人教版高中生物选修一 5-3血红蛋白的提取与分离（共38张PPT）

(共38张PPT)
课题3
血红蛋白的提取和分离
知识回顾--------有关蛋白质的几个问题：
1、含量　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
2、组成元素　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
3、相对分子质量
4、基本组成单位：
结构简式：
种类：
5、氨基酸连接方式　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
占细胞干重的50％以上，细胞中含量最多的有机物
C、H、O、N
高分子化合物
氨基酸
NH2
脱水缩合
知识回顾--------有关蛋白质的几个问题：
6、肽键　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
7、分子结构
8、蛋白质多样性的原因：
(多样性的根本原因)　　　　　　　　　　
9
、蛋白质的鉴定方法　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺序变化多端；多肽链的空间结构千差万别
10、生理功能
细胞和生物体的结构物质，是人体发育和组织更新的主要原料，具有运输、调节、免疫、催化等作用，是一切生命活动的主要承担者
基础知识
1.分离生物大分子的基本思路：
选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。
2.蛋白质分离和提取的原理：
根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。
阅读并回答　　　　　　　　（P64）
1、凝胶色谱法另一个名称；
2、凝胶色谱法分离蛋白质的依据；
3、凝胶的实质；
4、凝胶色谱法
5、凝胶色谱法的原理。
基础知识　　　　（一）
凝胶色谱法
1、凝胶色谱法的别名：分配色谱法
是根据相对分予质量的大小分离蛋白质的有效方法。
4、凝胶
①性质：一些微小的多孔球体，球内含许多贯穿的通道；
②化学本质：多糖类化合物：
③实例：葡聚糖、琼脂糖：
2、凝胶色谱法的概念：
根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。
基础知识　　　　（一）
凝胶色谱法
3、依据的特性　　蛋白质分子量的大小。
基础知识　　　　（一）
凝胶色谱法
5、具体过程
原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（
）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（
），移动速度（
），而（
）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（
）移动，路程（
），移动速度（
），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。
相对分子质量较小
较长
较慢
相对分子质量较大
凝胶外部
较短
较快
基础知识　　　　（一）
凝胶色谱法
1、缓冲物质有哪些？
2、缓冲溶液的作用是什么？
3、怎样配制缓冲溶液？
基础知识　　　　　（二）缓冲溶液
1、缓冲溶液概念
在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。
　　能够抵制外界的酸或碱的对溶液的PH值的影响，维持PH基本不变。
2、缓冲溶液作用
基础知识　　　　　（二）缓冲溶液
3、缓冲溶液配制
通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。
思考：
你认为在血红蛋白整个实验中用的缓冲液是什么？
它的目的是什么？
使用的是磷酸缓冲液，
目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性)。
基础知识　　　　　（二）缓冲溶液
阅读第65页的相关内容，回答以下问题：
1、电泳的概念；
2、电泳的原理；
3、电泳的种类；
4、SDS的作用。
基础知识　　　　　　（三）电泳
1、概念
带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。
基础知识　　　　　　（三）电泳
在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
基础知识　　　　　　（三）电泳
2、原理：许多重要的生物大分子，如（
）等都具有(
)
在(
)下，这些基团会带上（
）
。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其（
）
移动。电泳利用了待分离样品中各种分子（
）以及分子本身（
）、（
）的不同使带电分子产生不同的（
），从而实现样品中各种分子的分离。
多肽、核酸
可解离的基团
正电或负电
所带电荷相反的电极
带电性质的差异
大小
形状
迁移速度
一定的PH
⑶.常见电泳类型：
①琼脂糖凝胶电泳
②聚丙稀酰胺凝胶电泳
③SDS——聚丙稀酰胺凝胶电泳
迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小、形状。
电泳迁移率完全取决于分子的大小。
基础知识　　　　　　（三）电泳
为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入(
)。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是(
)。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于(
)。
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。
SDS
单条肽链的分子量
分子的大小
实验操作
阅读课本相关内容，思考以下问题：
1、蛋白质的提取和分离一般分成几步？
2、样品怎样处理？
3、蛋白质怎样分离？
实验操作
（一）样品处理
问：蛋白质提取和分离步骤？
（1）样品处理：包括洗涤红细胞；
血红蛋白的释放；
离心等操作收集血红蛋白溶液。
（2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。
（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。
（4）纯度鉴定：通过SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。
①血液组成
实验操作
（一）样品处理
血液由血浆和各种血细胞组成，其中红细胞最多。在红细胞的组成中，约90％是血红蛋白。血红蛋白由四个肽链组成(如图)，包括两个α-肽链和两个β-肽链。其中每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分了二氧化碳。血红蛋白因含有血红素而呈现红色。
实验操作
（一）样品处理
每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色
②血红蛋白组成及作用
③选材
本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。
实验操作
（一）样品处理
1、红细胞的洗涤
阅读课本内容，回答以下问题：
1、洗涤的目的？
2、怎样洗涤？
3、洗涤干净的标志是什么？
除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。
采样分离－吸浆倒红－加液搅拌－重洗三次
直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。
实验操作
（一）样品处理
速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果。
问：
1、洗涤操作过程中，为什么要低速短时间离心？
2、为了使红细胞洗涤干净，需如何处理？
1、红细胞的洗涤
重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。
实验操作
（一）样品处理
2.血红蛋白的释放
血红蛋白的释放
将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40％体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10
min。在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。
说出：蒸馏水和甲苯的作用。
实验操作
（一）样品处理
3.分离血红蛋白溶液
问：
1、采用什么方法分离血红蛋白？
2、离心分层后，各层的成分各是什么？
3、用滤纸过滤，去掉什么成分？
实验操作
（一）样品处理
取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12h。
4.透析
问：透析过程及透析目的？
透析目的：
除去样品中分子量较小的杂质。
实验操作
（一）样品处理
4.透析
实验操作
（一）样品处理
阅读课本相关内容，了解凝胶色谱的操作过程。
实验操作
（二）凝胶色谱操作
实验操作
（二）凝胶色谱操作
（1）凝胶色谱柱的制作：
①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。
②底塞的制作：打孔-挖穴-安管-覆网-纱包-插管
注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。
③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。
④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。
⑤安装其他附属结构。
2.凝胶色谱柱的装填
问:1、凝胶的选择材料?
G代表意义?
2、简单步骤?
3、注意点：
实验操作
（二）凝胶色谱操作
选择交联葡聚糖凝胶（G-75）
“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围,
75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。
2.凝胶色谱柱的装填
问:1、凝胶的选择材料?
G代表意义?
2、简单步骤?
3、注意点：
实验操作
（二）凝胶色谱操作
立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h
洗涤平衡
一次性缓慢倒入；轻轻敲打
装填悬浮液
凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴
凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀
根据色谱柱体积计算凝胶用量
色谱柱垂直固定在支架上
配制悬浮液
计算称量凝胶
固定色谱柱
步骤
操作要求
①
②
③
④
⑤
3.凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙；
装填凝胶柱时不得气泡存在。（因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。）
2.凝胶色谱柱的装填
实验操作
（二）凝胶色谱操作
问:1、凝胶的选择材料?
G代表意义?
2、简单步骤?
3、注意点：
装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300mL的20mmol/L的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12h。
问：洗涤平衡的溶液？注意什么？
1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果；
2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。
实验操作
（二）凝胶色谱操作
2.凝胶色谱柱的装填
3.样品的加入和洗脱
实验操作
（二）凝胶色谱操作
3.样品加入与洗脱
①调节缓冲液面
②滴加透析样品
吸管吸1mL样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。
加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。
实验操作
（二）凝胶色谱操作
③样品渗入凝胶床
加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内。等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。
⑤收集：
待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）。
④洗脱
小心加入物质的量浓度为20
mmol／L的磷酸缓冲液(pH为7.0)到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。
3.样品加入与洗脱
实验操作
（二）凝胶色谱操作
问：正确的加样操作，注意什么？
1、不要触及破坏凝胶面
2、贴壁加样
3、使吸管管口沿管壁环绕移动
答：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能。
讨论：
1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？
实验操作
（二）凝胶色谱操作
讨论：
2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？
答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。
课题3
血红蛋白的提取与分离
知识总结
血红蛋白的提取和分离