人教版选修三生物1．2--基因工程的基本操作程序（共92张PPT）

(共92张PPT)
基因工程的基本操作程序
基因工程培育抗虫棉的简要过程：
基因工程的基本操作程序
（1）目的基因的获取
（2）
（3）将目的基因导入受体细胞
（4）目的基因的检测与鉴定
基因表达载体的构建
一、目的基因的获取
1、目的基因：主要指的是编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子。
2、获取方法：
（1）从基因文库中获取目的基因；
（2）利用PCR技术扩增目的基因；
（3）通过DNA合成仪用化学方法直接合成
（一）从基因文库中获取目的基因
1.什么叫基因文库？
将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
基因组DNA文库
cDNA文库
基因组DNA文库与cDNA文库的比较
补：原核细胞的基因结构
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
与RNA聚合酶结合位点
启动子
终止子
RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。
转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。
转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。
①不能转录为信使RNA，不能
编码蛋白质。
：能转录相应的信使RNA，能
编码蛋白质
编码区
非编码区
原核细胞的
基因结构
②有调控遗传信息表达的核
苷酸序列，在该序列中，
最重要的是位于编码区上
游的RNA聚合酶结合位点。
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
启动子
终止子
补：真核细胞的基因结构
编码区
与RNA聚合酶
结合位点
内含子
外显子
能够编码蛋白质的序列叫做外显子
不能够编码蛋白质的序列叫做内含子
启动子
终止子
编码区上游
编码区下游
内含子：
外显子：
真核细胞的
基因结构
编码区
非编码区
外显子：能编码蛋白质的序列
内含子：不能编码蛋白质的序列
：有调控作用的核苷酸序列，
包括位于编码区上游的RNA
聚合酶结合位点。
非编码序列：
包括非编码区和内含子
结构基因
外显子
内含子
转录、加工修饰
mRNA
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
思考
编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？
连续
不连续
编码区
非编码
原核细胞
真核细胞
不同点
编码区是
_____的
编码区是间隔的、_____的
相同点
都由能够编码蛋白质的_____
_
和具有调控作用的______
区组成的
基因表达的计算
在真核生物中，对应的是
的碱基数
6
3
1
氨基酸数
碱基数
？
补充资料
基因中外显子
基因组文库与部分基因文库的关系
基因组文库和部分基因文库的比较
小
大
无
有
无
有
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
可以
部分基因可以
文库类型
cDNA文库
基因组文库
文库大小
基因中启动子
基因中内含子
基因多少
物种间基因交流
概念辨析
基因文库与基因库
基因库是指某一生物群体中的全部基因。
基因文库与基因克隆
基因克隆是只包含某些特定基因或DNA片段的克隆。
基因文库中包含着为数众多的克隆，建成后可供随时选取其中任何一个基因克隆之用。
基因组文库的构建模式图
通过对
受体菌
的培养而储存基因
2.基因文库的构建方法
（1）
鸟枪法
（2）
反转录法
（3）根据已知的氨基酸序列合成DNA法
人工合成法
（真核生物）
多用于原核生物
直接分离法
（1）鸟枪法：
供体细胞中的DNA
许多DNA片段
运载体
限制酶
与载体连接
受体细胞
产生特定性状
导入
外源DNA扩增
目的基因
分离
(直接分离法)
以目的基因转录成的信使RNA为模板，再反转录酶的催化下反转录成互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA，即cDNA，从而获得所需的基因。
（2）反转录法（cDNA文库的构建方法）
（3）根据已知的氨基酸序列合成DNA法
：
根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。
蛋白质的氨基酸序列
mRNA的核苷酸序列
结构基因的核苷酸序列
推测
推测
目的基因
化学合成
上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？
操作简便广泛使用
工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因
专一性强
操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高
专一性最强
仅限于合成核苷酸对较少的简单基因
优点
缺点
鸟枪法
反转录法
根据已知氨基酸合成DNA法
思考：
如何从基因文库中得到所需要的基因？
依据：目的基因的有关信息。
如：根据基因的核苷酸序列；
基因的功能；
基因在染色体上的位置；
基因的转录产物mRNA；
基因翻译产物蛋白质等特性。
注意：
基因文库中不是直接保管相应基因，而是保存受体菌，菌中含基因。
（二）利用PCR技术扩增目的基因
PCR反应
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
重复1~3步
25~30轮
目的DNA片段
扩增100万倍以上
DNA双螺旋
DNA单链
与引物复性
DNA变性
形成2条单链
子链延伸
DNA加倍
模板DNA
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
引物1
引物2
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
引物1
引物2
Taq酶
Taq酶
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
第1轮结束
第2轮开始
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
Taq
Taq
Taq
Taq
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
第2轮结束
①
概念：PCR全称为_______________，是一项
在生物____复制___________的核酸合成技术。
③前提条件：_______________________；
原料：___________、___________
、
__________________、
________________。
②原理：__________
④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循
环的次数）
⑤结果：
聚合酶链式反应
体外
特定DNA片段
DNA复制
已知基因的核苷酸序列
四种脱氧核苷酸
DNA引物
热稳定DNA聚合酶
指数
2n
使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
模板DNA
过程：
变性、退火、延伸三步曲
变性：加热至90～95℃双链DNA解链成为单链DNA
退火：冷却至55～60℃部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合
延伸：加热至70～75℃以目的基因为模板，合成互补的新DNA链
⑥过程：
a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板
在热作用下，_____断裂，形成___________
b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引
物与DNA模板结合，形成局部________。
c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从
引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补
的________。
氢键
单链DNA
双链
DNA链
思考？
1个DNA分子进行PCR扩增,循环4次，
理论上至少需要几个引物？
2×（2n-1）(n为循环次数)
（24-1）×2=30
模板DNA
特异性引物
耐热DNA聚合酶
dNTPs
Mg2+
PCR体系基本组成成分
一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补
PCR总结：
PCR的基本反应步骤
变性
90-95?C
延伸
70-75?C
退火
55-60?C
PCR总结：
Taq
DNA聚合酶（thermus
aquaticus)
酶活性(%)
温度(℃)
40
50
60
70
80
90
100
100
80
60
40
20
PCR技术扩增与DNA复制的比较
碱基互补配对
四种脱氧核苷酸
模板、能量、酶
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
体外复制
细胞核内
热稳定的DNA聚合酶
细胞内的DNA聚合酶
大量的DNA片段
形成整个DNA分子
PCR技术
DNA复制
相同点
原理
原料
条件
不同点
解旋方式
场所
酶
结果
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
模板DNA
第1轮扩增
第2轮扩增
第3轮扩增
第4轮扩增
第5轮扩增
第6轮扩增
根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。
蛋白质的氨基酸序列
mRNA的核苷酸序列
结构基因的核苷酸序列
推测
推测
目的基因
化学合成
（三）化学方法人工合成目的基因
人工合成
(基因比较小)
DNA合成仪
从基因文库中获取
利用PCR技术扩增
利用化学方法人工合成
归纳：获取目的基因的方法
用一定的_________切割
质粒，使其出现一个切
口，露出____________。
用_____________切断目
的基因，使其产生_____
____________。
将切下的目的基因片段插入质粒的______处，
再加入适量___________，形成了一个重组
DNA分子（重组质粒）
限制酶
黏性末端
同一种限制酶
相同的黏性末端
切口
DNA连接酶
1.过程:
二、构建表达载体
——
核心
质粒
DNA分子
限制酶处理
一个切口
两个黏性末端
两个切口
获得目的基因
DNA连接酶
重组DNA分子（重组质粒）
同一种
过程:
2.基因表达载体的目的
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代；
（2）使目的基因能够表达和发挥作用。
科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败，才获得成功。
起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。
然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。
资
料:
思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？（P15）
不可以。
因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。
必须构建上述元件的主要理由是：
（1）
生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；
（2）
通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；
（3）
目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；
（4）
为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子（增强基因启动子工作效率的顺式作用序列，能够在相对于启动子的任何方向和任何位置(上游或下游)上都发挥作用。）等；
（5）
有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。
3.基因表达载体的组成：
它们有什么作用？
a、目的基因
b、启动子
c、终止子
d、标记基因
调节基
因
操纵基
因
结构基因
RNA聚合酶
半乳糖苷酶
酶
酶
启动子
RNA聚合酶
启动子：位于基因首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。
思考1：
表达载体为什么一定要有启动子？
（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达；
（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。
思考2：终止子的作用是什么？
终止子是位于基因尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录。
是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。
思考3：标记基因有什么作用？
①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。
注意
②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。
③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。
④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。
基因工程技术路线
三、将目的基因导入受体细胞
常用的受体细胞：
有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。
将目的基因导入受体细胞的原理：
借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
（一）转化：
目的基因进入_________内，并且在
受体细胞内维持_____和_____的过程
受体细胞
稳定
表达
（二）方法
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
基因枪法
花粉管通道法
——显微注射法
——感受态细胞
1.将目的基因导入植物细胞
农杆菌转化法
基因枪法
花粉管通道法
（1）农杆菌转化法
①特点：
易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力
②原理：
Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。
③转化过程:
Ti质粒
目的基因
构建
表达载体
植物细胞
植物细胞染色DNA
新性状
农杆菌
基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。
（2）基因枪法
适用于单子叶植物
（3）花粉通道法
植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。
适用于被子植物
胚珠
花药
花丝
柱头
花柱
子房壁
子房
雄蕊
雌蕊
2.将目的基因导入动物细胞
（1）方法：显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中）
思考：为什么要用受精卵而不用体细胞？
（2）操作程序:
提纯含目的基因表达载体
取受精卵
显微注射
移植到子宫
受精卵发育
新性状动物
常用法：Ca2+处理
常用菌：大肠杆菌
微生物作受体细胞原因：
繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少
过程：
Ca2+处理大肠杆菌
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA
3.将目的基因导入微生物细胞
思考：为什么要用Ca2+处理受体细胞？
用Ca2＋处理，增加细菌细胞壁的通透性
受精卵
体细胞
受精卵
细胞/个体
农杆菌转化法
基因枪法
花粉管通道法
显微注
射技术
用Ca2+处理成感受态细胞
采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的作法正确的是（　　）
A.将毒素蛋白注射到受精卵中
B.将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养
C.将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵
D.将编码毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中
BC
受体生物
植物
动物
微生物
受体细胞
导入方法
四、目的基因的检测与鉴定
检测:
是否插入目的基因
是否转录
是否翻译
鉴定:
分子水平鉴定
个体生物学水平鉴定
1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因
①
首先取出转基因生物的基因组DNA；
（1）方法:
DNA分子杂交
（2）过程:
②
将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针；
③
使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中。
（一）检测
基因探针：是一段带有检测标记，且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列。
　
基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。
DNA分子杂交示意图
采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。
（二）鉴定（个体生物学水平）
2、检测目的基因是否转录出了mRNA
3、检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
①方法:
分
子
杂
交
方法:
抗原-抗体杂交
②过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。
提取
（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法——抗原-抗体杂交
Bt毒素蛋白
将Bt毒蛋白注射小鼠体内
从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体
抗体
蛋白质
出现杂交带
脱分化
组织培养
若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。
怎样检验抗虫基因在棉细胞内是否表达呢？
没有抗虫基因
的棉植株
有抗虫基因的棉植株
棉铃虫
虫没有死
虫被杀死
没有表达
目的基因表达
目的基因的表达和检测
类型
步骤
检测内容
方法
结果显示
分子检测
第一步
目的基因是否进入受体细胞
DNA分子杂交
（DNA和DNA之间）
是否成功显示出杂交带
第二步
目的基因是否转录出mRNA
分子杂交技术
（DNA和mRNA之间）
是否成功显示出杂交带
第三步
目的基因是否翻译出蛋白质
抗原—抗体杂交
是否成功显示出杂交带
个体水平鉴定
包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；
基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。
提示：
①DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA，然后高温解成单链，再与同位素标记的DNA探针杂交；
②抗原－抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。
归纳:
基因工程的基本操作程序
获取目的基因
从基因文库
利用PCR
化学方法人工合成
构建基因表达载体
目的基因、启动子、终止子、标记基因
将目的基因导入受体细胞
转化法（微生物）、农杆菌转化法（植物）、显微注射法（动物）
目的基因的检测与鉴定
检测：是否插入、转录、翻译
为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？
构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。
但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。
利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？
有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。
寻根问底：
根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出农杆菌不能将目的基因不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?
①要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；
②要加趋化和诱导的物质，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的诱导的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。
酚类诱导物主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中
4.β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？
（1）从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列（cDNA)。
（2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。
（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明β-珠蛋白基因已进入其中。
（4）培养进入了β-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取β-珠蛋白。
DNA
附着在膜上
硝酸纤维素膜
加探针
报告基因（含荧光素分子）
变性
DNA分子杂交
（如检测SARS病毒等）
a
b
c
d
①检测是否插入目的基因，利用DNA分子杂交技术，目的基因DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的DNA杂交，看是否有杂交带。
②检测是否转录出了mRNA，利用分子杂交技术，目的基因DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的mRNA杂交，看是否有杂交带。
③检测目的基因是否翻译成蛋白质。抗体与蛋白质进行抗原－抗体杂交，看是否有杂交带。
④还可以进行个体水平的鉴定，根据其性状。
提示：①DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA，然后高温解成单链，再与同位素标记的DNA探针杂交；
②抗原－抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。
三种印迹技术的比较
放射自显影照片
DNA链末端合成终止法