人教版高中选修1生物专题2课题2：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数(37张PPT)

(共37张PPT)
课题背景
1、尿素的利用
尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。
2、细菌能利用尿素的原因
土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶
3、常见的分解尿素的微生物
芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。
4、课题目的
①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌
②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
一.研究思路
㈠.筛选菌株
㈡.统计菌落数目
㈢.设置对照
（一）筛选菌株
提出的问题
—如何寻找耐高温的酶？
解决问题的思路
—寻找高温环境；
原理
—高温淘汰其他菌，选出耐高温细菌，
从耐高温菌种中提取耐高温酶。
启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；
方法：
⑴抑制大多数微生物的生长
⑵促进目的菌株的生长
结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。
2、实验室中微生物的筛选原理：
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：
①从物理性质看此培养基属于哪类？
固体培养基
②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？
碳源：葡萄糖、尿素
氮源：尿素
能。只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制。
③此配方能否筛选出产生脲酶的微生物？为什么？
选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
菌株：
纯且活状态所保存的菌种
。
菌株又称品系,表示任何由一个独立分离的单细胞(或单个病毒粒子)繁殖而成的纯种群体及其后代。
4、怎样证明此培养基具有选择性呢？
以尿素为
唯一氮源
的培养基
牛肉膏
蛋白胨
培养基
?是
分离
尿素
细菌
判断该
培养基
有无选
择性
只生长尿素细菌
生长多种微生物
是
1、显微镜直接计数法：
利用血球计数板(血细胞计数板），在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。
㈡.统计菌落数目：
不能区分死菌与活菌；
不适于对运动细菌的计数；
需要相对高的细菌浓度；
个体小的细菌在显微镜下难以观察；
缺点：
2.间接计数法（活菌计数法）
（1）常用方法：
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。
当样品的稀释度足够高时，培养基表
面生长的一个菌落，来源于样品稀释
液中的一个活菌，通过统计平板上的
菌落数，就能推测出样品中大约含有
多少活菌。
（2）原理：
稀释涂布平板法。
注意事项
①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30—300的平板上进行计数。
②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。
③统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。
说明设置重复组的重要性。第一位同学没有重复实验（至少涂布3个平板）第二位同学组结果误差过大，不应用于计算平均值。在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。
计算公式：
每克样品中的菌株数
=（C÷V）×M
某同学在稀释倍数为106
的培养基中测得
平板上菌落数的平均数为234，那么每克样
品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液
的体积为0.1ml）
(
)
A.
2.34×108
B.
2.34×109
C.
234
D.
23.4
B
（三）设置对照
判断培养基中是否有杂菌污染：
将未接种的培养基同时进行培养。
判断选择培养基是否具有筛选作用：
完全培养基（营养成分齐全）接种后培养
观察菌落数目。
主要目的是排除实验组中非测试因素对实验
结果的影响，提高实验结果的可信度。
设置对照的方法：
空白对照：不给对照组任何处理因素。
条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的处理因素。
自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行。
相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。
实例：
原因：⑴土样不同，
⑵培养基污染或操作失误
(或者是混入了其他的含氮物质)
阅读P22～23页“（三）设置对照”一段讨论教材中
提出的问题。
同学出现此结果的可能原因？
小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。
方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验
方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。
结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。
二.实验设计
实验的具体操作
㈠.土壤取样
从肥沃、接近中性的潮湿土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。
◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。
制备以尿素为唯一氮源的选择培养基
制备牛肉膏蛋白胨培养基
相同的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。
（对照作用）
思考？为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？
㈡.制备培养基：
每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基。
◆应在火焰旁称取土壤10g。
◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行
◆分离不同的微生物采用不同的稀释度
原因：不同微生物在土壤中含量不同
目的：保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板
（三）样品的稀释
为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？
原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2
185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。
结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。
㈣.涂布平板
◆实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。
◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。
㈤.微生物的培养与观察
在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
培养不同微生物往往需要不同培养温度和时间
细菌：30～37℃培养1～2d
放线菌：25～28℃培养5～7d
霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。
在一定的培养条件下（相同的培养基、温度及培养时间），同种微生物表现出相同而稳定的菌落特征。
菌落
菌落
[一]无菌操作
1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。
2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。
3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。
[二]做好标记
注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。
[三]制定计划
三、操作提示
四、结果分析与评价
1.培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落？
对照的培养皿无菌落说明培养基没有污染。
牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显大于选择培养基的菌落数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。
四、结果分析与评价
2.获得某一稀释度下，菌落数30～300的平板，在这一稀释度下是否至少有两个平板的菌落数相接近？
相接近，则说明操作成功。并能够进行菌落的计数。
3、你统计的每克土壤中含有能分解尿素的
细菌的菌落数是多少？与其他同学的结果
接近吗？如果差异很大，可能是什么原因引起的？
如果选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。应舍弃该数据，不进行计算。
五、鉴定：筛选后必鉴定
鉴别培养基：不影响微生物的生存
1、酚红培养基：
鉴定分解尿素的细菌。
原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→
酚红变红→脲酶阳性
2、伊红—美蓝培养基：
鉴定大肠杆菌。
原理：代谢产物与伊红—美蓝结合→菌落呈黑色并带有金属光泽。
3.下列说法不正确的是（
　）
A.科学家从70－80度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚
合酶。
B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、
M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值。
C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度
D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。
4.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（　　）
A.较多的氮源物质
B.较多的碳源物质
C.青霉素类药物
D.高浓度食盐
B
C