人教版高中生物选修三-1.2《基因工程的基本操作程序》课件(54张PPT)
文档属性
| 名称 | 人教版高中生物选修三-1.2《基因工程的基本操作程序》课件(54张PPT) |  | |
| 格式 | zip | ||
| 文件大小 | 7.6MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 人教版（新课程标准） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2020-07-28 15:54:28 | ||
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文档简介
(共54张PPT)
§1-2
基因工程的基本操作程序
原核细胞的基因结构(补充内容）
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
RNA聚合酶结合位点
启动子
终止子
①不编码蛋白质。
：编码蛋白质
,连续不间断
编码区
非编码区
原核细胞的
基因结构
②调控遗传信息表达,上
游有启动子，下游有终止子
启动子
真核细胞的基因结构（补充内容）
编码区
RNA聚合酶
结合位点
内含子
外显子
启动子
终止子
编码区上游
编码区下游
真核细胞的
基因结构
编码区
非编码区
外显子：能编码蛋白质的序列
内含子：不能编码蛋白质的序列
：有调控作用,上游有启动子，下游有终止子
非编码序列：
包括非编码区和内含子
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
连续
不连续
编码区
非编码
思考：
编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？
原核细胞
真核细胞
不同点
编码区是
_____的
编码区是间隔的、_____的
相同点
都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的
基因工程的基本操作程序
目的基因的获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因等。也可以是一些有调控作用的因子
一、目的基因的获取
1、目的基因主要是指______________________
编码蛋白质的结构基因
2、获取目的基因的常用方法
（1）从基因文库中获取
（2）利用PCR技术扩增
（3）人工合成
概念：基因文库
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(gene
library)
(1)从基因文库中获取目的基因
基因组文库与部分基因文库的关系
怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?
依据：目的基因的有关信息。
如：
基因的核苷酸序列
基因的功能、基因在染色体上的位置
基因的转录产物mRNA
基因的表达产物蛋白质等特性。
提取某种生物的全部DNA
用适当的限制酶切
一定大小的DNA片段
将DNA片段与载体连接
导入受体菌中储存
基因组文库
基因文库的构建方法之
直接分离法
（鸟枪法）
某种生物的单链mRNA
单链互补DNA
双链cDNA片段
导入受体菌中储存
与载体连接
cDNA文库
反（逆）转录酶
DNA聚合酶
反转录法：cDNA的合成流程图解
基因文库的构建方法之
基因文库的构建方法
无
无
有
有
文库类型
cDNA文库
基因组文库
文库大小
小
大
基因中启动子
基因中内含子
基因多少
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
物种之间的基因交流
可以
部分基因可以
说明
基因文库的组建过程就包含基因工程的基本操作步骤。从基因文库中获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性.
原理:
DNA双链复制
前提:
要有一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列，以便合成引物。
（2）利用PCR技术扩增目的基因
①
概念：PCR全称为_______________，是一项
在生物____复制___________的核酸合成技术
③条件：_______________________、
_______________、___________
、
___________.
②原理：__________
④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）
⑤结果：
选修1
P60
聚合酶链式反应
体外
特定DNA片段
DNA双链复制
已知基因的核苷酸序列
四种脱氧核苷酸
一对引物
DNA聚合酶
指数
2n
使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
利用PCR技术扩增目的基因
⑥过程：
a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板
在热作用下，_____断裂，形成___________
b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引
物与DNA模板结合，形成局部________。
c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从
引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补
的________。
氢键
单链DNA
双链
DNA链
具体过程
（3）
人工合成
——根据已知的氨基酸序列合成DNA
蛋白质的氨基酸序列
mRNA的核苷酸序列
结构基因的核苷酸序列
推测
推测
目的基因
化学合成
寻根问底——为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？
提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。
二、基因表达载体的构建——核心
（1）用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。
（2）用___________切断目
的基因，使其产生_____
____________。
（3）将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组
DNA分子（重组质粒）
限制酶
黏性末端
同一种限制酶
的黏性末端
切口
DNA连接酶
相同
1.过程:
质粒
目的基因
限制酶处理
一个切口
两个黏性末端
两个切口
获得目的基因
DNA连接酶
表达载体
同种
1.过程:
获得的一定是质粒-目的基因
的连接体吗？
例1：据图表回答问题：
(1)假设所用的限制酶均能将所识别的位点完全切开，采用EcoRⅠ和PstⅠ切割含有目的基因的DNA，能得到________种DNA片段。如果将质粒和含目的基因的DNA片段只用EcoRⅠ酶切，酶切产物再加入DNA连接酶，其中由两个DNA片段连接形成的产物有__________________、_____________________________、____________________。
(2)为了防止目的基因和质粒经酶切后产生的末端任意连接，酶切时应该选用的酶是______________、___________。
4
质粒—质粒连接物
目的基因—目的基因连接物
质粒—目的基因连接物
EcoRⅠ
SmaⅠ
用2种酶切质粒环和目的基因，避免自身环化的问题。
科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。
起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。
然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。
资
料:
复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因
基因表达载体的组成：
位于基因的首端,是mRNA结合位点
位于基因的末端,终止转录
检测目的基因是否导入受体细胞
目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
葛洲坝中学
罗静
§1-2
基因工程的基本操作程序
第2课时
目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
例2：下图是某质粒示意图,其中ori为质粒复制所必需的核苷酸序列,ampR为氨苄青霉素抗性基因,Tetr为四环素抗性基因,箭头表示目的基因插入位点。受体大肠杆菌细胞内原来不含有这两种抗生素抗性基因。下列有关叙述正确的是( )
A.ampR和Tetr是一对等位基因,常作为基因工程的标记基因
B.ori是重组质粒顺利导入受体细胞所必需的核苷酸序列
C.将重组质粒2、4导入不同大肠杆菌,大肠杆菌都不能在含四环素的培养基上分裂、生长
D.将重组质粒1、3导入不同大肠杆菌,大肠杆菌都不能在含氨苄青霉素的培养基上分裂、生长
[解析]
等位基因是位于同源染色体相同位置上控制相对性状的基因,所以基因ampR和Tetr不是一对等位基因,A项错误;ori为质粒复制所必需的核苷酸序列,其与重组质粒能否顺利导入受体细胞没有直接的联系,B项错误;重组质粒2的四环素抗性基因没有被破坏,因此导入重组质粒2的大肠杆菌能在含有四环素的培养基上分裂、生长,C项错误;从题图中可以看出,重组质粒1的ori被破坏,质粒无法完成复制,而重组质粒3的氨苄青霉素抗性基因被破坏,因此分别导入重组质粒1、3的大肠杆菌都不能在含有氨苄青霉素的培养基上分裂、生长,D项正确。
D
常用的受体细胞：
有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。
将目的基因导入受体细胞的原理
借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
三、将目的基因导入受体细胞
转化：目的基因进入受体细胞，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程
1、将目的基因导入植物细胞
（1）农杆菌转化法
特点:
能感染双子叶植物和祼子植物,对大多数单子叶植物无感染能力
Ti质粒的T—DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上
转化过程:
Ti质粒
目的基因
构建
表达载体
植物细胞
植物细胞染色DNA
新性状
农杆菌
（2）基因枪法
基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。
（3）花粉通道法
植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。
2、将目的基因导入动物细胞
方法:
显微注射技术
操作程序:
提纯含目的基因表达载体
取受精卵
显微注射
移植到子宫
受精卵发育
新性状动物
3、将目的基因导入微生物细胞
常用法：Ca2+处理
常用菌：大肠杆菌
微生物作受体细胞原因：
过程：
Ca2+处理大肠杆菌
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA
繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少
寻根问底：将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？
提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。
(四)目的基因的检测与鉴定
——检查是否成功
检测—
①检测转基因生物染色体的DNA
上是否插入了目的基因
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法——
方法——
方法——
DNA分子杂交
知识延伸——DNA分子杂交技术
该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。
(四)目的基因的检测与鉴定
——检查是否成功
检测—
鉴定——
①检测转基因生物染色体的DNA
上是否插入了目的基因
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
方法——
方法——
方法——
DNA分子杂交
分子杂交（注意与上不同之处）
抗原抗体杂交
例3：下列关于核酸分子杂交和抗原—抗体杂交的叙述，正确的是( )
A．核酸分子杂交是指两条脱氧核苷酸链的杂交
B．抗原—抗体杂交的原理为碱基互补配对原则
C．核酸分子杂交可检测目的基因的存在和转录
D．抗原—抗体杂交中目的基因的表达产物常作为抗体
C
例4:
真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：
(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是____________________________________________________。
(2)若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用____________作为载体，其原因是________________________________。
(3)若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有______________________(答出两点即可)等优点。
(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是_______________(填“蛋白
A的基因”或“蛋白A的抗体”)
基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对
应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A
噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕
噬菌体
繁殖快、容易培养
蛋白A的抗体
4
2
问题（书第十五面思考与探究第一题）：
作为基因工程表达载体，只需要含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？
答案：不能
基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子和标记基因。
为了能够让目的基因在载体上表达出来，就需要用启动子和终止子来完成转录的过程，将目的基因上的DNA片段通过转录和复制等过程编码在载体基因的DNA上，只有这样才能实现基因的表达。
（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达
（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录
（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等
（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记
（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等
返回
3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？
思考与探究
大肠杆菌表达生产胰岛素的过程的“独特之处”
利用大肠杆菌等微生物表达生产胰岛素的过程中，表达产物常常形成包涵体，而不是分泌出来。要通过加工才能得到有活性的人胰岛素
生产糖蛋白的过程
经过加工、组装、折叠、加糖基等过程后，形成具有一定空间结构的蛋白质
合成多肽
基因的转录，将遗传信息从细胞核传递到细胞质
细胞核
核糖体
内质网
出芽
高尔基体
细胞膜分泌到细胞外
糖蛋白是分泌蛋白，它的合成需要内质网和高尔基体的加工。
而大肠杆菌是原核生物，只有核糖体这一种细胞器，没有内质网和高尔基体。所以它无法合成糖蛋白。
返回
思考与探究：1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？
不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：
（1）
生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；
（2）
通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；
（3）
目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；
（4）
为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；
（5）
有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。
思考与探究2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?
①要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；
②要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。
3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？
有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。
思考与探究：
（1）从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。
（2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，
构建成一个表达载体。
（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基
上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环
素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明β-珠蛋白基因已进入
其中。
（4）培养进入了β-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取β-珠蛋白。
4.β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？
§1-2
基因工程的基本操作程序
原核细胞的基因结构(补充内容）
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
RNA聚合酶结合位点
启动子
终止子
①不编码蛋白质。
：编码蛋白质
,连续不间断
编码区
非编码区
原核细胞的
基因结构
②调控遗传信息表达,上
游有启动子，下游有终止子
启动子
真核细胞的基因结构（补充内容）
编码区
RNA聚合酶
结合位点
内含子
外显子
启动子
终止子
编码区上游
编码区下游
真核细胞的
基因结构
编码区
非编码区
外显子：能编码蛋白质的序列
内含子：不能编码蛋白质的序列
：有调控作用,上游有启动子，下游有终止子
非编码序列：
包括非编码区和内含子
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
连续
不连续
编码区
非编码
思考：
编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？
原核细胞
真核细胞
不同点
编码区是
_____的
编码区是间隔的、_____的
相同点
都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的
基因工程的基本操作程序
目的基因的获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因等。也可以是一些有调控作用的因子
一、目的基因的获取
1、目的基因主要是指______________________
编码蛋白质的结构基因
2、获取目的基因的常用方法
（1）从基因文库中获取
（2）利用PCR技术扩增
（3）人工合成
概念：基因文库
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(gene
library)
(1)从基因文库中获取目的基因
基因组文库与部分基因文库的关系
怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?
依据：目的基因的有关信息。
如：
基因的核苷酸序列
基因的功能、基因在染色体上的位置
基因的转录产物mRNA
基因的表达产物蛋白质等特性。
提取某种生物的全部DNA
用适当的限制酶切
一定大小的DNA片段
将DNA片段与载体连接
导入受体菌中储存
基因组文库
基因文库的构建方法之
直接分离法
（鸟枪法）
某种生物的单链mRNA
单链互补DNA
双链cDNA片段
导入受体菌中储存
与载体连接
cDNA文库
反（逆）转录酶
DNA聚合酶
反转录法：cDNA的合成流程图解
基因文库的构建方法之
基因文库的构建方法
无
无
有
有
文库类型
cDNA文库
基因组文库
文库大小
小
大
基因中启动子
基因中内含子
基因多少
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
物种之间的基因交流
可以
部分基因可以
说明
基因文库的组建过程就包含基因工程的基本操作步骤。从基因文库中获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性.
原理:
DNA双链复制
前提:
要有一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列，以便合成引物。
（2）利用PCR技术扩增目的基因
①
概念：PCR全称为_______________，是一项
在生物____复制___________的核酸合成技术
③条件：_______________________、
_______________、___________
、
___________.
②原理：__________
④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）
⑤结果：
选修1
P60
聚合酶链式反应
体外
特定DNA片段
DNA双链复制
已知基因的核苷酸序列
四种脱氧核苷酸
一对引物
DNA聚合酶
指数
2n
使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
利用PCR技术扩增目的基因
⑥过程：
a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板
在热作用下，_____断裂，形成___________
b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引
物与DNA模板结合，形成局部________。
c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从
引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补
的________。
氢键
单链DNA
双链
DNA链
具体过程
（3）
人工合成
——根据已知的氨基酸序列合成DNA
蛋白质的氨基酸序列
mRNA的核苷酸序列
结构基因的核苷酸序列
推测
推测
目的基因
化学合成
寻根问底——为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？
提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。
二、基因表达载体的构建——核心
（1）用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。
（2）用___________切断目
的基因，使其产生_____
____________。
（3）将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组
DNA分子（重组质粒）
限制酶
黏性末端
同一种限制酶
的黏性末端
切口
DNA连接酶
相同
1.过程:
质粒
目的基因
限制酶处理
一个切口
两个黏性末端
两个切口
获得目的基因
DNA连接酶
表达载体
同种
1.过程:
获得的一定是质粒-目的基因
的连接体吗？
例1：据图表回答问题：
(1)假设所用的限制酶均能将所识别的位点完全切开，采用EcoRⅠ和PstⅠ切割含有目的基因的DNA，能得到________种DNA片段。如果将质粒和含目的基因的DNA片段只用EcoRⅠ酶切，酶切产物再加入DNA连接酶，其中由两个DNA片段连接形成的产物有__________________、_____________________________、____________________。
(2)为了防止目的基因和质粒经酶切后产生的末端任意连接，酶切时应该选用的酶是______________、___________。
4
质粒—质粒连接物
目的基因—目的基因连接物
质粒—目的基因连接物
EcoRⅠ
SmaⅠ
用2种酶切质粒环和目的基因，避免自身环化的问题。
科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。
起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。
然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。
资
料:
复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因
基因表达载体的组成：
位于基因的首端,是mRNA结合位点
位于基因的末端,终止转录
检测目的基因是否导入受体细胞
目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
葛洲坝中学
罗静
§1-2
基因工程的基本操作程序
第2课时
目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
例2：下图是某质粒示意图,其中ori为质粒复制所必需的核苷酸序列,ampR为氨苄青霉素抗性基因,Tetr为四环素抗性基因,箭头表示目的基因插入位点。受体大肠杆菌细胞内原来不含有这两种抗生素抗性基因。下列有关叙述正确的是( )
A.ampR和Tetr是一对等位基因,常作为基因工程的标记基因
B.ori是重组质粒顺利导入受体细胞所必需的核苷酸序列
C.将重组质粒2、4导入不同大肠杆菌,大肠杆菌都不能在含四环素的培养基上分裂、生长
D.将重组质粒1、3导入不同大肠杆菌,大肠杆菌都不能在含氨苄青霉素的培养基上分裂、生长
[解析]
等位基因是位于同源染色体相同位置上控制相对性状的基因,所以基因ampR和Tetr不是一对等位基因,A项错误;ori为质粒复制所必需的核苷酸序列,其与重组质粒能否顺利导入受体细胞没有直接的联系,B项错误;重组质粒2的四环素抗性基因没有被破坏,因此导入重组质粒2的大肠杆菌能在含有四环素的培养基上分裂、生长,C项错误;从题图中可以看出,重组质粒1的ori被破坏,质粒无法完成复制,而重组质粒3的氨苄青霉素抗性基因被破坏,因此分别导入重组质粒1、3的大肠杆菌都不能在含有氨苄青霉素的培养基上分裂、生长,D项正确。
D
常用的受体细胞：
有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。
将目的基因导入受体细胞的原理
借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
三、将目的基因导入受体细胞
转化：目的基因进入受体细胞，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程
1、将目的基因导入植物细胞
（1）农杆菌转化法
特点:
能感染双子叶植物和祼子植物,对大多数单子叶植物无感染能力
Ti质粒的T—DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上
转化过程:
Ti质粒
目的基因
构建
表达载体
植物细胞
植物细胞染色DNA
新性状
农杆菌
（2）基因枪法
基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。
（3）花粉通道法
植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。
2、将目的基因导入动物细胞
方法:
显微注射技术
操作程序:
提纯含目的基因表达载体
取受精卵
显微注射
移植到子宫
受精卵发育
新性状动物
3、将目的基因导入微生物细胞
常用法：Ca2+处理
常用菌：大肠杆菌
微生物作受体细胞原因：
过程：
Ca2+处理大肠杆菌
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA
繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少
寻根问底：将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？
提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。
(四)目的基因的检测与鉴定
——检查是否成功
检测—
①检测转基因生物染色体的DNA
上是否插入了目的基因
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法——
方法——
方法——
DNA分子杂交
知识延伸——DNA分子杂交技术
该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。
(四)目的基因的检测与鉴定
——检查是否成功
检测—
鉴定——
①检测转基因生物染色体的DNA
上是否插入了目的基因
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
方法——
方法——
方法——
DNA分子杂交
分子杂交（注意与上不同之处）
抗原抗体杂交
例3：下列关于核酸分子杂交和抗原—抗体杂交的叙述，正确的是( )
A．核酸分子杂交是指两条脱氧核苷酸链的杂交
B．抗原—抗体杂交的原理为碱基互补配对原则
C．核酸分子杂交可检测目的基因的存在和转录
D．抗原—抗体杂交中目的基因的表达产物常作为抗体
C
例4:
真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：
(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是____________________________________________________。
(2)若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用____________作为载体，其原因是________________________________。
(3)若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有______________________(答出两点即可)等优点。
(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是_______________(填“蛋白
A的基因”或“蛋白A的抗体”)
基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对
应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A
噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕
噬菌体
繁殖快、容易培养
蛋白A的抗体
4
2
问题（书第十五面思考与探究第一题）：
作为基因工程表达载体，只需要含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？
答案：不能
基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子和标记基因。
为了能够让目的基因在载体上表达出来，就需要用启动子和终止子来完成转录的过程，将目的基因上的DNA片段通过转录和复制等过程编码在载体基因的DNA上，只有这样才能实现基因的表达。
（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达
（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录
（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等
（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记
（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等
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3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？
思考与探究
大肠杆菌表达生产胰岛素的过程的“独特之处”
利用大肠杆菌等微生物表达生产胰岛素的过程中，表达产物常常形成包涵体，而不是分泌出来。要通过加工才能得到有活性的人胰岛素
生产糖蛋白的过程
经过加工、组装、折叠、加糖基等过程后，形成具有一定空间结构的蛋白质
合成多肽
基因的转录，将遗传信息从细胞核传递到细胞质
细胞核
核糖体
内质网
出芽
高尔基体
细胞膜分泌到细胞外
糖蛋白是分泌蛋白，它的合成需要内质网和高尔基体的加工。
而大肠杆菌是原核生物，只有核糖体这一种细胞器，没有内质网和高尔基体。所以它无法合成糖蛋白。
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思考与探究：1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？
不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：
（1）
生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；
（2）
通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；
（3）
目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；
（4）
为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；
（5）
有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。
思考与探究2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?
①要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；
②要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。
3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？
有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。
思考与探究：
（1）从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。
（2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，
构建成一个表达载体。
（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基
上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环
素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明β-珠蛋白基因已进入
其中。
（4）培养进入了β-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取β-珠蛋白。
4.β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？