷酸对应DNA链上的碱基称为转录起点，起点为＋1，起点前面称为上游，依次标记为-1，-2……。
一、原核启动子与转录起始
大肠杆菌RNA聚合酶与启动子相互作用包括启动子区的识别、酶与启动子的结合及 因子的解离。
原核启动子区的发现——Pribnow实验
DNA酶I 水解
分离
DNA片段
开始转录
(Pribnow box)
T A T A A T Pu A T A T T A Py
-10 区
1
-30
-50
10
-10
-40
-20
5
3
3
5
T T G A C A
A A C T G T
-35 区
RNA-pol辨认位点
(recognition site)
5
5
RNA聚合酶保护区
结构基因
3
3
原核启动子区的发现——Pribnow实验
原核生物转录起始区的一致性序列
被RNA聚合酶辨认的区段就是位于转录起始点-35区的TTGACA序列。
酶与该区结合后，即滑动至-10区的TATAAT序列（Pribnow盒） ，并启动转录。
RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合
⑵ DNA局部双链解开。
⑴ RNA聚合酶全酶( 2 )与模板结合。
⑶ 在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物。
RNApol ( 2 ) - DNA - pppGpN- OH 3
转录起始复合物:三元复合物
5 -pppG -OH + NTP 5 -pppGpN - OH 3 + ppi
原核转录起始过程
二、真核启动子与转录起始
真核生物RNA聚合酶II的转录起始点上游-25bp区也存在一段富含TA的顺序，被称为TATA盒（TATA Box），通常认为是启动子的核心序列。
除此之外，在真核生物中还可见到其他带共性的上游序列，如CAAT盒及GC盒等。
在远离受控基因的调控序列称为增强子（Enhancer）。
真核生物启动子保守序列
真核生物mRNA转录起始时，首先由TFⅡD的TBP亚基识别并结合TATA盒，然后在其他转录因子的配合下，与RNA聚合酶Ⅱ组装形成转录起始前复合物(pre-initiation complex, PIC)。
RNA聚合酶Ⅱ催化第一个磷酸二酯键形成。
RNA聚合酶Ⅱ的羧基末端结构域（CTD）被磷酸化修饰，大部分转录因子脱离，聚合酶向下游移动延伸RNA链。
真核mRNA转录起始过程
真核生物RNA聚合酶Ⅱ转录因子及其功能
RNA聚合酶II 大亚基中有 C 末端结构域 (carboxy terminal domain CTD)
CTD中含一保守氨基酸序列的多个重复
Tyr－Ser－Pro－Thr－Ser－Pro－Ser
C 端重复七肽
其中Ser可以被磷酸化。
POL-Ⅱ
TFⅡF
ⅡA
ⅡB
POL-Ⅱ
TFⅡF
ⅡH
ⅡE
TBP
TAF
TFⅡD-ⅡA-ⅡB-DNA复合物
TATA
ⅡA
ⅡB
TBP
TAF
TATA
ⅡH
ⅡE
CTD-
P
PIC组装完成，TFⅡH使CTD磷酸化
部分RNA聚合酶III识别的启动子在转录起始位点下游，即编码区内部，称为内部启动子或下游启动子。
5SrRNA基因与tRNA基因为内部启动子
内部启动子
tRNA基因内部启动子
第四节 转录延伸与终止
一、转录延伸
三、终止机制
四、抗终止
二、终止与终止子
一、转录延伸
亚基脱落，RNA–pol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；
在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。
原核转录延伸
(NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPi
原核生物转录过程中的羽毛状现象
真核生物转录延长过程与原核生物类似，但由于存在核小体的高级结构，故在转录延长过程中可观察到核小体移位和解聚现象。
真核转录延伸
RNA聚合酶停止把底物逐个加到RNA 3’-OH 释放出完成的RNA链 酶从模板上解离
终止子（Terminator）是模板DNA上的终止信号，由它转录产生的RNA决定了转录的终止。
原核终止子的类别
不依赖ρ因子：可以独立完成终止作用
依赖ρ因子：终止作用需要ρ因子的辅助。
二、终止与终止子
上游有1个富含GC对的二重对称区（反向互补序列），转录后的RNA可形成发夹结构。
终止位点前有一段4－8个A组成的序列，形成寡聚U的转录产物。
不依赖ρ因子的终止子
5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU... 3`
5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU... 3`
RNA
5 TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT... 3
DNA
UUUUU...…
5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU... 3`
茎环(stem-loop)/发夹(hairpin)结构
结构与不依赖ρ因子的终止子相似，但是序列存在差异，表现为对称区GC含量较少，后面无连续的A。
依赖ρ因子的终止子
无连续 U
G/C含量较少
不依赖ρ因子的终止：
RNA转录产物形成发夹结构，引起RNA聚合酶暂停，寡聚U提供解离信号，导致RNA转录的终止，RNA-DNA解离，RNA聚合酶释放。
三、终止机制
依赖ρ因子的终止
ρ因子的作用
a、ρ因子与RNA结合
b、ρ因子沿RNA从5’→3’移动（NTP水解供能）
c、ρ因子与RNA聚合酶相互作用造成转录的终止
因子：六聚体蛋白、水解各种核甘三磷酸促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。
ρ因子结合并追赶RNApol
RNApol暂停， ρ因子赶上RNApol与RNApol相互作用
三元复合体解离
真核生物mRNA的转录终止
5 ------AAUAAA-
5 ------AAUAAA--
核酸酶
-GUGUGUG
RNA-pol
AATAAA GTGTGTG
转录终止的修饰点
5
5
3
3
3 加尾
真核生物转录终止与poly A尾巴结构的添加密切相关。在poly A修饰位点的附近存在一组共同序列AATAAA和GTGTGT……，为转录终止的识别修饰位点。
转录过程中遇到终止信号，仍然继续转录，称为抗终止现象。
抗终止的两种机制
（1）破坏终止位点RNA的发夹结构
（2）依赖于蛋白质因子的转录抗终止
四、抗终止
核糖体破坏发夹结构的形成
ρ因子
ρ因子
核糖体
核糖体滞留
核糖体滞留在发夹区破坏发夹结构的形成
第五节 RNA的转录后加工
一、戴帽与加尾
二、内含子的切除
三、RNA编辑
四、核苷酸修饰
1．戴帽(adding cap)：
真核细胞mRNA转录后会在5’-端加上m7GTP结构。戴帽的过程发生在细胞核内。
帽子结构的意义 ：
（1） 对翻译起识别作用------为核糖体识别RNA提供信号
（2） 增加mRNA 的稳定性，使5’端免遭外切核酸酶的攻击
一、戴帽与加尾
Pi
5 ppGp…
磷酸酶
5 pppGp…
5 GpppGp…
pppG
ppi
鸟苷酸转移酶
5 m7GpppGp…
甲基转移酶
SAM
帽子结构的生成
2．加尾(adding tail)：
真核细胞mRNA转录终止后，首先由核酸外切酶切去3'端一些过剩的核苷酸，然后再加入polyA。
加尾的意义：
（1）polyA结构与mRNA的半衰期有关。
（2）可能与核质转运有关
加尾的位点与识别序列
5 ------AAUAAA-
5 ------AAUAAA--
核酸酶
-GUGUGUG
RNA-pol
AATAAA GTGTGTG
转录终止的修饰点
5
5
3
3
3 加尾
鸡卵清蛋白成熟mRNA与DNA杂交电镜图
mRNA
DNA
二、RNA的剪接
1. 断裂基因(splite gene)
B
A
C
编码区 A、B、C
非编码区
真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因。
外显子(exon)和内含子(intron)
外显子
结构基因中多肽链的编码序列
内含子
结构基因中的非编码序列，在mRNA成熟过程中被切除。
RNA剪接
去除原始转录产物——hnRNA中的内含子，将外显子拼接成成熟mRNA的过程。
鸡卵清蛋
白基因
hnRNA
首、尾修饰
hnRNA剪接
成熟的mRNA
鸡卵清蛋白基因及其转录、转录后修饰
RNA剪接方式的多样性
RNA剪接方式主要可分为三类：
机制一：由拼接装置完成（核mRNA内含子）
可供识别的特异序列
拼接装置由多种蛋白质和核蛋白组成
机制二：自我拼接（两类内含子Ⅰ 、Ⅱ ）
形成特定的二级结构
RNA具有催化拼接的能力
机制三：需要蛋白质酶参与的拼接（tRNA内含子）
Breathnach-Chambon rule （GU－AG规则）
● 5’---exon--- GU--------intron--------AG ------exon----3’
供点 100% 94% 受点
● 7Nt 分支位点 3’拼接点的上游
py X py U pu A py
机制一——拼接装置
序列特征：
多数核mRNA前体中内含子5’边界序列是GU，3’边界序列是AG，这一序列模式称为GU-AG规则
snRNA为核内小RNA，富含尿嘧啶，故以U作分类和命名，如U1、U2等。snRNA与核内蛋白质组装形成小核蛋白体（snRNP），参与hnRNA的剪接加工。
snRNP与hnRNA结合成为剪接体。
剪接体结构
机制二——核酶
UpA
GpU
外显子1
内含子
外显子2
pG-OH
(ppG-OH, pppG-OH)
U-OH
GpU
pGpA
第一次转酯反应
第二次转酯反应
G-OH
UpU
pGpA
四膜虫rRNA内含子的二级结构
四膜虫rRNA的剪接采用自身剪接方式
5 -端核苷酸序列
四膜虫前rRNA的自身剪接过程
tRNA前体的转录合成
机制三——核酸内切酶
三、RNA的编辑(RNA editing)
RNA编辑（editing）是指转录后的RNA在编码区发生碱基的突变、加入或丢失等现象。
RNA 编辑现象的发现：1986 R.Benne在研究锥虫线粒体mRNA转录加工时发现mRNA的多个编码位置上加入或丢失尿苷酸，1990年在高等动物和病毒中也发现了编辑现象。
T
U
A
U
A
U
G
UUUU
G
UU
G
UUU
A
UU
A
U
G
U
GA
UU
A
U
GG
UUUU
G
UUUUUU
A
UU
GGUA
UUUUUU
AUA
UUU
A
UUU
AA
UUU
G
UU
GA
U
AAA
U
ACA
UUUU
AUUUG
UU
UG
UU
AA
UUUUUUU
G
UUUU
G
U
GUUUUUGG
UU
TT
TTTT
U
AGG
UUUUUUU
G
UU
GUUG
UU
G
UUUU
G
U
A
UU
A
U
GA
UU
GAG
UUU
G
UU
G
UUU
GG
UUUUUU
G
UUUU
TT
TTTT
UU
G
U
GAAACCAG
UU
AUGAGAGUUUGCA
UU
G
UU
A
UUU
A
UU
ACA
UU
AAG
UU
GGUG
UUUUU
GG
UU
C
图
13-44
锥虫
(
T.brucei
)
cox
Ⅱ
基因的部分
RNA
顺序。很多
U(
红色
)
在
DNA
中未编码，而另一些在
DNA
中编码的
T(
紫色
)
在
mRNA
中被删除了。
(
参考
B.Lewin:
《
GENES
》
Ⅵ
,1997
，
Fig31.16)
锥虫 coxII 基因的编辑
RNA编辑的分子机制
通过gRNA（guide RNA）的指导作用。gRNA可和被辑的前体RNA分子的编辑区序列互补结合。在互补区中gRNA的“A”的相应位置留下了空缺，通过转酯反应，插入“U”。
RNA编辑与RNA剪接异同
相同点：都是转录后的加工形式，增加了遗传信息，都通过转酯反应完成。
不同点：RNA剪接的方式由自身序列决定，RNA编辑的方式由gRNA决定
RNA编辑作用说明，基因的编码序列经过转录后加工，是可有多用途分化的，因此也称为分化加工(differential RNA processing)，RNA编辑增加了遗传信息。
四、化学修饰
有些RNA，特别是rRNA与tRNA，有特异的化学修饰。
主要修饰类型：
甲基化
去氨基化（鸟嘌呤 次黄嘌呤）
硫代
核苷酸的替代
二价键的饱和化（二氢尿嘧啶）
同分异构化（尿嘧啶 假尿嘧啶）
核仁RNA（snoRNA）参与RNA的化学修饰，确定修饰位点。
tRNA的碱基修饰
（2）还原反应
如：U DHU
（3）核苷内的转位反应
如：U ψ
（4）脱氨反应
如：A I
如：A Am
（1）甲基化
（1）
（1）
（3）
（2）
（4）
转录的基本特征
RNA聚合酶的种类与功能
原核启动子与真核启动子的特点
原核转录起始与真核转录起始机制
原核终止子的类型、特点与终止机制
戴帽与加尾过程及其生理意义
三种RNA剪接机制
RNA编辑分子机制及生理意义
总结：原核与真核细胞转录过程的区别
本章要点