蛋白质

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蛋白质概述
蛋白质-英文为“Protein”—第一重要
1.蛋白质是生物体的重要组成成分，是生物体形态结构的物质基础。
2.蛋白质是生命活动的物质基础。
物质交换和运输 光合作用与呼吸作用
原生质运动 分泌与吸收 防御与抵抗
识别与调控 生物催化 等
Erythrocytes（红细胞） contain a large amount of
hemoglobins（血红蛋白）, the oxygen-transporting protein.
The protein keratin （角蛋白） is the chief structural components of hair, scales, horn, wool, nails and feathers.
蛋白质的概念：蛋白质 （protein）是最基本的生命物质之一，是由许多不同的α-氨基酸按一定的序列通过酰胺键（肽键）缩合而成的，具有较稳定的构象并具有一定生物功能的大分子。
蛋白质的元素组成
C（50－55%）、H（6－8%）、O（20－23%）、N（15－18%）、S（0－4%）,有些蛋白质还含有一些其它元素，如 P、Fe、Cu、Mo、I等。
N的含量平均为16%——凯氏（Kjadehl）定氮法的理论基础。 1克氮就相当于6.25克蛋白质。
氨基酸是蛋白质的基本结构单位。
氨基酸
蛋白质的基本结构单位——氨基酸（amino acid, aa或AA）
20种标准氨基酸（20 standard amino acids)
一、氨基酸的结构通式：
19种氨基酸具有一级氨基（-NH3+）和羧基（-COOH）结合到α碳原子（Cα），同时结合到（Cα）上的是H原子和各种侧链（R）；Pro具有二级氨基（α-亚氨基酸）
不带电形式
H2N—Cα—H
COOH
R
+H3N—Cα—H
COO-
R
两性离子形式
1、天然蛋白质仅有20种氨基酸，除脯氨酸外均为 - 氨基酸
2、命名：天然氨基酸一般都用俗名；也可用系统命名法；每一种氨基酸都有一个国际上通用的符号和中文符号。如：
HCH－COOH 甘氨酸（2－氨基乙酸）Gly 甘
NH2
3、旋光性：左旋（－）和右旋（＋）（除甘氨酸没有旋光性）
4、构型：D－型和L－型（除甘氨酸，天然蛋白质的氨基酸均为L－氨基酸，脯氨酸属于L- -亚氨基酸）。
氨基酸的相对构型与乳酸相联系；乳酸的相对构型与甘油醛相联系：
-碳原子为不对称的碳原子，组成蛋白质的氨基酸除Gly以外都有手性碳原子，在三维空间上就有两种不同的排列方式，它们互为镜影，所以，
CHO
COOH
COOH
L─甘油醛
L─乳酸
L─丙氨酸
NH2
CH3
CH2OH
HO
CH3
HO
H
H
H
构成蛋白质的20种氨基酸
二、常见的蛋白质氨基酸的分类：
法一：按R基化学结构特点分：
法二：按R基极性性质(pH 7时)分：
中性氨基酸
氨基酸的结构、代号:
人类8种必需氨基酸：（人体体内不能自身合成，必须从食物中获得）
Met、Val、Lys、Ile、Phe、Leu、Try、Thr
婴儿时期所需: Arg、His
早产儿所需：Try、Cys
1、一般物理性质
常见氨基酸均为无色结晶,其形状因构型而异。
溶解性：各种氨基酸在水中的溶解度差别很大，并能溶解于稀酸或稀碱中，但不能溶解于有机溶剂（酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出）。
(2)熔点：氨基酸的熔点极高，一般在200℃以上。
(3)味感：其味随不同氨基酸有所不同，有的无味、有的为甜、有的味苦，谷氨酸的单钠盐有鲜味，是味精的主要成分。
三、氨基酸的重要理化性质
(4)光吸收：天然蛋白质分子的20种氨基酸，组成蛋白质的氨基酸中，Trp、Tyr和 Phe对紫外光有一定的吸收，这是因为它们分子中含有苯环，是苯环的共轭双键造成的，这三个氨基酸的光吸收都在280nm附近。
酪氨酸的 max＝275nm，
苯丙氨酸的 max＝257nm，
色氨酸的 max＝280nm
2、氨基酸的两性解离和等电点
Br nsted的酸碱理论，即广义酸碱理论。
HA A- + H +
酸
碱
质子
两性离子(dipolar ion)
氨基酸在水中的两性离子既能像酸一样放出质子，也能像碱一样接受质子，氨基酸具有酸碱性质，是一类两性电解质。
As an acid（proton donor）：
As a base（proton acceptor）：
不同pH时氨基酸以不同的离子化形式存在：
正离子
两性离子
负离子
氨基酸所带静电荷为“零”时，溶液的pH值称为该氨基酸的等电点（isoelectric point），以pI表示。
实验证明在等电点时，氨基酸主要以两性离子形式存在，但也有少量的而且数量相等的正、负离子形式，还有极少量的中性分子。
当溶液的pH=pI时，氨基酸主要从两性离子形式存在。
pHpH>pI时，氨基酸主要以负离子形式存在。
氨基酸的酸碱滴定曲线
Henderson-Hasselbalch方程
pH=pKa + lg
[质子受体]
[质子供体]
酸碱滴定曲线
等电点的计算
中性氨基酸：以Gly为例
K1=
[Gly±] [H+]
[Gly+]
K2=
[Gly- ] [H+]
[Gly±]
pI时，
[Gly+ ] = [Gly- ]
[Gly±] [H+]
K1
=
[Gly±] K2
[H+]
[H+]2=K1K2
pH=（pK1+pK2）/2
pI=（pK1+pK2）/2
pI =（2.34+9.60）/2=5.97
Gly
酸性氨基酸，以Asp为例：
碱性氨基酸，以Lys为例：
pI的用途：分离、纯化和鉴定蛋白质制剂、氨基酸制剂，在药物使用上可改变pI方法延长疗效。
当pH＝pI时：
（1）带净电＝0，电场上不移动，导电性最小。
（2）溶解度最小，最易沉淀，粘度最小。
(1)与茚三酮的反应（颜色反应）
Pro产生黄色物质，其它为蓝紫色。在570nm（蓝紫色）或440nm（黄色）定量测定（几μg）。
4、氨基酸的化学性质
(2)与甲醛反应－氨基酸的甲醛滴定法
氨基酸定量分析—甲醛滴定法（间接滴定）
A.直接滴定，终点pH过高（12），没有适当指示剂。
B.与甲醛反应，滴定终点在9左右，可用酚酞作指示剂。
C.释放一个氢离子，相当于一个氨基（摩尔比1:1）
D.简单快速，一般用于测定蛋白质的水解速度。
二羟甲基衍生物
一羟甲基衍生物
(3) 与2,4-二硝基氟苯（DNFB）反应
应用：氨基酸取代DNFB测定蛋白质N端氨基酸，灵敏度高。
黄色
★首先由Sanger应用，确定了胰岛素的一级结构
A.肽分子与DNFB反应，得DNP-肽
B.水解DNP-肽，得DNP-N端氨基酸及其他游离氨基酸
C.分离DNP-氨基酸
D.层析法定性DNP-氨基酸，得出N端氨基酸的种类、数目
(4)与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应
由Edman于1950年首先提出
为α- NH2的反应
又称Edman降解法（苯异硫氰酸酯法），氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。
—N=C=S + N—CH—COOH
H
H
R
PITC
—N—C—N—CH—COOH
H
H
R
S
PTC-氨基酸
—N—C
H
R
S
N
C
C
O
PTH-氨基酸
pH8.3
无水HF
重复测定多肽链N端氨基酸排列顺序，设计出“多肽顺序自动分析仪”
肽链（N端氨基酸）与PITC偶联，生成PTC-肽
环化断裂：最靠近PTC基的肽键断裂，生成PTC-氨基酸和少一残基的肽链，同时PTC-氨基酸环化生成PTH-氨基酸
分离PTH-氨基酸
层析法鉴定
Edman降解法的改进方法--- DNS-Edman降解法
用DNS(二甲基萘磺酰氯)测定N端氨基酸
原理DNFB法相同
但水解后的DNS-氨基酸不需分离，可直接用电泳或层析法鉴定
由于DNS有强烈荧光，灵敏度比DNFB法高100倍，比Edman法高几到十几倍
可用于微量氨基酸的定量
（5）与荧光胺的反应
α- NH2的反应
氨基酸定量
在室温下，氨基酸可与荧光胺反应产生具有荧光的产物，根据荧光强度可用荧光分光光度计测定氨基酸含量。
(6)与5，5 '-双硫基-双（2-硝基苯甲酸）反应：
半胱氨酸R侧链上的—SH，可在pH=8.0和室温的条件下与5，5'-双硫基-双（2-硝基苯甲酸）试剂（又称Ellman试剂）反应，产生一种含有—SH的硝基苯甲酸。这种产物在波长412nm处有一个最大吸收峰，可测定光吸收值确定半胱氨酸的含量。
H2N—CH
CH2
S
SH
NO2
HOOC
S
NO2
COOH
COOH
+
S
S
NO2
NO2
HOOC
COOH
H2N—CH—COOH +
CH2
SH
pH8.0
硫代硝基苯甲酸
（7）其他反应
成盐、成酯、成肽、脱羧反应
肽与肽键
一、肽与肽键
一个氨基酸的α-羧基和另一个氨基酸的α-氨基脱水缩合而成的化合物，称为肽。
氨基酸之间脱水后形成的键称肽键（酰胺键）。
肽键的形成
由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。
氨基酸之间通过肽键连接形成的链称肽链。
N端
氨基酸残基
氨基酸残基
C端
肽链书写方式：N端→C端
写法：游离α-氨基在左，游离α-羧基在右，氨基酸之间用“-”表示肽键。 H2N-Ser-Leu-Phe-COOH
肽链有链状、环状和分支状。
命名：根据氨基酸组成，由N端→C端命名
丙氨酰甘氨酰亮氨酸
Ala－Gly－Leu
(or Ala Gly Leu)
化学反应：Sanger反应、DNS反应，Edman反应，茚三酮反应，双缩脲反应
在碱性溶液中与硫酸铜作用呈现紫红色，称双缩脲反应。
凡分子中含有两个以上-CO-NH-键的化合物都呈此反应
二、生物活性肽：
生物体内具有一定生物学活性的肽类物质称生物活性肽。
重要的生物活性肽有谷胱甘肽、神经肽、肽类激素等。
1. 谷胱甘肽（glutathione, GSH）：
是一种称为 -谷氨酰半胱氨酰甘氨酸的三肽化合物。
还原型与氧化型谷胱甘肽的相互转变
Glu-Cys-Gly
|
S
|
S
|
Glu-Cys-Gly
-2H
+2H
谷胱甘肽分子中的巯基可氧化或还原，故有还原型（GSH）与氧化型（GSSG）两种存在形式。
2× Glu-Cys-Gly
|
SH
解毒作用：与毒物或药物结合，消除其毒性作用；
参与氧化还原反应：作为重要的还原剂，参与体内多种氧化还原反应；
保护巯基酶的活性：使巯基酶的活性基团-SH维持还原状态；
维持红细胞膜结构的稳定：消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用。
谷胱甘肽的生理功用：
多肽类激素主要见于下丘脑及垂体分泌的激素，如催产素（9肽）、加压素（9肽）；
。
2. 多肽类激素：
3．神经肽
甲硫氨酸脑啡肽 Tyr–Gly–Gly–phe- Met
亮氨酸脑啡肽 Tyr-Gly-Gly-phe-Leu
功能：镇痛
如脑啡肽 (enkephalin)