人教版生物高中选修一5.2用多聚酶链式反应扩增DNA片段(44张PPT)

(共44张PPT)
多聚酶链式反应扩增DNA片断
----PCR技术polymerase
chain
reaction
一、基础知识
（一）、PCR技术的概念
是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百份的DNA拷贝
（二）、PCR技术的应用
遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定
1细胞内DNA复制条件分析：
条件
组分
作用
模板
DNA的两条单链
提供复制的模板
原料
四种脱氧核苷酸
合成DNA子链的原料
酶
解旋酶
DNA聚合酶
打开DNA双螺旋
催化合成DNA子链
能量
ATP
为解螺旋和合成子链供能
引物
RNA
为DNA聚合酶提供合成的3’端起点
DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3’端
延伸DNA链。因此，DNA复制需要引物。
2、DNA合成的方向
（1）DNA单链两端的命名
①基本单位－脱氧核苷酸
1号碳
5号碳
3号碳
一个核苷酸上的磷酸基团上的“－OH”和另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成3,5-磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3,5-磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基“－OH”末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端
一个核苷酸上的磷酸基团上的“－OH”和另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成3,5-磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3,5-磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基“－OH”末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端
3’端
3’端
5’端
5’端
一个核苷酸上的磷酸基团上的“－OH”和另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成3,5-磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3,5-磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基“－OH”末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端
DNA的反向平行结构：
1通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链：
2、DNA分子两条反向平行的脱氧核苷酸链根据碱基互补配对原则形成氢键连接而成。
3’端
3’端
5’端
5’端
DNA的反向平行结构：
1通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链：
2、DNA分子两条反向平行的脱氧核苷酸链根据碱基互补配对原则形成氢键连接而成。
引物：一小段单链DNA或RNA，一般20～30个碱基，能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。
后续加工：DNA聚合酶I将引物切去，并合成空缺处的DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来
DNA聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成，还具有校对功能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次，只有碱基配对无误后才能继续往下聚合。
［思考］DNA分子能准确复制的原因有哪些？
DNA双螺旋结构提供模板；
碱基互补配对；
DNA聚合酶的复查功能。
DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3’端延伸DNA链。
DNA合成的方向从子链由5’
端向
3’端延伸
DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3’端延伸DNA链。
DNA合成的方向从子链由5’
端向
3’端延伸
3、DNA复制的前提
——是______________
用_________________方法
思考：DAN复制的前提是什么？
体外扩增DNA
如何打开双链？
双链的解开
控制温度
DNA双链
单链
变性（加热80-100℃）
复性（缓慢冷却）
4、DNA
分子的热变性原理：
变性的目的：
复性的目的：
解开双链
有利于引物Ⅰ和引物Ⅱ与两条单链的结合
PCR的反应过程---
DNA
分子的热变性原理
变性：在95℃时DNA解旋
复性：在55℃时引物与DNA单链结合
延伸：在72℃时合成DNA子链（两个引物间的序列）
思考：高温使DNA解旋，但普通DNA聚合酶会失活,
__________________找到耐高温DNA聚合酶
P21托马斯.布鲁克
5、体外DNA复制的条件(PCR
反应的条件)
①DNA模板；
②分别与两条模板链相结合的两种引物；
③四种脱氧核苷酸；
④耐高温的聚合酶；
⑤
控制温度，但不需解旋酶.
二、PCR的反应过程
以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率
1、循环之前的一次预变性
2、PCR
一般要经历三十多次循环
循环数
变性
复性
延伸
第一次
94°C，5min
－
－
30次
９4℃，30s
55℃，30s
72℃，1min
最后一次
９4℃，1min
55℃，30s
72℃，1min
（1）变性：当温度上升到90
℃以上时，双链DNA解聚为单链。
（2）复性：温度下降到50
℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
（3）延伸：温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A，T，C，G)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
二、PCR的反应过程
3、每个循环包括：变性
——复性——延伸
（1）PCR循环--变性
95℃变性
（1）PCR循环--变性
95℃变性
（1）PCR循环--变性
95℃变性
（2）PCR循环—复性
（3）PCR循环—延伸
（3）PCR循环—延伸
（3）PCR循环—延伸
（3）PCR循环—延伸
引物Ⅰ和引物Ⅱ不同
①
②
4、循环特点：
①上一次循环的产物为下一循环的模板
②结果单链中最初母链有两条
③其它子代DNA分子都为双引物分子
④处于两引物之间的DNA序列呈指数增长2N
①
②
二、实验步骤：
①准备好PCR反应体系的配方P62
②用微量移液器按配方在微量试管中加入各组分
③盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁
④离心10分钟
⑤将离心管放入PCR仪上，设置好循环程序
⑥电泳检测PCR结果
三、操作提示：
操作提示
1．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌。
2．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀，再将微量离心管放在离心机上，离心约10s，使反应液集中在离心管底部，再放入PCR仪中进行反应。
目的：
避免外源性DNA大量扩增造成假阳性反应。
录像
实验操作步骤：
（1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备）
（2）用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（移液）
（3）盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合）
（4）将微量离心管放在离心机上（离心）
（5）将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序（反应）
四、结果分析与评价
1、原理：DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰(图5-11)。可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定。
四、结果分析与评价(了解)
2、具体方法如下。
1）．将样品进行50倍稀释：取2μLPCR反应液，加入98
μ
L蒸馏水。
2）．以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计(图5-12)的读数调节至零。
3）．加入步骤1中的DNA稀释液100L至比色杯中，测定260nm处的光吸收值。
4）．根据下面的公式计算DNA含量。
DNA含量(μg/ml)=50
x(260nm的读数)x稀释倍数
理论上DNA扩增数目的计算
1
、一条DNA，复制n次，
DNA为2
n
2
、
a条DNA，复制n次，
DNA为a2
n
PCR优点：
原理虽然复杂，但操作却十分简单。快速、高效、灵活和易于操作
复习：PCR技术与体内DNA复制的区别：
1.
PCR不需要解旋酶；体内DNA复制需要；
2.
PCR需要耐热的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而生物体内的聚合酶在高温时会变性；
3.
PCR一般要经历三十多次循环，而生物体内DNA复制需要生物体自身的复制。
2.
过程
高温变性（94℃）
低温复性（55℃）
中温延伸（72℃）
多次重复
2．实验操作
1
PCR反应体系：缓冲液、DNA模板，四种脱氧核苷酸原料(4种dNTP混合物)
、热稳定DNA聚合酶(Taq
DNA聚合酶)
、两种引物，水
N可以是A、T、C、G。ATP在其中的作用是提供碱基A，不是提供能量的
　　　　　
反应场所：
PCR仪（自动调节温度的仪器）。
［思考］缓冲液相当细胞内的什么成分？
（核基质）
水浴法：将微型离心管依次在95℃、55℃、72℃的恒温水浴锅中循环处理相应时间。
练习二(课堂检测)
1、DNA单链的________末端为3,端,
________末端为5,端,在DNA复制时,引物从模板链的___端配对结合.在___________酶的作用下,引物提供____端,使子链向下延伸.
2每次循环可以分为______________________这三个过程,对应温度分别为__________________.
磷酸基团
羟基
羟基
DNA聚合
3/
变性、复性、延伸
95℃、55
℃
、72
℃
练习二(课堂检测)
3、一个DNA片段经过30次循环后能形成________个这样的片段.
4依据DNA吸收紫外光的情况,用紫外分光光度计测得
DNA=_____________________________
230
50
x(260nm的读数)x稀释倍数