(共61张PPT)
1.2
基因工程的基本操作程序
1、目的基因的获取
2、基因表达载体的构建
3、将目的基因导入受体细胞
4、目的基因的检测与鉴定
基因工程基本操作的四个步骤
有了目的基因,我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。
使目的基因在受体细胞中稳定存在,并可进行遗传、表达和发挥作用
载体进入受体细胞稳定表达,才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。
才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。
一、目的基因的获取
(一)、目的基因主要是______________________
编码蛋白质的结构基因
请举出三个以上的例子
(二)、获取目的基因的常用方法有哪些?
1、从基因文库中获取
2、利用PCR技术扩增
3、人工合成
请阅读P9第一和二两段
一、目的基因的获取
(一)从基因文库中直接获取
1.基因文库:概念见P9
2.基因文库的分类:按外源DNA片段的来源分类
种类
基因组DNA文库:含有一种生物的全部基因
部分基因文库:只包含了一种生物的部分基因,
如:cDNA文库
3.基因文库的目的
为了在不知目的基因序列的情况下,便于获得所需的目的基因。
4.获取目的基因的根据:
见课本P9
提取某种生物的全部DNA
用适当的限制酶切
一定大小的DNA片段
将DNA片段与载体连接
导入受体菌中储存
基因组文库
5.基因文库的构建方法之一
(1)直接分离法(鸟枪法)
某种生物的单链mRNA
单链互补DNA
双链cDNA片段
导入受体菌中储存
与载体连接
cDNA文库
反(逆)转录酶
DNA聚合酶
反转录法:cDNA的合成流程图解
5.基因文库的构建方法之
基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较
2、利用PCR技术扩增目的基因
四种脱氧核苷酸(dNTP)
一对引物:
热稳定DNA聚合酶(Taq酶)
模板DNA(
需含有目的基因
)
Mg2+(激活剂)
条件:
缓冲溶液
一对寡核苷酸序列:与目的基因的起始段互补
一段已知目的基因的核苷酸序列,以便根据这一序列合成引物
前提:
过程
高温变性(解旋为单链)
低温退火(引物与单链互补结合)
适温延伸(在Taq酶的作用下合成
与模板互补的DNA双链)
重复循环
预变性(增加DNA变性的概率)
2、具体过程
PCR(多聚酶链式反应)
①
概念:PCR全称为_______________,是一项
在生物____复制___________的核酸合成技术
③条件:_______________________、
_______________、___________
、
___________.等
②原理:__________
④方式:以_____方式扩增,即____(n为扩增循
环的次数)
⑤结果:
聚合酶链式反应
体外
特定DNA片段
DNA复制
四种脱氧核苷酸
一对引物
DNA聚合酶
指数
2n
使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
要有一段已知目的基因的核苷酸序列(前提条件)
⑥过程:
a、DNA变性(90℃-95℃):双链DNA模板
在热作用下,_____断裂,形成___________
b、退火(复性55℃-65℃):系统温度降低,引
物与DNA模板结合,形成局部________。
c、延伸(70℃-75℃):在Taq酶的作用下,
合成与模板互补的________。
氢键
单链DNA
双链
DNA链
PCR技术扩增与DNA复制的比较
碱基互补配对
四种脱氧核苷酸
模板、能量、酶
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
体外复制
细胞核内
热稳定的DNA聚合酶
细胞内的DNA聚合酶
大量的DNA片段
形成整个DNA分子
PCR技术
DNA复制
相同点
原理
原料
条件
不同点
解旋方式
场所
酶
结果
目的基因的mRNA
单链DNA
(cDNA)
双链DNA
(即目的基因)
反转录
合成
1)反转录法:
以目的基因转录成的信使RNA为模板,反转录成互补的单链DNA,然后在酶的作用下合成双链DNA,从而获得所需的基因。
蛋白质的氨基酸序列
mRNA的核苷酸序列
结构基因的核苷酸序列
目的基因
推测
推测
化学合成
2)根据已知的氨基酸序列合成DNA法
:
3、人工合成的目的基因
二、基因表达载体的构建
——基因工程的核心
1、目的:
所需物质:
使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代,同时使目的基因能够表达和发挥作用。
它们各自的作用是什么?
2、基因表达载体的组成:
复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因
它们各自的作用是什么?
启动子:位于基因的首端的一段特殊的DNA片断,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因转录出mRNA,最终获得蛋白质
终止子:位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断,能终止mRNA的转录
标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将有目的基因的细胞筛选出来
①载体与表达载体的区别:二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构
②用到的工具酶:既用到限制酶切割载体,又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接,两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键
③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少
④目的基因不能单独进入受体细胞,必需以表达载体的方式携带进去。
注意
三、将目的基因导入受体细胞
(一)转化:
(二)方法
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
基因枪法
花粉管通道法
——显微注射法
——感受态细胞
目的基因进入_________内,并且在
受体细胞内维持_____和_____的过程
受体细胞
稳定
表达
1、将目的基因导入植物细胞的方法:
(1)农杆菌转化法
①农杆菌特点:
易感染双子叶植物和裸子植物,对大多数单子叶植物没有感染能力
②原理:Ti质粒上的T---DNA可以转移到受体细胞,并整合到受体细胞染色体的DNA上。
③过程:
④优点
(2)基因枪法
(3)花粉管通道法
2、将目的基因导入动物细胞
①方法:显微注射法
②程序:
目的基因表达载体提纯
取卵(受精卵)
显微注射
受精卵
新性状动物
3、将目的基因导入微生物细胞
①原核生物特点:繁殖快、单细胞、遗传物质少
②方法:
用Ca2+处理细胞
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA分子
四、目的基因的检测与鉴定
——检查是否成功
(一)、检测
1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因
(关键步骤)
①.首先取出转基因生物的基因组DNA
②.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针
③.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中
(1)方法:
DNA分子杂交
(2)过程:
归纳步骤
DNA分子杂交示意图
采用一定的技术手段,将两种生物的DNA分子的单链放在一起,如果这两个单链具有互补的碱基序列,那么,互补的碱基序列就会结合在一起,形成杂合双链区;在没有互补碱基序列的部位,仍然是两条游离的单链。
P15思考与探究
(二)、鉴定(个体生物学水平)
2、检测目的基因是否转录出了mRNA
3、检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
①方法:
分
子
杂
交
方法:
抗原抗体杂交
②过程:
用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA
归纳步骤
(四)目的基因的检测与鉴定
——检查是否成功
检测—
鉴定——
①检测转基因生物染色体的DNA
上是否插入了目的基因
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
方法——
方法——
方法——
DNA分子杂交
分子杂交(注意与上不同之处)
抗原抗体杂交
归纳:
基因工程的基本操作程序
获取目的基因
从基因文库
利用PCR
化学方法人工合成
构建基因表达载体
目的基因、启动子、终止子、标记基因
将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法、显微注射法
目的基因的检测与鉴定
检测:是否插入、转录、翻译
鉴定:
练习1:(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积,增加粮食产量,黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。
(1)获得耐盐基因后,构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的
处,DNA连接酶作用于
处。(填“a”或“b”)
a
a
练习1:(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积,增加粮食产量,黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。
(2)将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和
法。
(3)由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用
技术,该技术的核心是
和
。
(4)为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功,既要用放射性同位素标记的
作探针进行分子杂交检测,又要用
方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。
基因枪法(花粉管通道法)
植物组织培养
脱分化和再分化
耐盐基因
一定浓度盐水浇灌
1)以下说法正确的是
(
)
A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列
B、质粒是基因工程中唯一的运载体
C、运载体必须具备的条件之一是:具有多个限制酶切点,以便与外源基因连接
D、基因控制的性状都能在后代表现出来
C
练习
2)不属于质粒被选为基因运载体的理由是
A、能复制
(
)
B、有多个限制酶切点
C、具有标记基因
D、它是环状DNA
D
练习
3)有关基因工程的叙述中,错误的是(
)
A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来
B、
限制性内切酶用于目的基因的获得
C、目的基因须由运载体导入受体细胞
D、
人工合成目的基因不用限制性内切酶
A
练习
4)有关基因工程的叙述正确的是
(
)
A、限制酶只在获得目的基因时才用
B、重组质粒的形成在细胞内完成
C、质粒都可作为运载体
D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料
D
练习
5)基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中,不进行碱基互补配对的步骤是
(
)
A、人工合成目的基因
B、目的基因与运载体结合
C、将目的基因导入受体细胞
D、目的基因的检测和表达
C
练习
知识点一:1.原核细胞的基因结构
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
与RNA聚合酶结合位点
启动子
终止子
启动子:位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子,基因就不能转录。
终止子:位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断,它能阻碍RNA聚合酶的移动,并使其从DNA模板链上脱离下来,使转录终止。
RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.(以模板转录然后脱落)
①不能转录为信使RNA,不能
编码蛋白质。
:能转录相应的信使RNA,能
编码蛋白质
编码区
非编码区
原核细胞的
基因结构
②有调控遗传信息表达的核
苷酸序列,在该序列中,
最重要的是位于编码区上
游的RNA聚合酶结合位点。
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
启动子
终止子
编码区
与RNA聚合酶
结合位点
内含子
外显子
能够编码蛋白质的序列叫做外显子
不能够编码蛋白质的序列叫做内含子
启动子
终止子
编码区上游
编码区下游
内含子:
外显子:
知识点一:2.真核细胞的基因结构
真核细胞的
基因结构
编码区
非编码区
外显子:能编码蛋白质的序列
内含子:不能编码蛋白质的序列
:有调控作用的核苷酸序列,
包括位于编码区上游的RNA
聚合酶结合位点等。
非编码序列:
包括非编码区和内含子
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
思考
编码相同数目氨基酸的蛋白质,原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗?
连续
不连续
编码区
非编码
原核细胞
真核细胞
不同点
编码区是
_____的
编码区是间隔的、_____的
相同点
都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的