生物：新人教版选修1 全册课件（31份）

(共20张PPT)
选修1 专题二
课题1 微生物的实验室培养
课题1 微生物的实验室培养
微生物的实验室培养条件：
（1）合适的营养和环境条件
（2）确保其他微生物无法混入
一. 培养基
1. 概念：
按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
2. 种类：
（按物理形态分）
液体培养基、半固体培养基
固体培养基
应用微生物分离、鉴定、计数和
菌种保存等方面
按照培养基用途分
选择性培养基
鉴别培养基
按照培养基的成分来分
合成培养基、天然培养基、半合成培养基
3. 成分：
思考：
各种培养基的具体配方不同，但一般都包括哪些成分？
水、无机盐、碳源、氮源、（生长因子）
+满足微生物对pH、特殊营养物质、氧气的要求
C
二. 无菌技术
思考：
1. 什么是无菌技术？包括哪些方面？
2. 无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？（P15旁栏思考）
3. 消毒和灭菌有何不同？
4. 常用的消毒和灭菌方法有哪些？
无菌技术：泛指培养微生物操作中，所有防 止杂菌污染的方法。
无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。
C
3. 常用的消毒方法：
煮沸消毒法，巴氏消毒法，紫外线或化学药剂消毒法
常用的灭菌方法：
灼烧灭菌
干热灭菌
高压蒸汽灭菌 ：100kPa 121℃ 15-30min
判断下列各项是否需要消毒或灭菌。如需要，选择合适方法。
（1）豆浆 （2）游泳池 （3）超净工作台
（4）玻棒、试管、吸管、锥形瓶 （5）培养细菌用的培养皿 （6）无菌水 （7）牛肉膏蛋白胨培养基
（8）接种环、接种针（9）实验操作者的双手
牛奶
接种室、接种箱或超净工作台
接种工具，接种环、接种针或其他金属用具
玻璃器皿（吸管、培养皿）
三. 实验操作---大肠杆菌的纯化培养
（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
计算－称量－溶化－灭菌－倒平板
（二）纯化大肠杆菌
最常用的接种方法有：
平板划线法和稀释涂布平板法
（冷却至50℃）
涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？
应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。
菌种的保存
1、临时保藏法：
对象：
温度：
缺点：
2、甘油管藏法：
对象：
温度：
结果分析与评价
课题延伸
（P20）
频繁使用的菌种
4℃（冰箱）
容易被污染或
产生变异
长期保存的菌种
-20℃（冷冻箱）
接种环
接种针
倒平板
讨论1，2
讨论3，4
平板划线法
讨论2，3
1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
操作的第一步灼烧接种环：
每次划线前灼烧接种环：
划线结束后灼烧接种环：
避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；
杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。
及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
以免接种环温度太高，杀死菌种。
划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，
每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落
涂布器
1.培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？
2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
提示：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。
通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基
3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，
将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
不要
空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生
选择培养基
不加氮源的无氮培养基:
分离固氮菌
不加含碳有机物的无碳培养基:
分离自养型微生物
加入四环素等抗生素的培养基:
分离导入了目的基因的受体细胞
不加氨基嘌呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基:
分离杂交瘤细胞
加入高浓度食盐的培养基:
分离金黄色葡萄球菌(共12张PPT)
一、乳酸菌发酵
１、制作泡菜
２、制作酸奶
（无氧的条件下）
C6H12O6
２C３H６O３
二、亚硝酸盐
中毒原因可包括几方面：①贮存过久的新鲜蔬菜、腐烂蔬菜及放置过久的煮熟蔬菜，此时原来菜内的硝酸盐在硝酸盐还原菌的作用下转化为亚硝酸盐；
②刚腌不久的蔬菜(暴腌菜)含有大量亚硝酸盐，一般于腌后20天消失；
③有些地区饮用水中含有较多的硝酸盐，当用该水煮粥或食物，再在不洁的锅内放置过夜后，则硝酸盐在细菌作用下还原为亚硝酸盐；　
④食用蔬菜(特别是叶菜)过多时，大量硝酸盐进入肠道，若肠道消化功能欠佳，则肠道内的细菌可将硝酸盐还原为亚硝酸盐；
⑤腌肉制品加入过量硝酸盐和亚硝酸盐；
⑥误将亚硝酸盐当食盐加入食品；
⑦奶制品中含有枯草杆菌，可使硝酸盐还原为亚硝酸盐。
针对主要的中毒原因，可采取如下预防措施：①蔬菜应妥善保存，防止腐烂，不吃腐烂的蔬菜；②食剩的熟菜不可在高温下存放长时间后再食用；②勿食大量刚腌的菜，腌菜时盐应多放，至少腌至15天以上再食用；但现胞的菜，最好马上就吃，不能存放过久，腌菜时选用新鲜菜；④不要在短时间内吃大量叶菜类蔬菜，或先用开水焊5分钟，弃汤后再烹调；⑤肉制品中硝酸盐和亚硝酸盐用量要严格按国家卫生标准规定，不可多加；苦井水勿用于煮粥，尤其勿存放过夜；⑧防止错把亚硝酸盐当食盐或碱面用。
原料加工
修整、洗涤、晾晒、切分成条状或片状
加调味料装坛
加盐
盐水冷却
泡菜盐水
发酵
成品
测亚硝酸盐含量
制作泡菜实验操作过程
① 准备白菜、萝卜、葱、辣椒、蒜等材料。
② 切好萝卜、葱、蒜泥、辣椒末等，准备往白菜芯里放。
③ 白菜切成两半后，放在盐里(水盐比４：１）一夜，第二天，用流动的水清洗，再甩干水分。
⑤ 用外层的白菜叶子包好里面的，放上一周。
④ 往盐腌过的白菜里添加第2项的材料，要均匀涂抹。
⑥ 切开发酵的泡菜，放在盘子里。
果酒 果醋 腐乳 泡菜
微生物类型
原理
反应条件
检测方法
酵母菌，真菌，兼性厌氧
醋酸菌，细菌，好氧菌
毛霉，真菌，好氧
乳酸菌，细菌，厌氧菌
酵母菌的无氧呼吸产生酒精
20℃，无氧
重铬酸钾与其反应呈灰绿色
醋酸菌的有氧呼吸产生醋酸
30~35℃，通入氧气
品尝、pH试纸检测
毛霉产生蛋白酶和脂肪酶
15～18℃接种，酒精含量控制在12％左右
乳酸菌无氧呼吸产生乳酸
常温，无氧条件
pH检测，亚硝酸盐的检测方法(共53张PPT)
选修1:生物技术实践
专题4 酶的研究与应用
知识回顾：
1、洗衣粉中添加________，可以更有效地清除顽渍。常用的酶制剂有_________________四类。
2、影响酶活性的因素有_______、
________和_________。
3、影响洗衣粉洗涤效果的因素有 _______ 。
在食品、化工、轻纺、医药等领域大规模使用酶制剂，说明酶制剂使用有很多优点，你能举出一些例子吗？
催化效率高、低能耗、低污染等。
酶制剂的使用有缺点吗？
你能举出一些例子吗？
酶制剂存在的缺陷：
1、通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易失活；
2、溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本；
3、反应后会混在产物中，可能影响产品质量。
如果你是工程技术人员，你如何解决这个问题？
阅读P49-50，并思考：
1、解决酶应用中存在问题的方法是？
2、这种方法的优点是什么？
3、什么是高果糖浆？使用它有何好处？
4、生产高果糖浆需要什么酶？其作用是什么？这种酶有何特点？
5、了解高果糖浆生产过程。
一、固定化酶的应用实例
1、固定化酶技术。即将酶固定在一定空间内的技术（如固定在不溶于水的载体上）。
2、固定化酶技术的优点：
（1）使酶既能与反应物接触，又能与产物分离；
（2）固定在载体上的酶可以被反复利用。
3、高果糖浆是果糖含量为42%左右的糖浆。作为蔗糖的替代品，高果糖浆不会像蔗糖那样诱发肥胖、糖尿病、龋齿和心血管病，对人的健康有利。
你能写出果糖的分子式吗
它属于什么糖
4、生产高果糖浆需要葡萄糖异构酶；其作用是将葡萄糖转化为果糖；这种酶稳定性好，可持续发挥作用。
你能写出方程式吗
5、固定化酶技术生产高果糖浆的图示：
注意反应柱的各部分名称。
你能说出反应柱的优点吗？
生产流程
含淀粉的浆液
α-淀粉酶
糊精
糖化酶
葡萄糖
葡萄糖异构酶
葡萄糖的异构化
42%～45%转化成果糖
果葡糖浆
果糖和葡萄糖分离
葡萄糖再次异构化
反复多次
果糖含量70%～90%
高果糖浆
反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高果糖的产量和质量。
优点：
练习：
1、下列说法不正确的是（ ）
A、葡萄糖与固定化葡萄糖异构酶接触，转化成的是果糖
B、从固定化酶反应柱下端流出的是果糖
C、高果糖浆不会像蔗糖那样诱发肥胖、糖尿病、龋齿和心血管病
D、酶溶解于葡萄糖溶液，可以从糖浆中回收
2、研究认为，用固定化酶技术处理污染物是很有前途的。如将从大肠杆菌得到的磷酸三酯酶固定到尼龙膜上制成制剂，可以用来降解残留在土壤中的有机磷农药，与用微生物降解相比，其作用不需要适宜的（ ）
A、温度 B、PH
C、水分 D、营养
3、目前，日用化工厂大量生产的酶制剂，其中的酶大都来自
A、化学合成
B、动物体内
C、植物体内
D、微生物体内
在生产实际中使用固定化酶技术有无不足 如有不足,怎么办
有。一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实际中很多产物的形成都通过一系列的酶促反应才能进行，所以操作比较麻烦。
可采用固定化细胞技术。
二、固定化细胞技术
1、概念：
利用物理或化学方法将细胞固定在一定空间的技术。
细胞中含有一系列酶，在细胞正常生命活动的过程中，通过代谢产生所需要的代谢产物。
阅读P50：思考第二段的问题
2.将酶或细胞固定化的方法
将酶（或细胞）包埋在细微网格里
将酶（或细胞）相互连接起来
将酶（或细胞）吸附在载体表面上
包埋法
化学结合法
吸附法
方法 原 理 适用对象
包埋法 将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进剂(包括交联剂)的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化 酶或细胞
方法 原 理 适用对象
化学结合法 酶蛋白的侧链基团和载休表面上的功能基团之间形成共价键而固定的方法 酶
物理吸附法 通过氢键、疏水作用和π电子亲和力等物理作用，将酶固定于水不溶载体上。从而制成固定化酶 酶
酶和细胞固定方法的选择
①酶适合采用化学结合和物理吸附法固定
②细胞适合采用包埋法固定
（1）、方法
（2）、原因
①细胞个大，酶分子很小
②个体大的细胞难以被吸附或结合而个小的酶容易从包埋的材料中漏出
3、固定化细胞常用的载体
常用的不溶于水的多孔性载体有哪些？
明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素、聚丙烯酰胺等
如果反应底物是大分子物质，能否用固定化细胞技术
为什么？
那应该采用何种技术
练习：
1.使用固定化细胞的优点是( )。
A.能催化大分子物质的水解 　
B.可催化一系列化学反应
C.与反应物易接近 　
D.有利于酶在细胞外发挥作用
2.酶的固定方法不包括( )。
A.将酶吸附在固体表面上 B．将酶相互连接起来
C．将酶包埋在细微网格里 D．将酶制成固体酶制剂，如加酶洗衣粉中的酶
3、如果反应物是大分子物质，采用那种方法催化受限制( )。
A．直接使用酶
B．使用化学方法结合的酶
C．使用固定化细胞
D．使用物理吸附法固定的酶
4、下列关于酶和细胞的固定叙述不正确的是( )。
A． 酶分子很小，易采用包埋法
B．酶分子很小，易采用化学结合或物理吸附法固定的酶
C．细胞个大，难被吸附或结合
D．细胞易采用包埋法固定
5. 关于固定化酶的叙述不正确的是 ( )。
A． 既能与反应物接触，又能与反应物分离
B．固定在载体上的酶可被反复利用
C．可催化一系列反应 D．酶的活性和稳定性受到限制
6、固定化细胞对酶的活性影响最小，根本原因是( )。
A．避免了细胞破碎、酶的提取纯化过程
B．固定化细胞在多种酶促反应中连续发挥作用
C．促化反应结束后，能被吸收和重复利用
D．细胞结构保证了各种酶在细胞内化学反应中有效的发挥作用
三、实验操作
（一）制备固定化酵母细胞
阅读P50~51思考下列问题：
（1）制备过程包括哪几个步骤？
（2）你认为哪个步骤的操作是最重要的一环？
（3）各步骤应当分别注意什么问题？
1、酵母细胞的活化
思考：
关于酵母菌你有哪些知识？
什么是活化？
怎样活化？
应注意什么？
活化：
让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态；
本质：
加快新陈代谢；
方法：
加入适量的水。
你能说出理由吗？
取1g干酵母，放入50ml的小烧杯中，加入蒸馏水10ml，用玻璃棒搅拌，使酵母细胞混合均匀，成糊状，放置1h左右使其活化
思考：
你认为酵母的活化操作有哪些注意事项？
1、所用容器要大一些；
2、要保证酵母菌的活性；
3、物种要单一；
4、注意水的用量。
2、配制物质的量浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液
称取无水Cacl2 0.83g。放入200mL的烧杯中，加入150mL的蒸馏水，使其充分溶解，待用。
3、配制海藻酸钠溶液
操作：
称取0.7g海藻酸钠，放入50mL小烧杯中.加人10mL水，用酒精灯加热，边加热边搅拌，将海藻酸钠调成糊状，直至完全溶化，用蒸馏水定容至10mL。注意，加热时要用小火，或者间断加热，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止
加热使海藻酸钠溶化是操作中最重要的一环，涉及到实验的成败，一定要按照教材的提示进行操作。海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞的质量。如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少，影响实验效果。
应当注意什么问题？
4、海藻酸钠溶液与酵母细胞混合
将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入已活化的醉母细胞，进行充分搅拌，使其混合均匀，再转移至注射器中。
为什么海藻酸钠溶液要冷却？
5、固定化酵母细胞
以恒定的速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到配制好的Cacl2溶液中，观察液滴在Cacl2溶液中形成凝胶珠的情形。将这些凝胶珠在Cacl2溶液中浸泡30 min左右。
你知道还有什么地方可以用到氯化钙？
刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。
检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下列方法：
一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。
二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。
这一阶段成功与否呢？怎样评价？
观察凝胶珠的颜色和形状:
如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。
（二）用固定化细胞发酵
1、将固定好的酵母细胞(凝胶珠)用蒸馏水冲洗2-3次。
2、 将150mL质量分数为10%的葡萄糖溶液转移到200mL的锥形瓶中，再加入固定好的酵母细胞，置于25℃下发酵24h。
这一阶段成功与否呢？怎样评价？
观察发酵的葡萄糖溶液；
利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生了很多气泡，同时会闻到酒味。
还有其他方法吗？
请思考课后练习
P52
类型 优点 不足
直接使用酶 催化效率高，低耗能、低污染等。 对环境条件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本；反应后酶会混在产物中，可能影响产品质量。
固定化酶 酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用。 一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形成都通过一系列的酶促反应才能得到的。
固定化细胞 成本低，操作更容易。 固定后的酶或细胞与反应物不容易接近，可能导致反应效果下降等。
类型 优点 不足
练习:
1、制备固定化酵母细胞的过程中错误的是（ ）
A、取干酵母，加入蒸馏水，使其活化
B、配制海藻酸钠时，加热用大火，直到海藻酸钠溶化为止
C、将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入已活化的酵母细胞
D、将凝胶珠在Cacl2溶液中浸泡30 min左右
2、下列叙述不正确的是（ ）
A、从操作角度来考虑，固定化细胞比固定化酶容易
B、固定化细胞比固定化酶对酶的活性影响更小
C、固定化细胞固定的是一种酶
D、将微生物的发酵过程变成连续的酶反应应选择固定化细胞技术(共7张PPT)
专题5
DNA和蛋白质技术
DNA的粗提取与鉴定
多聚酶链式反应扩增DNA片段
血红蛋白的提取与分离
课题1 DNA的粗提取与鉴定
课题目标:
尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取;
了解DNA的理化性质,理解DNA粗提取以及DNA鉴定的原理。
课题重点
DNA的粗提取和鉴定方法。
本节问题：
1、DNA的粗提取和鉴定根据的原理是什么？
1）DNA在NaCl溶液中的溶解度随NaCl溶液浓度的不同而不同。具体见P54图5-1。
2）利用DNA不溶于酒精但细胞中某些蛋白质溶于酒精的性质可使DNA与蛋白质分离得到初步纯化的DNA。
3）在沸水中DNA遇二苯胺呈现蓝色反应。
2、DNA粗提取的方法步骤怎样？有什么主要注意问题？
注意问题：
1)材料要选用DNA含量较高的生物组织;
2)整个实验中三次用到2mol/L的NaCl溶液;
3)酒精最好用95%的冷酒精;
4)二苯胺试剂最好现配现用,如果从冰箱取出,用时要先摇匀;
5)加蒸馏水或加入酒精用玻棒搅拌时,动作要轻缓且朝一个方向。
3、解决教材其他练习题。
反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质的原因是：
用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶于低盐溶液中的物质。
练习巩固
1、向溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液中不断加入蒸馏水,在这个过程中DNA和杂质蛋白质的溶解度变化情况分别是
A 减小;减小 B 增大;增大
C 先减小后增大 D 减小;增大
2、欲使溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液中的DNA析出，最有效的办法是
A 加蒸馏水 B 加矿泉水
C 加清水 D 加生理盐水
3、与析出DNA粘稠物有关的叙述，不正确的是
A 操作时缓慢滴加蒸馏水，降低DNA的溶解度
B 操作时用玻棒轻缓搅拌以保证DNA分子的完整
C 加蒸馏水可以同时降低DNA和蛋白质的溶解度
D 当丝状粘稠物不再增加时，NaCl溶液的浓度可以认为是0.14mol/L
4、你能采用其他方法对DNA进行鉴定吗？
1）用甲基绿染液。结果丝状呈现绿色。详见（必修1P26）(共63张PPT)
专题2 :微生物的培养与应用
微生物包括哪五类：
病毒
细菌
放线菌
真菌
原生动物
特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.且体内一般不含有叶绿素.不能进行光合作用.
原核生物界
原生生物界
真菌界
病毒界
微生物基础知识
细菌的外形与大小
细菌：单细胞不分枝的原核微生物。
细菌细胞微小而透明，通常用适当染料染色后显微镜观察
图1-1 常见的三种细菌典型形态
A.球菌 B.杆菌 C.弧菌
细菌细胞由外向里依次有鞭毛、菌（纤）毛、荚膜、细胞壁、细胞膜、细胞质，细胞质中又有液泡、储存性颗粒、核质等。
细菌的构造
图1-3 细菌的结构
*细胞壁
结构特点：坚韧且有弹性
细胞壁有哪些功能？
①固定细胞外形；
②保护细胞免受外力的损伤；
③阻拦大分子物质进人细胞；
④使细胞具有致病性及对
噬菌体的敏感性。
伤寒杆菌细胞壁中含毒素
有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌.
菌落：
单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。
菌落是鉴定菌种的重要依据。
菌落
细菌的菌落特征因种而异
放线菌
1、结构：
单细胞原核
分支状的菌丝（基内菌丝、气生菌丝）
链霉素、土霉素、四环素、
氯霉素、红霉素、庆大霉素
微生物中发现了几千种抗生素，其中2/3是
由放线菌产生的
应用:
病毒的结构
病毒
SARS病毒、 禽流感病毒
朊病毒（蛋白质病毒）
2、病毒的增殖：
真菌
如图是酵母菌电子显微镜下的形态结构
酵母菌和霉菌
青霉
生殖
直立菌丝 营养菌丝
腐生生活
孢子生殖
细菌的营养类型
根据细菌所利用的能源和碳源的不同，将细菌分为两大营养类型。
自养菌（autotroph）
异养菌（heterotroph）
腐生菌
寄生菌 大部分病原菌
了解有关培养基的基础知识，进行无菌技术的操作，进行微生物的培养。
一、课题目标：
掌握培养基的制备、高压蒸气灭菌和平板划线法等基本操作技术，熟练、规范地进行无菌操作，成功地培养微生物。
无菌技术的操作。
二、课题重点和难点：
三、技能目标：
一、基础知识：
（一）培养基
培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。
（1）按物理状态来分：培养基可分为固体培养基和液体培养基。其中固体培养基用于菌种分离、鉴定菌落等。
（2）按功能来分，可分为选择培养基和鉴别培养基。
（3）按成分来分，可分为天然培养基和合成培养基。
1.培养基的类型和用途
2.不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方 (参考教材附录内容)
3.不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、和氮源、 无机盐、等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质,例如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。
选择培养基
加入青霉素的培养基:
分离酵母菌、霉菌等真菌
加入高浓度食盐的培养基:
分离金黄色葡萄球菌
不加氮源的无氮培养基:
分离固氮菌
不加含碳有机物的无碳培养基:
分离自养型微生物
加入青霉素等抗生素的培养基:
分离导入了目的基因的受体细胞加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基:
分离杂交瘤细胞
根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。
合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。
优点：标准化生产，组分和含量相对固定;成本低
缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。
合成培养基:
天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。
优点：营养成分丰富，培养效果好
缺点：来源受限;成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析;易发生支原体污染;
天然培养基：
血清中含有：
①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）
②多种金属离子；
③激素；
④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。
⑤各种生长因子
⑥转移蛋白
⑦不明成分
人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。
液体培养基：
表面生长
均匀混浊生长
沉淀生长
固体培养基：菌落，菌苔
半固体培养基：
无动力 有动力(弥散)
(是否运动)
4.培养基的用途
液体培养基：增菌
固体培养基：纯化，增菌
半固体培养基：动力检测，保种
（二）无菌技术
1.无菌技术的概念
无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。无论是随后将要学到的倒平板、平板划线操作，还是平板稀释涂布法，其操作中的每一步都需要做到“无菌”，即防止杂菌污染。只有熟练、规范地进行无菌操作，才可能成功地培养微生物。
　（１）消毒定义：
　　利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。区分为高程度消毒（High-level Disinfection）、中程度消毒（Intermediate-level Disinfection）、低程度消毒（Low-level Disinfection）三种方式。
2.消毒与灭菌的概念及两者的区别
　　（2）灭菌的定义：
　　以化学剂或物理方法消灭所有微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌之过程。 灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。
1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min
2、巴氏消毒法：70-75 ℃下煮30min或 80 ℃ 下煮15min
3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源
4、紫外线消毒
……
(1)消毒的方法：
3.常用的消毒与灭菌的方法
1、灼烧灭菌
2、干热灭菌：160-170 ℃下加热1-2h。
3、高压蒸气灭菌：100kPa、121 ℃下维持15-30min.
(2)灭菌的方法：
最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。
有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。
而平皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。
分类 定义 方法
灭菌法
杀灭一切微生物 物理法：热力、辐射、微波、等离子体
化学法：醛类、烷化剂
高效消毒法 杀灭一切致病微生物 紫外线、含氯剂、臭氧、复配剂等
中效消毒法 杀灭除芽孢外的致病微生物 超声波、碘类、醇类、酚类
低效消毒法 杀灭细菌繁殖体、亲脂病毒 单链季胺盐、双胍类、中草药、金属离子
无菌技术
3.微生物实验室培养的基本操作程序
1、器具的灭菌
2、培养基的配制
3、培养基的灭菌
4、倒平板
5、微生物接种
6、恒温箱中培养
7、菌种的保存
1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？
2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。
（1） 培养细菌用的培养基与培养皿
（2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管
（3） 实验操作者的双手
答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。
答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。
三、实验操作
1.制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）
1．计算、称量
2．溶化
3．调pH：　pH7．6　
4．过滤：这一步可以省去。
5．分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。
6．加塞
7．包扎
操作步骤
8．灭菌:
将50ml培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121℃，灭菌15～30min。将培养皿用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在160～170 ℃下灭菌2h。
9．倒平板:
待培养基冷却到50 ℃左右时，在酒精灯附近倒平板。（倒平板操作见课本）2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种.
10．无菌检查：
将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。
倒平板技术
1.培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？
答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。
2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。
2、纯化大肠杆菌
接种方法有：
平板划线法和稀释涂布平板法
平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌钟逐步稀释分散到培养基的表面.
在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.
微生物的接种技术
1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
答：以免接种环温度太高，杀死菌种。
3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？
应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。
微生物的恒温培养
微生物的恒温培养
微生物的恒温培养
菌种的保存
1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4℃冰箱保存。
2、长期保存：甘油冷冻管藏法
四、课题成果评价
（一）培养基的制作是否合格
如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。
（二）接种操作是否符合无菌要求
如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。
（三）是否进行了及时细致的观察与记录
培养12 h与24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯。
本课题知识小结:
【典例解析】
例1．关微生物营养物质的叙述中，正确的是
A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量
C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量
解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于A、B选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；NaHCO3，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。
答案：D
例2．下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是
A.防止杂菌污染 B.消灭杂菌
C.培养基和发酵设备都必须灭菌
D.灭菌必须在接种前
B
解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是正确的；B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。C是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。
编号 成分 含量
① 粉状硫 10g
② （NH4）2SO4 0.4g
③ K2HPO4 4.0g
④ MgSO4 9.25g
⑤ FeSO4 0.5g
⑥ CaCl2 0.5g
⑦ H2O 100ml
例3．右表是某微生物培养基成分，请据此回答：
（1）右表培养基可培养的微生物类型是 。
（2）若不慎将过量NaCl加入培养基中。
如不想浪费此培养基，可再加入 .
自养型微生物
含碳有机物
（3）若除去成分②，加入（CH2O），该培养基可用于培养 。
（4）表中营养成分共有 类。
（5）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是 。
（6）右表中各成分重量确定的原则是 。
（7）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分是 。
固氮微生物
3
调整pH
依微生物的生长需要确定
琼脂（或凝固剂）(共17张PPT)
思考：通过课题背景分析，你有何体会？
酶： 优点：摧化效率高，低耗能，低污染
实际问题：对环境条件敏感，易失活；溶液中的酶 很难收回，不能被再次利用，提高了生产成本；
反应后酶混在产物中，如不去除，会影响产品的品质
设想：将酶固定在不容于水的载体上
固定化酶：优点：酶即能与反应物接触，又容易与反应物分离，同时，还可以反复利用
实际问题：一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形成都是通过一系列的酶促反应才能完成的
设想：酶是细胞合成的，能否将合成酶的细胞直接固定？
固定化细胞：成本低，操作更容易
一、课题目标
1．说出固定化酶和固定化细胞的作用和原理。
2．尝试制备固定化酵母细胞，并利用固定化酵母细胞进行酒精发酵。
思考：1、如何利用固定化酶生产高果糖浆的？
2、有哪些优点？
3、固定化酶的方式有哪些？
阅读教材P50，解决以下问题：
（1）参照固定化酶，给细胞固定化下个定义
（2）细胞固定化的常用方法
（3）固定化细胞技术有哪些优势？
（4）如果想把微生物的发酵过程变成连续的酶反应，应该选择哪种技术？如果反应物是大分子物质，又应该采用哪种方法？
（5）一般来说，酶更适合用吸附法和交联法固定，而细胞多采用包埋法固定，想想看为什么？
思考：直接使用酶、固定化酶与固定化细胞各有什么优缺点？
类型 优点 不足
直接使用酶 催化效率高，低耗能、低污染等。 对环境条件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本；反应后酶会混在产物中，可能影响产品质量。
固定化酶 酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用。 一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形成都通过一系列的酶促反应才能得到的。
固定化细胞 成本低，操作更容易。 固定后的酶或细胞与反应物不容易接近，可能导致反应效果下降等。
课堂讨论：
1．从操作角度来考虑，你认为固定化酶技术与固定化细胞技术哪一种方法更容易？哪一种方法对酶活性的影响更小？
2．固定化细胞固定的是一种酶还是一系列酶？
3．如果想将微生物的发酵过程变成连续的酶反应，应该选择哪种方法？
4．如果反应物是大分子物质，又应该选择哪种方法？
固定化细胞技术
固定化细胞固定的是一系列酶
固定化细胞技术
固定化酶技术
在缺水的状态下，微生物会处于休眠状态。活化就是让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态。酵母细胞所需要的活化时间较短，一般需要0.5～1 h，教师需要提前做好准备。此外，酵母细胞活化时体积会变大，因此活化前应该选择体积足够大的容器，以避免酵母细胞的活化液溢出容器外。
三．实验操作
（一）制备固定化酵母细胞
1．酵母细胞的活化
思考：1、什么叫酵母细胞的活化？
2．配制物质的量浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液
思考：2、配制物质的量浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液有什么作用？
3．配制海藻酸钠溶液
思考：①配制的海藻酸钠溶液具体作用是什么？
②在加热的过程中，为什么要用小火，或者间断加热？
包埋酶或细胞
防止焦糊
4．海藻酸钠溶液与酵母细胞混合
5．固定化酵母细胞
思考：①为什么刚形成的凝胶珠要在CaCl2溶液中浸泡30min左右？
②如何检验凝胶珠的质量是否合格？
形成稳定的凝胶珠
说明：刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下列方法。一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。
（二）用固定化酵母细胞发酵
问题思考：发酵时为什么要将温度控制在25℃？
四．实验操作结果分析与评价
1．观察凝胶珠的颜色和形状
问题思考：①如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，则说明什么？
②如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明什么？
如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。
2．观察发酵的葡萄糖溶液
问题思考：当观察到哪些现象时，可说明实验获得成功？为什么？
利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生了很多气泡，同时会闻到酒味。
3、固定化酶和固定化细胞技术有哪些？各有什么优缺点？固定化细胞常用的载体有哪些？
有包埋法、化学结合法和物理吸附法。
固定化酶分子小更适合采用化学结合法和物理吸附法，用包埋法却容易从包埋材料中漏出。固定化细胞因细胞大不易被吸附或结合适宜采用包埋法。
常用载体：明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。
4、固定化酶和固定化细胞的原理是什么？
就是将酶固定在不溶于水的载体上，或者将微生物细胞均匀地包埋于不溶于水的多孔性载体上，使酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用的技术。
巩固练习
1、酶固定化技术与细胞固定化技术的关系是
A 酶固定化技术是细胞固定化技术的基础
B 细胞固定化技术是酶固定化技术的基础
C 酶固定化技术与细胞固定化技术是同时发展起来的
D 固定化细胞技术先于酶固定化技术
2、固定化酶技术常采用
A 包埋法 B 化学结合和物理吸附法
C 活化法 D 微囊化法
3、海藻酸钠在水中溶解的速度较慢，需要经过加热促进其溶解，采用的最好加热方法是
A 快速加热 B 持续高温加热
C 小火间断加热 D 灼烧加热
4、酵母菌的活化是指
A 让酵母细胞恢复运动状态
B 让酵母细胞在缺水状态下更容易休眠
C 让酵母细胞内酶活性加倍
D 让处于休眠状态的酵母细胞重新恢复正常的生活状态
5、细胞固定化技术与酶固定化技术相比，所具备的特点是
A 成本更低、操作更容易、不能连续性生产
B 成本更高、操作更难、不能连续性生产
C 成本更低、操作更容易、能连续性生产
D 成本更低、操作更难、能连续性生产(共55张PPT)
专题2 :微生物的培养与应用
微生物包括哪五类：
病毒
细菌
放线菌
真菌
原生动物
原核生物界
原生生物界
真菌界
病毒界
1、培养基可以分为哪两类？
2、培养基一般都含有哪些营养物质，此外
还要满足哪些要求？
3、获得纯净培养物的关键是什么？
4、避免杂菌污染的方法主要包括哪四个方面
5、什么是消毒、灭菌，常用方法有哪些？
6、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的方法步骤
7、如何倒平板？
（1）按物理状态来分：培养基可分为固体培养基和液体培养基。其中固体培养基用于菌种分离、鉴定菌落等。
（2）按功能来分，可分为选择培养基和鉴别培养基。
（3）按成分来分，可分为天然培养基和合成培养基。
培养基分类：
选择培养基
加入青霉素的培养基:
分离酵母菌、霉菌等真菌
加入高浓度食盐的培养基:
分离金黄色葡萄球菌
不加氮源的无氮培养基:
分离固氮菌
不加含碳有机物的无碳培养基:
分离自养型微生物
加入青霉素等抗生素的培养基:
分离导入了目的基因的受体细胞
不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、和氮源、 无机盐等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质,例如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。
培养基的营养物质
2、培养基一般都含有哪些营养物质，此外
还要满足哪些要求？
3、获得纯净培养物的关键是什么？
4、避免杂菌污染的方法主要包括哪四个方面
5、什么是消毒、灭菌，常用方法有哪些？
消毒与灭菌
消毒：指使用较为温和的物理或化学方法
仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害
的微生物（不包括芽孢和孢子）。
灭菌：指使用强烈的理化因素杀死物体内
外所有微生物，包括芽孢和孢子。
灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。
消毒的方法：
1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min
2、巴氏消毒法：70-75 ℃下煮30min或 80 ℃ 下煮15min
3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源
4、紫外线或化学药物消毒
灭菌的方法：
1、灼烧灭菌
2、干热灭菌：160-170 ℃
下加热1-2h。
3、高压蒸汽灭菌：100kPa、
121 ℃下维持15-30min.
6、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的方法步骤
7、如何倒平板？
1.培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？
答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。
2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。
纯化大肠杆菌
接种方法有：
平板划线法和稀释涂布平板法
平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌钟逐步稀释分散到培养基的表面.
在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.
微生物的恒温培养
1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
答：以免接种环温度太高，杀死菌种。
3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？
应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。
菌种的保存
1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4℃冰箱保存。
2、长期保存：甘油冷冻管藏法
课题2
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
一、课题背景
1、尿素的利用
尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。
2、细菌利用尿素的原因
土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶
CO(NH2)
脲酶
+ CO2
NH3
+ H2O
4、课题目的
①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌
②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样
的细菌
一.研究思路
㈠.筛选菌株
㈡.统计菌落数目
㈢.设置对照
1、实例：
启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的
要求，到相应的环境中去寻找。
原因：因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大多
数微生物只有Taq细菌被筛选出来。
DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。
㈠.筛选菌株
2、实验室中微生物的筛选原理：
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
什么是选择性培养基？
15.0g
琼脂
1.0g
尿素
10.0g
葡萄糖
0.2g
MgSO4`7H2O
2.1g
NaH2PO4
1.4g
KH2PO4
3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：
①从物理性质看此培养基属于哪类？
固体培养基
②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？
碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素
培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。
5、培养基选择分解尿素的微生物的原理
6、怎样证明此培养基具有选择性呢？
以尿素为
唯一氮源
的培养基
牛肉膏
蛋白胨
培养基
是
分离
尿素
细菌
判断该
培养基
有无选
择性
实验组
对照组
培养基类型
是否
接种
目的
结果
只生长尿素细菌
生长多种微生物
是
6、怎样证明此培养基具有选择性呢？
以尿素为
唯一氮源
的培养基
牛肉膏
蛋白胨
培养基
是
分离
尿素
细菌
判断该
培养基
有无选
择性
实验组
对照组
培养基类型
是否
接种
目的
结果
只生长尿素细菌
生长多种微生物
是
1、显微镜直接计数：
利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。
㈡.统计菌落数目：
不能区分死菌与活菌；
不适于对运动细菌的计数；
需要相对高的细菌浓度；
个体小的细菌在显微镜下难以观察；
缺点
2.间接计数法（活菌计数法）
⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。
⑵常用方法：稀释涂布平板法。
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。
注意事项
①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。
②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。
③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。
设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。
㈢.设置对照：
实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌
落数目的实验时，A同学从对应的106
倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌
落，但是其他同学在同样的稀释度下
只选择出大约50个菌落。分析其原因。
原因：⑴土样不同，
⑵培养基污染或操作失误
(或者是混入了其他的含氮物质)
小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。
方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验
方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。
结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。
二.实验的具体操作
㈠.土壤取样
从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。
◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。
㈡.制备培养基：
制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。
◆应在火焰旁称取土壤10g。
◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行
[三]样品的稀释
㈣.取样涂布
◆实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。
㈣.取样涂布
◆分离不同的微生物采用不同的稀释度
稀释倍数 目的
细菌 104、105、106 保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板
放线菌 103、104、105
真菌 102、103、104
原因：不同微生物在土壤中含量不同
㈤.微生物的培养与观察
思考：要将哪些培养皿进行培养？
㈤.微生物的培养与观察
在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
培养不同微生物往往需要不同培养温度。
细菌：30～37℃培养1～2d
放线菌：25～28℃培养5～7d
霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。
◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。
微生物的培养与观察
三.结果分析与评价
1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。
2.提示：选择每个平板上长有30—300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。
四、操作提示
无菌操作
做好标记
规划时间
五.课外延伸
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。
测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝 培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。
大肠杆菌呈 黑色中心 ,有或无金属光泽
大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征
本课题知识小结:
根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。
合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。
优点：标准化生产，组分和含量相对固定;成本低
缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。
合成培养基:
天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。
优点：营养成分丰富，培养效果好
缺点：来源受限;成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析;易发生支原体污染;
天然培养基：(共24张PPT)
植物组织培养技术
组织培养概述
1.组织培养定义
组织培养是指用无菌方法使植物体的离体器官、组织和细胞在人为提供的条件下生长和发育的所有培养技术的总称，也称之为离体培养。
2.组织培养的发展
　　植物组织培养是二十世纪发展起来的新技术。 它的发展经历了四个发展阶段：
（一）萌芽阶段（从20世纪初到30年代中）：
1902年德国植物生理学家Haberlandt提出细胞全能性概念，并首次进行离体细胞培养，但没有成功。
1904年，Hanning 最先成功地培养了萝卜和辣根菜的胚。1922年，Knudson 采用胚培养法获得大量兰花幼苗。
（二）奠基阶段（从20世纪30年代末到50年代中）：
1934年，White 用番茄根尖建立起第一个活跃生长的无性繁殖系，从而使非胚器官的培养首先获得成功。
1939年，Gautherete培养胡萝卜根小外植体成功。
1943年，White提出了植物细胞“全能性”学说，标志组织培养成为一门新兴学科。
1952-1953年：美国科学家Steward F.C. 用胡萝卜根的细胞悬浮培养，发现单个细胞能象受精卵发育成胚一样的途径，发育成完整植抹。证实了植物细胞“全能性”学说。
（三）快速发展和应用阶段（从20世纪50年代末到现在）
1960年以来组织培养理论、实践、技术和方法不断完善和发展，并广泛应用于生物学的许多分支学科。
1960年，Cocking酶解法分离原生质体获得成功，使植物细胞可以象动物细胞一样进行细胞融合。
1960年，Morel等人通过对兰花茎尖进行培养，获得了快速繁殖的脱毒兰花，随后在国内外进行了“兰花试管苗产业化”。
1964年，印度学者Guha和Maheshwari成功地培养曼陀罗花药获得单倍体再生植株，从而促进了植物花药培养单倍体育种技术的发展。
3.植物组织培养的基础理论
――植物细胞的全能性
定义：植物细胞具有该植物体全部遗传的可能性，在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。
原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因，从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具有全能性。
差异：（1） 受精卵的全能性最高；
（2） 受精卵分化后的细胞中，体细胞
的全能性比生殖细胞的低。
植物全能性
的表达
离体的植物器官、组织、细胞
游离单细胞或原生质体
胚状体
根、芽
愈伤组织
人工种子
再生植株
脱分化
培养条件：基本培养基和适宜的植物生长调节物质，适宜的温度、空气、无菌环境、适合的PH、适时光照等。
脱分化：将分化组织的已停止分裂的细胞从植物体部分的抑制性影响下解脱出来，恢复细胞的分裂活性。
再分化：经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下可有转变为各种不同细胞类型的能力。
4.植物组织培养分类
愈伤组织培养
细 胞 培 养
器 官 培 养
原生质体培养
最为常见的组织培养
悬浮细胞培养
单细胞培养
胚、胚乳、珠心、子房、根、茎、叶、花和幼果的部分组织的培养
按材料的类别分
⑴愈伤组织培养
将外植体接种在人工培养基上，由于植物生长调节剂的存在，而其细胞脱分化形成愈伤组织，然后通过再分化形成再生植株。它是最为常见的。
⑵器官培养：
将植物的器官如胚、胚乳、珠心、子房、根、茎、叶、花和幼果的部分组织接种在无菌培养基上进行培养。
⑶细胞和原生质体培养：
细胞培养是将植物的单个细胞分离出来，并进行培养，而原生质体培养是指将植物细胞的细胞壁通过机械、物理或化学的方法去除，然后再进行培养。
原球茎----主要是兰科植物在诱导时，分化出的原初植物形态，具有完整植株的器官雏形，成苗容易。
胚状体-----由愈伤组织或表面形成的许多类似胚的突起，是初步分化的幼小生命体，芽根有共同的维管束，是双极性结构，起源于单细胞，无嵌合现象，结构完整，可直接形成小植株，成苗率高，去分化难，再分化也很难。
胚状体与不定芽的区别
胚状体在组织学上具备以下和不定芽不同的三个特征：
①最根本的特征是具有两极性。
②胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系，而不定芽或不定根往往总是与愈伤组织的维管组织相联系。
③胚状体的维管组织的分布是独立的“v”字形，而不定芽的维管组织无此现象。
按培养方法分为
固体培养 液体培养
看护培养 微室培养
初代培养
继代培养
按培养过程分为
初代培养
继代培养
5.植物组织培养应用
⑴快速繁殖：
运用组织培养的途径，一个单株一年可以繁殖几万到几百万个植株，而且均来自一单一的个体，遗传性状一致。例如一株葡萄一年繁殖到3万多株，一株兰花一年繁殖到400万株。
　　⑵种苗脱毒：由于病毒的感染严重影响作物的产量和品质，而利用组织培养技术可以有效地除去植物体内的病毒，得到大量的无病毒种苗。主要的方法是培养植物茎尖分生组织，也可以采用热处理或加入化学试剂的方法达到脱毒的效果。已经取得成功的有马铃薯、草莓、香蕉、葡萄等等。
⑶远缘杂交：
利用组织培养可以使难度很大的远缘杂交取得成功，从而育成一些罕见的新物种。
potato
tomato
pomato
泡马豆
　　⑷突变育种：采用组织培养可以直接诱变和筛选出具抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种 　　⑸基因工程：基因工程主要研究DNA的转导，而基因转导后必须通过组织培养途径才能实现植株再生
⑹生物制品：有些极其昂贵的生物制品，可以用大规模培养植物细胞来直接生产
⑺种质保存：繁殖量大，省空间，保存时间长(共19张PPT)
一、课题目标
说出被子植物花粉发育的过程及花药培养产生花粉植株的两种途径，说出影响花药培养的因素，学习花药培养的基本技术，尝试用月季或其他植物的花药进行培养。
二、课题重点与难点
课题重点：选取适宜的培养材料和培养基。
课题难点：选取适宜的培养材料和培养基。
基础知识
（一）被子植物的花粉发育
被子植物的花的结构是怎样的？
观察下图，和减数分裂比较，你能指出对应的时期吗？又有何特点？
被子植物的花粉发育
雌蕊：
花丝
花药：囊状结构，内有很多花粉粒
花粉是小孢子母细胞经过减数分裂而形成的，因此，花粉是单倍体的生殖细胞。
花粉的发育要经历：四分体时期、单核期、双核期
注意：
①二核花粉粒：成熟的花粉粒中，只含花粉管细胞核和生殖细胞核。（精子在花粉管中形成）
②三核花粉粒：有些植物的花粉，在成熟前，生殖细胞进行一次有丝分裂，形成两个精子，这样的花粉在成熟时，含有一个营养核和两个精子。
③两个精子和一个营养核的基因型相同。
④1花粉母细胞
4个小孢子
减分
有分
4个花粉管细胞核
4个生殖细胞核
有分
8个精子
人工种子
　　又称人造种子、合成种子或无性种子，就是将组织培养所产生的体细胞胚、不定芽、顶芽、腋芽或小鳞茎等繁殖体，包裹在能提供营养的胶囊（人造胚乳）里，再在外面包上一层具有保护功能和防止机械损伤的外膜（人造种皮），造成一种类似种子的结构，能在一定的条件下萌发生长，形成完整植株。
（二）产生花粉植株的两种途径
有哪两种途径？原因是什么？
花药中的花粉
花药中的花粉
胚状体
愈伤组织
丛芽
丛芽
生根
移栽
花药培养产生花粉植株的两种途径
（三）影响花药培养的因素
1、材料的选择
不同植物
同一植物的不同生理状况（花期早期－初花期）
合适的花粉发育期（单核居中期与靠边期之间）
此外，植株生长条件、材料低温预处理、接种密度等
2、培养基的组成
材料的选择：
花期早期时的花药比后期的更容易产生花粉植株。一般，月季的花药培养时间选在五月初到五月中旬，即月季的初花期。
选择合适的花粉发育时期也是提高诱导成功率的重要因素。一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养成功率最高。
为了挑选到单核期的花药，通常选择完全未开放的花蕾。
为什么花瓣松动会给材料的消毒带来困难？
答：花瓣松动后，微生物就可能侵入到花药，给材料的消毒带来困难。
实验操作
（一）材料的选取
染色镜检
（二）材料的消毒
酒精、氯化汞、次氯酸钙
（三）接种和培养
结果分析与评价
（一）材料的选取
选择花药时，一般通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期。
最常用的方法有醋酸洋红法。但是，某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙花青-铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色。
（二）材料的消毒
1、花蕾用V/V为70%的酒精浸泡30秒
2、无菌水清洗
3、无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分
4、放入质量分数为0.1%的氯化汞溶液中2~4分钟（也可质量分数为1%的次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液）
5、无菌水冲洗3~5次
用于培养花药，实际上多数未熟，由于它的外面有花萼、花瓣或颖片保护，通常处于无菌状态，所以只要将整个花蕾或幼穗消毒即可。
（三）接种和培养
灭菌后花蕾，要在无菌条件下除去萼片和花瓣，并立即将花药接种到培养基上。在剥离花药时，要尽量不损伤花药（否则接种后，容易从受伤部位产生二倍体的愈伤组织），同时还要彻底去除花丝，因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成。
通常每瓶接种花药7-10个，温度控制在25℃左右，不需要光照。幼小植株形成后才需要光照。
一般经过20-30天培养后，会发现花药开裂，长出愈伤组织或释放出胚状体。将愈伤组织及时转移到分化培养基上，以便进一步分化出再生植株。
如果花药开裂释放出胚状体，则一个花药内就会产生大量幼小植株，必须在花药开裂后尽快将幼小植株分开，分别移植到新的培养基上，否则这些植株将很难分开。
在花药培养中，特别是通过愈伤组织形成的花粉植株，常常会出现染色体倍性的变化。（主要原因是营养核和生殖核融合造成的。）
植物组织培养技术与花药培养技术的异同点
项目 相同点 不同点
植物组织培养　　　　技术 离体的植物组织经脱分化形成愈伤组织，再分化成丛芽，诱导出根，然后进行移栽。 外植体为体细胞，染色体数无需加倍。
花药培养技术 取材为花药，培养的为单倍体幼苗，植株弱小，高度不育，必须用秋水仙素处理，使染色体加倍，恢复正常植株的染色体数，而且为纯种。
三、课题背景分析
课题背景介绍了花药培养的历史以及花药培养在育种工作上的意义。有条件的话可以 尝试某种植物的花药培养。
被子植物的花粉发育
知识要点：1.花粉是单倍体生殖细胞；2.花粉的发育要经历不同的时期。
产生花粉植株的两种途径
知识要点：花药培养产生花粉植株的两种途径。
影响花药培养的因素
知识要点：选取适宜的材料和培养基组成是花粉植株诱导成功的关键。
练习1.
答：F2代紫色甜玉米的基因型组成可能为Aasusu或AAsusu。如果运用常规育种方法，将F2代中的紫色甜玉米与白色甜玉米（aasusu）进行测交，可以选择出基因型为AAsusu纯种紫色甜玉米。但这种方法比较繁琐，耗时也较长，需要至少三年的选种和育种时间。如果利用花药培养的技术，在F1代产生的花粉中就可能有Asu的组合，再将花粉植株进行染色体加倍，就可以直接得到紫色甜玉米的纯合体（AAsusu）。这种方法可以大大缩短育种周期。
练习2.
答：植物组织培养技术与花药培养技术的相同之处是：培养基配制方法、无菌技术及接种操作等基本相同。
两者的不同之处在于：花药培养的选材非常重要，需事先摸索时期适宜的花蕾；花药裂开后释放出的愈伤组织或胚状体也要及时更换培养基；花药培养对培养基配方的要求更为严格。这些都使花药培养的难度大为增加。(共36张PPT)
专题3
植物组织培养技术
一、基础知识
课题1：
菊花的组织培养
1、植物的组织培养
（1）细胞的分化
①概念：
在个体发育中，相同细胞的后代在形态、结构、生理功能上发生稳定性差异的过程
②过程：
如：受精卵增殖、生长、分化形成组织、器官、系统
③特点：
（2）稳定性：
（3）全能性：
（1）持久性：
是一种持久性的变化，它发生在生物体的整个生命过程中,在胚胎期达到最大限度
细胞分化是稳定的，一般是不可逆转的
已分化的细胞，仍具有发育的潜能
⑤原因：
基因在特定的时间和空间条件下的选择性表达的结果
④结果：
形成不同的细胞和组织
（2）细胞的全能性
①定义：
生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能的特性
②原理：
生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因
高度特化的动物细胞，从整个细胞来说，全能性受到限制。但它的细胞核仍然保持着全能性，这是因为细胞核内含有该物种遗传性所需要的遗传物质
已分化的植物细胞，仍具有全能性
③实例
受精卵>生殖细胞>体细胞
④全能性的比较:
（3）植物组织培养
细胞离体
①必要条件：
一定的营养物质、激素和其他外界条件
②原理:
细胞的全能性
外植体：从活植物体上切下进行培养的那部分细胞、组织或器官
③相关概念:
脱分化：
再分化：
愈伤组织:细胞排列疏松而无规则,是高度液泡化的、成无定形状态的薄壁细胞
人参的愈伤组织
菠萝的愈伤组织
2、影响植物组织培养的因素
（1）植物材料的选择
烟草和胡萝卜的组织培养较为容易
枸杞愈伤组织的芽诱导比较难
同一植物材料的年龄、保存时间的长短会影响实验结果
菊花的组织培养一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝
（2）不同的离体组织和细胞对营养、环境等条件的要求相对特殊，需配置不同的培养基
MS培养基主要成分包括：
A、大量元素: N、P、 S 、 K、Ca、Mg等
B、微量元素:B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、
Co等
C、有机物、植物激素
讨论：你能说出各种营养物质的作用吗？同专题2中微生物培养基的配方相比，MS培养基的配方有哪些明显的不同？
答：微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，同时能够维持细胞的渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。微生物培养基以有机营养为主。与微生物的培养不同，MS培养基则需提供大量无机营养，无机盐混合物包括植物生长必须的大量元素和微量元素两大类。
①常用的植物激素：生长素、细胞分裂素和赤霉素
生长素类：
2，4－二氯苯氧乙酸（2，4－D）、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）
细胞分裂素类：
激动素（KT）、6－苄基嘌呤（ 6－BA）、玉米素（ZT）
赤霉素类：
赤霉酸（GA3）
（3）植物激素的影响
②生长素和细胞分裂素作用
植物中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强的趋势
使用顺序 实验结果
先使用生长素，后使用细胞分裂素 有利于细胞分裂，但不利分化
先使用细胞分裂素后使用生长素 细胞既分裂也分化
同时使用 分化频率高
生长素
细胞分裂素：
>
有利于根的分化
生长素
细胞分裂素：
<
有利于芽的分化，抑制根的分化
生长素
细胞分裂素：
＝
促进愈伤组织生长
③生长素和细胞分裂素同时使用，用量的比例对植物细胞发育方向的影响
（4）pH、温度、光照
pH控制在5.8左右，温度控制在18－22。C,每日用日光灯照射12h
3、植物组织培养过程:
离体组织或细胞
植物体
脱分化
细胞分裂素≈生长素
愈伤组织
芽
根
细胞分裂素>生长素
细胞分裂素<生长素
再分化
植物细胞培养
不需要光
需要光
1、培育无病毒植株
2、 培养紫草愈伤组织,提取紫草素（治疗烫伤和割伤的药物以及染料和化妆品的原料）
4、基因工程中亦需用到植物组织培养的方法
4、植物组织培养的应用：
3、诱导离体的植物组织形成具有生根发芽能力的胚状结构，包裹上人造种皮，制成人工种子，可以解决有些作物品种繁殖能力差，结子困难或发芽率低等问题
人工种子
二、实验操作
（一）制备MS固体培养基
MS培养基包括20多种营养成分，实验室一般使用4。C保存配制好的培养基母液来制备
1、配置各种母液
①无机物中大量元素浓缩10倍，微量元素浓缩100倍，常温保存
②激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可按1mg/ml的质量浓度单独配制成母液
③用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩倍数，计算用量
2、配置培养基
分装到锥形瓶中，每瓶分装50ml或100ml
① 配制培养液
② 调PH
③培养基的分装
由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此不必添加植物激素
3、灭菌
分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌
1、选材：菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝
（二）外植体消毒
2、消毒
①流水冲洗
菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min左右
② 酒精处理
用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为70％的酒精中摇动2－3次，持续6－7s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗
③消毒液处理
取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入质量分数为0.1％的氯化汞溶液中1－2min，取出后在无菌水中至少清洗3次，漂净消毒液
（三）接种
污染的主要来源是空气中的细菌和孢子，接种室消毒是至关重要的。用70％的酒精喷雾使空气消毒， 酒精或新洁尔灭搽洗工作台并用紫外线照射20分钟
1、接种室消毒
2、无菌操作要求
操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。
3、材料的切取和接种
4、接种注意事项
①每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为75％的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种
②外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜3－4块，菊的茎或叶6－8块，也不要太少，以充分利用培养基中的营养成分和光照条件
③插入时应注意方向，不要倒插。茎段、茎尖基部插入培养基利于吸收水分和养分
思考：你打算做几组重复？你打算设置对照实验吗？
答：每种材料或配方至少要做一组以上的重复。设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养，用以说明培养基制作合格，没有被杂菌污染。
（四）培养
1、愈伤组织的培养
从接种外植体到出现愈伤组织需经过2周时间。2周之内可以看到外植体上逐渐长出乳白色或黄白色的瘤状愈伤组织。首次培养愈伤组织时，恒温箱的门应该关闭不必见光，因为在无光条件下愈伤组织长的更快。2周后，培养基成分接近耗尽，必须更换培养基，进行继代培养
继代培养所用的培养基与培养愈伤组织的相同，在严格的无菌条件下，将愈伤组织连同原来的外植体一起移到新培养基上。愈伤组织的继代培养一代为20d。如果延长时间，培养基中营养物质减少，外植体会分泌有毒物质，造成自身中毒。如果愈伤组织长到直径为1－1.5cm时，就可以进行试管苗培养，否则还需进行第二代继代培养
2、愈伤组织的继代培养
在愈伤组织继代培养期间，将恒温箱的门打开，让愈伤组织见光，愈伤组织见光后颜色可以转为绿色
3、试管苗的培养
当愈伤组织长到一定大小后，可以更换培养基，进行试管苗的见光培养
（五）移栽
移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日
1、打开封口膜
2、清洗转移
用流水清洗根部的培养基，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间
（六）栽培
3、移栽
珍珠岩：固体基质型，含水量高、蓄水性强、透性好，适合栽培
幼苗长壮后，移栽到土壤中
幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花
三、课题延伸
1、一般来说，容易进行无性繁殖的植物，也容易进行组织培养
2、实例：芦荟、豆瓣绿、秋海棠、月季(共13张PPT)
月季的花药培养
基础知识：
（一）、被子植物的花粉发育
（二）、产生花粉植株的两条途径
（三）、影响花药培养的因素
被子植物的花粉发育
雄蕊：
花丝
花药：囊状结构，内有很多花粉粒
花粉是小孢子母细胞经过减数分裂而形成的，因此，花粉是单倍体的生殖细胞。
花粉的发育要经历：四分体时期、单核期、双核期
注意：
①二核花粉粒：成熟的花粉粒中，只含花粉管细胞核和生殖细胞核。（精子在花粉管中形成）
②三核花粉粒：有些植物的花粉，在成熟前，生殖细胞进行一次有丝分裂，形成两个精子，这样的花粉在成熟时，含有一个营养核和两个精子。
③两个精子和一个营养核的基因型相同。
④
1花粉母细胞
4个小孢子
减分
有分
4个花粉管细胞核
4个生殖细胞核
有分
8个精子
产生花粉植株的两条途径
花粉
花粉
胚状体
愈伤组织
从芽
从芽
生根
移栽
脱分化
分化
再分化
诱导
人工种子
又称人造种子、合成种子或无性种子，就是将组织培养所产生的体细胞胚、不定芽、顶芽、腋芽或小鳞茎等繁殖体，包裹在能提供营养的胶囊（人造胚乳）里，再在外面包上一层具有保护功能和防止机械损伤的外膜（人造种皮），造成一种类似种子的结构，能在一定的条件下萌发生长，形成完整植株。
影响花药培养的因素
一、材料的选择：
花期早期时的花药比后期的更容易产生花粉植株。一般，月季的花药培养时间选在五月初到五月中旬，即月季的初花期。
选择合适的花粉发育时期也是提高诱导成功率的重要因素。一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养成功率最高。
为了挑选到单核期的花药，通常选择完全未开放的花蕾。
培养基的组成
小麦中为N6，马铃薯、月季中为MS，油菜中为B5培养基
实验操作
一、材料的选取
二、材料的消毒
三、接种和培养
（一）材料的选取
选择花药时，一般通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期。
最常用的方法有醋酸洋红法。但是，某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙花青-铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色。
（二）材料的消毒
1、花蕾用V/V为70%的酒精浸泡30秒
2、无菌水清洗
3、无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分
4、放入质量分数为0.1%的氯化汞溶液中2~4分钟（也可质量分数为1%的次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液）
5、无菌水冲洗3~5次
用于培养花药，实际上多数未熟，由于它的外面有花萼、花瓣或颖片保护，通常处于无菌状态，所以只要将整个花蕾或幼穗消毒即可。
（三）接种和培养
灭菌后花蕾，要在无菌条件下除去萼片和花瓣，并立即将花药接种到培养基上。在剥离花药时，要尽量不损伤花药（否则接种后，容易从受伤部位产生二倍体的愈伤组织），同时还要彻底去除花丝，因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成。
通常每瓶接种花药7-10个，温度控制在25℃左右，不需要光照。幼小植株形成后才需要光照。
一般经过20-30天培养后，会发现花药开裂，长出愈伤组织或释放出胚状体。将愈伤组织及时转移到分化培养基上，以便进一步分化出再生植株。
如果花药开裂释放出胚状体，则一个花药内就会产生大量幼小植株，必须在花药开裂后尽快将幼小植株分开，分别移植到新的培养基上，否则这些植株将很难分开。
在花药培养中，特别是通过愈伤组织形成的花粉植株，常常会出现染色体倍性的变化。（主要原因是营养核和生殖核融合造成的。）
植物组织培养技术与花药培养技术的异同点
项目 相同点 不同点
植物组织培养技术 离体的植物组织经脱分化形成愈伤组织，再分化成丛芽，诱导出根，然后进行移栽。 外植体为体细胞，染色体数无需加倍。
花药培养技术 取材为花药，培养的为单倍体幼苗，植株弱小，高度不育，必须用秋水仙素处理，使染色体加倍，恢复正常植株的染色体数，而且为纯种。(共31张PPT)
课题2
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
专题2
微生物的培养与应用
一、课题背景
1、尿素的利用
尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。
2、细菌利用尿素的原因
土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶
CO(NH2)
脲酶
+ H2O
+ CO2
NH3
3、常见的分解尿素的微生物
芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。
4、课题目的
①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌
②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
一.研究思路
㈠.筛选菌株
㈡.统计菌落数目
㈢.设置对照
1、实例：
启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
原因：因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。
DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。
要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；
方法：
⑴抑制大多数微生物不能生长
⑵造成有利于该菌生长的环境，
结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。
2、实验室中微生物的筛选原理：
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
15.0g
琼脂
1.0g
尿素
10.0g
葡萄糖
0.2g
MgSO4`7H2O
2.1g
NaH2PO4
1.4g
KH2PO4
3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：
①从物理性质看此培养基属于哪类？
固体培养基
②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？
碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素
培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。
5、培养基选择分解尿素的微生物的原理
1、显微镜直接计数：
利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。
㈡.统计菌落数目：
不能区分死菌与活菌；
不适于对运动细菌的计数；
需要相对高的细菌浓度；
个体小的细菌在显微镜下难以观察；
缺点
2.间接计数法（活菌计数法）
⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。
⑵常用方法：稀释涂布平板法。
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。
注意事项
①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。
②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。
③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。
④涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在50个左右为最好。
计数法
直接计数法、
平板计数法、
比浊法、
膜过滤法
例题：统计菌落数目的方法有 （ ）
A.①②③⑥ B.③④⑤⑥
C.②③④⑥ D.①③④⑥
D
①涂布平板法 ②重量法 ③直接计数法 ④比浊法 ⑤ 生理指标法 ⑥ 膜过滤法
设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。
㈢.设置对照：
实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。
原因：⑴土样不同，⑵培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质)
小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。
方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验
方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。
结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。
二.实验的具体操作
㈠.土壤取样
从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。
◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。
㈡.制备培养基：
制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。
◆应在火焰旁称取土壤10g。
◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行
◆分离不同的微生物采用不同的稀释度
原因：不同微生物在土壤中含量不同
目的：保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板
[三]样品的稀释
为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？
原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。
结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。
㈣.取样涂布
◆实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。
◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。
㈤.微生物的培养与观察
在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。
选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
培养不同微生物往往需要不同培养温度。
细菌：30～37℃培养1～2d
放线菌：25～28℃培养5～7d
霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。
微生物的培养与观察
三.结果分析与评价
1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。
2.提示：选择每个平板上长有30—300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。
四、操作提示
无菌操作
做好标记
规划时间
五.课外延伸
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。
测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝 培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。
大肠杆菌呈 黑色中心 ,有或无金属光泽
大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征
本课题知识小结:
六、例题解析
例1．对细菌群体生长规律测定的正确的表述是
A．在液体培养基上进行 B．至少接种一种细菌
C．接种一个细菌 D．及时补充消耗的营养物质
解析：细菌群体生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。这些条件是：一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。
答案：A
　　例2．在微生物群体生长规律的测定中，种内斗争最显著最激烈的时期是
　　A．调整期 　B．对数期
　　C．稳定期 D．衰亡期
　　解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生物对生存空间和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足的时候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目的增加，每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，种内斗争就越来越激烈。由此可知，在稳定期的种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物的数目已经开始减少，pH已经极度不适于微生物的生存，次级代谢产物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机环境的斗争。
答案：C
1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（ 　）
A.在液体培养基上进行 B.至少接种一种细菌
C.接种一个细菌 D.及时补充消耗的营养物质
2.使用选择培养基的目的是（ 　）
A.培养细菌　　
B.培养真菌　　
C.使需要的微生物大量繁殖
D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别
3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是( )
A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3　　
C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素
实践训练
A
C
D
4.下列说法不正确的是（ 　）
A.科学家从70－80度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶
B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值
C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度
D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。
5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（　　）
A.较多的氮源物质 B.较多的碳源物质
C.青霉素类药物 D.高浓度食盐
B
C
　　例3．（2005年江苏）抗生素作为治疗细菌感染的药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素工业经久不衰。其中青霉素的发现和应用具有划时代的意义。
⑴青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢类型是 ，青霉素是青霉菌的 代谢产物。
⑵在生产和科研中，常选用处于 期的青霉菌作为菌种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢旺盛， 和 比较稳定。
⑶对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的发酵液，经离心分离、反复洗涤后， ，再计算发酵罐中菌体的总重量。
异养需氧型
次级
对数
个体的形态
生理特性
称菌体的湿重
（称烘干后的重量）(共8张PPT)
课题2
胡萝卜素的提取
课题目标：
1、了解胡萝卜素的基础知识；
2、了解提取胡萝卜素的基本原理；
3、初步学会胡萝卜素的提取技术和纸层析法。
本节问题：
1、什么是胡萝卜素？包括哪几类？
从胡萝卜素中提取出来的橘黄色物质包括多种结构类似物，统称为胡萝卜素。可根据双键数目划分为α、β、γ三类。
2、 β-胡萝卜素有哪些应用？
教材P77
3、胡萝卜素的理化性质怎样？家里炒胡萝卜时为何要加多点油？
4、工业上提取天然β-胡萝卜素的方法有哪几种？
5、本节实验操作提取胡萝卜素用的什么方法？
萃取法
6、操作中要注意的一些问题：
1）萃取剂的选择（教材资料1相关问题）
2）影响萃取的因素
教材P78
7、提取胡萝卜素的实验流程。
P78图6-6
8、用什么方法可对提取到的胡萝卜素进行鉴定？具体操作步骤怎样？结合（必修1）中实验《绿叶中色素的提取和分离》分析如果提取到的胡萝卜素不纯将出现怎样结果？
纸层析法。
操作步骤：量作基线 对照点样 干燥层析 对比观察。
如果提取到的胡萝卜素含杂质，则层析后在滤纸上出现多个不同高度的色素点样。
练习 1、
方法
名称 优点 局限性
水蒸气蒸馏 简单易行，便于分离 水中蒸馏会导致某些原料焦糊和有效成分水解等问题
压榨法 生产成本低易保持原料原来的结构和功能 分离较为困难，出油率相对较低
有机溶剂萃取 出油率高，易分离 使用的有机溶剂处理不当会影响芳香油的质量
实验原理 适用范围
方法步骤
利用水蒸气将挥发性较强的芳香油携带出来 适用于提取玫瑰精油、薄荷油等挥发性较强的芳香油 分别见教材玫瑰精油、橘皮油和胡萝卜素提取的流程图
通过机械加压，压榨出果皮中的芳香油 适用于柑橘、柠檬等易焦糊原料的提取
使芳香油溶解在有机溶剂中，蒸发溶剂后就可获得芳香油 适用范围广，要求原料的颗粒尽可能小，能充分浸泡在有机溶剂中(共38张PPT)
复习旧知
1、腐乳的制作用的是什么微生物？
细胞结构？
代谢类型？
生殖方式？
2、腐乳的前期发酵的目的是什么？
时间多长？
3、腐乳制作过程中有哪些措施可以预防杂菌污染？
泡菜是一种以湿态发酵方式加工制成的浸制品，为泡酸菜类的一种。泡菜制作容易，成本低廉，营养卫生，风味可口，利于贮存。在我国四川、东北、湖南、湖北、河南、广东、广西等地民间均有自制泡菜的习惯。目前较受欢迎的是川味和韩味泡菜，在许多风味餐馆里，都有其踪影，它鲜嫩清脆，可以增进食欲，帮助消化与吸收。如果自己在家也做一些这样的泡菜，做为每天饭前小菜，或以它配菜，烹成各种菜肴，不失为一件美事。但是泡菜含亚硝酸盐具制癌作用危害身体健康，所以不宜多吃
一、泡菜的制作
（一）、泡菜制作基础知识
1、乳酸菌
（1）形态
球型或杆型；
（2）细胞结构
原核细胞；
你认为有哪些结构？
（3）代谢类型
乳酸菌是异养厌氧型细菌；
在无氧条件下，将葡萄糖分解成乳酸。常见的乳酸菌有乳酸链球菌和乳酸杆菌。
你能写出乳酸菌分解葡萄糖的反应式吗？
另外，乳酸杆菌还常用于制作酸奶。
思考：
用乳酸杆菌制作酸奶时，牛奶的营养和能量会发怎样的变化？为什么？
把100毫升的牛奶分别放入100、200、300、400毫升的容器中进行乳酸发酵，最先发酵成功的是哪个？
你能说出理由吗？
（4）分布
乳酸菌种类很多，在自然界中分布广泛，空气、土壤、植物体表、人或动物的肠道内都有乳酸菌的分布。
你能说出乳酸杆菌与酵母菌的异同吗
2、亚硝酸盐
你知道亚硝酸盐吗？知道它的危害吗？
亚硝酸盐(包括亚硝酸钾和亚硝酸钠)为白色粉末，易溶于水。
当人体摄入的亚硝酸盐总量达到0.3～0.5g时，会引起中毒，达3g时会引起死亡。
分布：
蔬菜中亚硝酸盐的平均含量约为4mg/Kg，咸菜中亚硝酸盐的平均含量在7mg/Kg以上，而豆粉中平均含量可达10mg/Kg。
卫生标准：
亚硝酸盐的残留量在肉制品中不得超过30mg/Kg，酱腌菜中不超过20mg/Kg，而婴儿奶粉中不得超过2mg/Kg。
膳食中的绝大多数亚硝酸盐在人体内以“过客”的形式随尿排出，只有在特定的条件下（适宜的PH、温度和一定的微生物作用），才会转变成致癌物——亚硝胺。大量动物实验表明，亚硝胺具有致癌作用，同时对动物具有致畸和致突变作用。研究表明，人类的某些癌症可能与亚硝胺有关。
请你设计实验证明亚硝胺能使动物细胞发生癌变。
3、腌制条件
腌制过程中，要注意控制腌制的时间、温度和食盐的用量。
温度过高、食盐用量不足10％、腌制时间过短，容易造成细菌大量繁殖，亚硝酸盐含量增加。一般在腌制10天后，亚硝酸盐的含量开始下降。
4、泡菜坛的选择
泡菜坛本身质地好坏对泡菜与泡菜盐水有直接影响，故用于泡菜的坛子应经严格检验，其优劣的区分方法如下：
① 观型体:泡菜坛以火候老、釉质好、无裂纹、无砂眼、形体美观的为佳。
②看内壁:将坛压在水内，看内壁，以无砂眼、无裂纹、无渗水现象的为佳。
③ 视吸水:坛沿掺入清水一半，用废纸一卷，点燃后放坛内，盖上坛盖，能把沿内水吸干（从坛沿吸入坛盖内壁）的泡菜坛质量较好，反之则差。
④ 听声音:用手击坛，听其声，钢音的质量则好，空响、砂响、音破的质次。
（2） 添加的调味品，如花椒、八角等。
（3） 白酒。
（4） 食糖和盐。
3、材料
（1） 各种蔬菜均可，一般用白菜、洋白菜、黄瓜、柿子椒、胡萝卜、白萝卜等。
4、步骤
（1）各种菜洗净并切成3～4cm长的小块。
（2）将泡菜坛洗净，并用热水洗坛内壁两次。
（3）将各种蔬菜、盐水、糖及调味品放入坛，混合均匀。如果希望发酵快些，可将蔬菜在开水中浸1分钟后入坛，再加上一些白酒。
发酵前期：蔬菜刚入坛时，表面带入的微生物，主要是以不抗酸的大肠杆菌和酵母菌等较为活跃，它们进行异型乳酸发酵和微弱的酒精发酵产生较多的乳酸、酒精、醋酸和二氧化碳等，二氧化碳以气泡从水槽内放出，逐渐使坛内形成嫌气状态。
（4）将坛口用水封好，防止外界空气进入。
（5）泡菜发酵
发酵产物中除乳酸外，还有其他，如乙醇、CO2等称异型乳酸发酵。
发酵中期：由于前期乳酸的积累，pH下降，嫌气状态的形成，乳酸杆菌活跃进行活跃的同型乳酸发酵，乳酸积累pH达3.5~3.8.大肠杆菌、酵母菌、霉菌等的活动受到抑制。这一期为完全成熟阶段，泡菜有酸味且清香品质最好。
发酵产物中只有乳酸，称为同型乳酸发酵。
发酵后期：继续进行乳酸发酵，乳酸积累达1.2％以上时，乳酸杆菌的活性受到抑制，发酵速度逐渐变缓甚至停止。
腌制1周左右即可开坛食用。也可随时加入新鲜蔬菜，不断取用。
（6）如果加入一些已经腌制过的泡菜汁更好，这相当于接种已经扩增的发酵菌，可减少腌制时间。
1、加入白酒有什么作用？
白酒可抑制泡菜表面杂菌的生长，它也是一种调味剂，可增加醇香感。
几个思考题：
2、用水封闭坛口起什么作用？不封闭有什么结果？
水封闭坛口起着使坛内与坛外空气隔绝的作用，空气中21％是氧气，这是最简易的造成无氧环境的方法。这样，坛内可利用蔬菜中天然存在的乳酸菌进行乳酸发酵。如不封闭，则会有许多需氧菌生长，蔬菜会腐烂。
说出坛内微生物的代谢类型的变化情况。
3、为什么泡菜坛内有时会长一层白膜，这层白膜是怎么形成的？
形成白膜是由于产膜酵母的繁殖。酵母菌是兼性厌氧微生物，泡菜发酵液营养丰富，其表面氧气含量也很丰富，适合酵母菌的繁殖。
4、为什么日常生活中要多吃新鲜蔬菜，不吃存放时间过长、变质的蔬菜？
有些蔬菜，如小白菜和萝卜等含有丰富的硝酸盐。当这些蔬菜放置过久时发生变质（发黄、腐烂）或者煮熟后存放太久时，蔬菜中的硝酸盐会被微生物还原成亚硝酸盐，危害人体健康。
这些蔬菜究竟能不能吃，你判断的理由是什么？
二、亚硝酸盐含量的测定
1、测定亚硝酸盐含量的原理
在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，再与N-1－萘基乙二胺盐酸盐结合生成玫瑰红溶液。将经过反应显色后的待测样品与标准液比色，即可计算出样品中的亚硝酸盐含量。
我们还学过哪些颜色反应？
2、材料与器具
泡菜、对氨基苯磺酸、 N-1－萘基乙二胺盐酸盐、氯化钠、氢氧化钠、氢氧化铝、氯化镉、氯化钡、亚硝酸钠、蒸馏水、移液管、容量瓶、比色管、榨汁机等。
3、步骤
（1）配制溶液
看书配制了哪些溶液？具体做法是什么？浓度是多少？
对氨基苯磺酸溶液：称取0.4克对氨基苯磺酸，溶解于100ml体积分数为20％的盐酸中，避光保存(4mg/ml)。
N-1－萘基乙二胺盐酸盐溶液：称取0.2克N-1－萘基乙二胺盐酸盐，溶解于100ml的水中，避光保存(2mg/ml) 。
亚硝酸钠溶液：称取0.10克于硅胶干燥器中干燥24小时的亚硝酸钠，用水溶解至500ml，再转移5 ml溶液至200 ml容量瓶，定容至200ml(5ug/ml)
提取剂：分别称取50克氯化镉、氯化钡，溶解于1000ml蒸馏水中，用盐酸调节pH至1。氢氧化铝乳液和2.5mol/l的氢氧化钠溶液。
提取剂：分别称取50克氯化镉、氯化钡，溶解于1000ml蒸馏水中，用盐酸调节pH至1。氢氧化铝乳液和2.5mol/l的氢氧化钠溶液。
（2） 配制标准液
用移液管吸取0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml、1.50ml亚硝酸钠溶液，分别置于50ml比色管中，再取1支比色管作为空白对照。并分别加入2.0ml对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3～5分钟后，再分别加入1.0ml N-1－萘基乙二胺盐酸盐溶液，加蒸馏水至50ml，混匀，观察亚硝酸钠溶液颜色的梯度变化。
（3） 制备样品处理液
将3坛样品做好标记后，分别称取0.4千克泡菜，榨汁过滤得200ml汁液。取其中100 ml至500ml容量瓶中，加200ml蒸馏水、 100ml提取剂，混匀，再加入40ml氢氧化钠溶液，用蒸馏水定容至500ml后，立即过滤。将60ml滤液转移至100ml容量瓶中，加入氢氧化铝（吸附脱色）乳液，定容至100ml，过滤。
（4）比色
吸取40ml透明澄清的滤液，转移到50ml比色管中，将比色管做好标记。按步骤2的方法分别加入对氨基苯磺酸溶液和N-1－萘基乙二胺盐酸盐溶液，并定容至50ml，混匀，静置15分钟后，观察样品颜色的变化，并与标准显色液比较，找出与标准液最相近的颜色，记录对应的亚硝酸钠含量，并计算。每隔2天测一次，将结果记录下来。
2001年1月4日
（封坛前）
2001年1月8日
2001年1月12日
2001年1月15日
2001年1月19日
0.15
0.60
0.20
0.10
0.10
1号坛
2号坛
0.15
0.20
0.10
0.05
0.05
3号坛
0.15
0.80
0.60
0.20
0.20
泡菜腌制过程中亚硝酸盐含量的变化
你能绘制相关的曲线图吗？
4、实验结果分析和讨论
……三只泡菜坛中的亚硝酸盐含量变化的绝对数量虽然不同，但整体的变化趋势却基本相同。在腌制后的第五天，三只泡菜坛中亚硝酸盐的含量都达到最高峰（1、2、3号坛中的亚硝酸盐分别达到 0.6mg/kg、0.2mg/kg、0.8mg/kg），
为什么不同的坛内的亚硝酸盐的含量不同？
在腌制后的前6天内，泡菜中的亚硝酸盐含量就可以达到最高峰。而第9天后泡菜中的亚硝酸盐含量开始有明显下降。这可能是由于泡菜在开始腌制时，坛内环境有利于某些细菌的繁殖（包括一些硝酸盐还原菌），这些细菌可以促进硝酸盐还原为亚硝酸盐。但随着腌制时间的延长，乳酸细菌也大量繁殖，对硝酸盐还原菌产生一定的抑制作，使其生长繁殖受到影响，造成泡菜中亚硝酸盐的含量又有所下降。
亚硝酸盐的检测：
均样+水→捣碎→加果蔬提取剂（50gBaCl2+CdCl2）→加1000ml重蒸馏水中，用浓HCl调PH为1）→振荡1小时→用NaOH调至中性→定容→过滤→滤液应无色透明。
乳酸菌除了可以用于制作泡菜，还可以用于牛奶发酵。那么，在牛奶的发酵过程中会产生亚硝酸盐吗？
请你设计实验来证明你的结论。
制作家庭酒酿的具体操作过程：先将米煮熟，待冷却至30℃时，加一定量的“酒药”与米饭混匀后置于一容器中，在中间挖一个洞，加盖后置于适当的地方保温，12h即成。请回答以下问题：
（1）先将米煮一煮的目的是什么？
（2）坛子没有密封，无氧环境怎样形成的？
（3）在加入酒药时，要宁多勿少的理由。
（4）酿酒过程中为什么先有水，再有酒？(共50张PPT)
植物组织培养技术
Plant Tissue Culture
一、实验目的
二、相关知识
三、实验原理
四、试剂和器材
五、操作步骤
六、思考题
目 录
一、实验目的
掌握植物组织培养相关理论知识
掌握植物组织培养的操作方法
了解不同激素及其比例对愈伤组织再分化的作用
二、相关知识
离体（in vitro)条件下利用人工培养条件在无菌情况下培养、生长、发育再生出完整植株的过程。
1958年，英国科学家Steward 等用胡萝卜根的愈伤组织细胞进行悬浮培养，成功诱导出胚状体并分化为完整的小植株，不但使细胞全能性理论得到证实，而且为组织培养的技术程序奠定了基础。
应用领域
1、快速繁殖 运用组织培养的途径，一个单株一年可以繁殖几万到几百万个植株。例如一株兰花一年繁殖到400万株。
　　2、种苗脱毒 针对病毒对农作物造成的严重危害，通过组织培养可以有效地培育出大量的无病毒种苗。
　　3、远缘杂交 利用组织培养可以使难度很大的远缘杂交取得成功，从而育成一些罕见的新物种。
二、相关知识
应用领域
4、突变育种 采用组织培养可以直接诱变和筛选出具抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种。
　　5、基因工程 基因工程主要研究DNA的转导，而基因转导后必须通过组织培养途径才能实现植株再生。
　　6、生物制品 有些极其昂贵的生物制品，如抗癌首选药物--紫杉醇等，可通过组织培养方式生产。
二、相关知识
植物组织培养的分类
广义的组织培养依外植体不同，可分为：
1) 器官培养（organ culture）
2)茎尖分生组织培养(shoot tip culture, apical meristem culture)
3)愈伤组织培养(calluse cultrue)
4)细胞培养(cell culture)
5)原生质体培养(protoplast culture)
二、相关知识
外植体(explant)：由活体（in vivo)植物体上提取下来的，接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等。
愈伤组织(callus)：在人工培养基上由外植体上形成的一团无序生长状态的薄壁细胞。
二、相关知识
二、相关知识
二、相关知识
二、相关知识
二、相关知识
二、相关知识
二、相关知识
植物组织培养特点
①培养条件可以人为控制
②生长周期短，繁殖率高
③管理方便，利于工厂化生产和自动化控制
二、相关知识
植物组织培养营养条件-培养基(Culture Medium)
培养基是植物组织培养的重要基质。
培养基的成分主要可以分水、无机盐、有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类。
二、相关知识
国际上流行的培养基有几十种，常用的培养基有：
MS培养基、B5培养基、White培养基、N6培养基、KM-8P培养基
二、相关知识
常用培养基简介--MS培养基
1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。有些培养基是由它演变而来的。
二、相关知识
常用培养基简介--B5培养基
是1968年由Galmborg等为培养大豆根细胞而设计的。其主要特点是含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知有些植物在B5培养基上生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。
二、相关知识
常用培养基简介--White培养基
是1943年由White为培养番茄根尖而设计的。1963年又作了改良，称作White改良培养基，提高了MgSO4的浓度和增加了硼素。其特点是无机机盐数量较低，适于生根培养。
二、相关知识
常用培养基简介—N6培养基
是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。其特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。
二、相关知识
常用培养基简介—KM-8P培养基
1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。有些培养基是由它演变而来的。
二、相关知识
不同营养条件对植物组织培养的影响
Growth medium is optimised for regeneration of plantlets
No sucrose (0%)
Sucrose reduced to 1%
Sucrose increased to 5%
The explant is completely covered with green shoots, and roots are developing on the lower surface
Very few shoots have developed on the explant. No roots and no callus.
Shoots developed on edges of upper surface, and some root development has occured
Shoots have developed over the surface of the explant, along with roots from the lower surface. The result is comparable with the control medium
二、相关知识
No BAP
BAP reduced to 0.1 mg. l-1
No NAA
Poor shoot development and no roots. Extensive callus generation
Poor shoot development and no roots
NAA reduced to 0.1 mg. l-1
More balanced development of roots and shoots. However, undifferentiated callus is developing at the edges of the explant
Profuse development of roots and a reduced number of shoots. Undifferentiated callus is developing at the edges of the explant
二、相关知识
NAA increased to 5.0 mg. l-1
Profuse development of roots over the explant upper and lower surface, and few shoots. Some callus
No MS salts
No sign of regeneration from explant at all.
MS salts reduced to 0.47 g. l-1
Some root growth but reduced development of shoots
MS salts increased to 9.52 g. l-1
Shoots developed on upper surface of explant. No roots or callus.
二、相关知识
植物细胞的全能性
植物细胞具有该植物体全部遗传的可能性，在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。
差异:(1) 受精卵的全能性最高
(2) 受精卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞的低。
潜在全能性的原因：基因表达的选择性
科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。人工条件下实现的这一过程，就是植物组织培养。
三、实验原理
植物细胞全能性的表达
脱分化（dedifferentiation)：将来自已分化组织的已停止分裂的细胞从植物体部分的抑制性影响下解脱出来，恢复细胞的分裂活性。
再分化（redifferentiation):经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下可有转变为各种不同细胞类型的能力。
三、实验原理
四、试剂和器材
1、材料
新鲜胡萝卜茎
2、试剂
MS培养基
10%亚硫酸溶液
MS培养基配制方法
四、试剂和器材
四、试剂和器材
3、仪器
高压灭菌锅、超净工作台、烘箱、培养箱
4、玻璃器皿
试剂瓶(50、100、1000ml)、三角瓶(100ml)、
刻度吸管(0.5、1、5、10ml)、培养皿
5、用具
镊子、解剖刀、接种针、记号笔、封口膜
离体的植物器官、组织、细胞
脱分化
愈伤组织
再分化
根
芽
植物体
五、操作步骤
切开胡萝卜，在圆圈处取一块组织
P-木质部、C-形成层、X-韧皮部
五、操作步骤
形成层开始形成愈伤组织
C1-愈伤组织、C2-形成层
五、操作步骤
3-4周后完全形成愈伤组织状态（脱分化）
组织块失去色素
五、操作步骤
把脱分化后的愈伤组织转移到培养基上
五、操作步骤
两周左右开始再分化，长出幼苗
五、操作步骤
将幼苗移植到外部条件下培养（顺化）
五、操作步骤
顺化一个月后的胡萝卜植株
五、操作步骤
培养基配制(I)—母液配制：
按照MS培养基成分表, 配制分别配制培养基的母液。
1、大量元素母液(10倍液)
分别称取10倍用量的各种大量无机盐，依次溶解于大约800ml热的（60-80℃）蒸馏水中。（一种成分完全溶解后再加入下一种，最后加水，定容至1000ml后装入试剂瓶中，冰箱内贮存备用）。
五、操作步骤
2、微量元素母液(100倍液)
分别称取100倍用量的微量无机盐，依次溶解于800ml重蒸水中，加水定溶到1000ml。
3、铁盐母液（100倍液）
称取100倍用量的Na2-EDTA(乙二胺四乙酸钠)和FeSO4·7H2O，溶于800ml重蒸水中，最后定容到1000ml。
五、操作步骤
培养基配制(I )—母液配制：
4、有机物质母液(100倍数)
分别称取50倍用量的各种有机物质，依次溶解于400ml重蒸水中，定容至1000ml，装入棕色试剂瓶中，贮存冰箱备用。
除上述四种母液外，培养基中经常附加的各种生物素和细胞分裂素也要配成母液贮存，临用时按浓度定量吸取加入。
五、操作步骤
培养基配制(I)—母液配制：
5、生长素
如2,4-D、IAA、NAA等。准确称取20mg，先用2ml95%乙醇溶解，然后加水，定容至20ml，浓度为1mg/ml，再放置冰箱内贮存备用。
6、细胞分裂素
如激动素(Kt)、6-苄基嘌呤(6-BA)。准确称取20mg，先用2ml的1mol/ml HCL或NaOH溶解，然后加水，定容至20ml，浓度为1mg/ml，再放置冰箱内贮存备用。
五、操作步骤
培养基配制(I)—母液配制：
取1000ml烧杯一只，加大量元素10倍母液100ml，微量元素100倍母液10ml，铁盐100倍母液10ml,有机物质100倍母液10ml。此外,根据培养材料和实验目的还要附加一定量的生长素,细胞分裂素及蔗糖等,然后加水至1000ml,待蔗糖充分溶解后用1mol/L 的NaOH或HCl调酸碱度为pH5.8,最后加入琼脂粉6.5g,如用琼脂条,则要加8g。
五、操作步骤
培养基配制(II)—配制与分装：
将盛有培养基的烧杯在电磁炉上，煮至琼脂完全融化，补加蒸馏水至1000ml。
将配制好的培养基分装到培养用三角瓶中，每只100ml三角瓶约装40ml培养基。
分装时要避免把培养基倒在瓶口上，否则培养时容易引起杂菌污染。
五、操作步骤
培养基配制(II)—配制与分装：
1、把装好的培养基的三角瓶放入高压灭菌锅中，盖好锅盖。
2、设置灭菌参数为121℃，20min，开始灭菌。
五、操作步骤
培养基配制(III)—灭菌：
1、取新鲜胡萝卜茎，用去离子水洗净。
2、在胡萝卜茎上切一块含有形成层的组织，放入磨口三角瓶中，倒入适量10%亚硫酸溶液，轻轻摇动15-30s。
3、倒去亚硫酸溶液，无菌水洗涤3-4次，彻底清除残留叶面和瓶内的亚硫酸溶液
五、操作步骤
胡萝卜的取材与处理
1、先用肥皂洗手，穿上工作服，戴上口罩和工作帽。
2、放入培养瓶和灭菌后的接种用具(镊子、解剖刀、接种针)，把镊子、解剖刀、接种针插入内盛70%酒精的广口瓶中。
3、用镊子把胡萝卜夹入培养皿内的吸水纸上，吸干水珠，把胡萝卜切成含有“木质部”、“形成层”和“韧皮部”三部分的小块。
五、操作步骤
接种
4、小心打开三角瓶，把组织块投入瓶内，用接种针拨匀，盖上封口膜。
5、用记号笔在瓶壁上写明培养材料、培养基代号、 接种日期。
五、操作步骤
接种
注意事项
全部接种操作都是在无菌条件下进行的，所以要特别认真仔细，以防杂菌污染。
接种完毕后，取出培养瓶中，置于26~28℃光照培养箱中培养。
观察记录生长情况，并照相存档。
五、操作步骤
培养
1、植物组织培养技术有哪些实际用途？
2、植物激素与器官分化有何关系？
3、怎样理解在中药提取活性成分时要把握好药材的采收时间？
4、为保证无菌，操作时有哪些注意事项？
六、思考题
结束(共36张PPT)
（一）普通洗衣粉
一、基础知识
表面活性剂，水软化剂，碱剂，漂白剂等成分，有的洗衣粉中还含有增白剂，香精和色素，以及填充剂等
1、洗衣粉主要成分：
作用：洗衣粉的主要成分，优先吸附在各种界面上，降低水的表面张力，改变体系界面的状态，去除衣物的污渍
①表面活性剂
种类：阴离子、阳离子、非离子和两性离子等四大类，但用于洗涤的表面活性剂则以阴离子和非离子为主
一般表面活性剂中含有疏水基团和亲水基团，在洗涤过程中其乳化作用和通透作用，是衣服中的脂肪类物质进入水中
应用：表面活性剂有最普通、最传统的阴离子表面活性剂就是人类使用了几百年的肥皂（高级脂肪酸钠）。合成洗涤工业问世之后，使用最普遍的是十二烷基苯磺酸钠，非离子表面活性剂应用最广泛的是聚氧乙烯醚类
应用：三聚磷酸钠广泛应用于各种洗衣粉中，无磷洗衣粉中不含有三聚磷酸钠
作用：防止水中的钙、镁离子造成的阴离子表面活性剂失活，提高表面活性剂利用率
种类：三聚磷酸钠是最为常用的一种水软化剂，它具有软化水质、分散污垢、缓冲碱剂及抗结块性能等特点
②水软化剂
④漂白剂：可延缓衣物的泛黄程度，但对衣物有一定的损伤。
③碱剂：
作用：在适当的碱度下，纤维和污垢可被最大限度地离子化，更易于污垢的水解和分散
应用：一般洗衣粉配方中都含有纯碱和硅酸钠，其中硅酸钠还具有使污垢颗粒悬浮、防止再沉积的作用
⑤增白剂
⑥香精和色素
丝、棉、毛类等天然纤维的浅色衣物容易变黄，加入增白剂后，它能够留存在衣物上，吸收阳光中的紫外线，反射出与黄光互补的蓝色光线，从而掩盖了衣物上的黄色。
改善洗衣粉的气味和外观，给人清新愉悦的感受，并掩盖某些化学成分的异味
2、种类
①洗衣粉含磷量
无磷洗衣粉、含磷洗衣粉
含磷洗衣粉：以磷酸盐为主要助洗剂的一类产品
助洗剂：结合钙镁离子，阻止污垢再沉积，有助于提高表面活性剂的去污能力
磷：一种营养元素，易造成水体富营养化，从而破坏水质，污染环境
无磷洗衣粉：不用磷酸盐作助洗剂的一类产品，无水质富营养化这一特点，有利于水体环境保护
②洗涤效果
普通洗衣粉、浓缩洗衣粉
③普通、浓缩洗衣粉的特点
普通洗衣粉：颗粒大而疏松，溶解性好，泡沫较为丰富，但去污力相对较弱，不易漂洗，一般适用于手洗
浓缩洗衣粉：颗粒小，密度大，泡沫较少，但去污力至少是普通洗衣粉的两倍，易于清洗，节约水，一般适用于机洗
1、定义：
（二）加酶洗衣粉
含有酶制剂的洗衣粉
2、成分
除含有普通洗衣粉的成分外，还含有多种酶制剂：蛋白酶，脂肪酶，淀粉酶，纤维素酶，复合酶
①蛋白酶：
应用：有助于取出例如汗渍，血渍，青草，粘液，粪便以及各种食品类的蛋白质污垢
作用：碱性蛋白酶能使蛋白质水解成可溶于水的多肽和氨基酸
种类：我国在洗衣粉中添加的酶最主要的是碱性蛋白酶
产生：主要产生菌是某些芽孢杆菌
②脂肪酶
应用：可以催化水解各类动植物油脂和人体皮脂腺分泌物及化妆品污垢，
种类：碱性脂肪酶
作用：碱性脂肪酶能使甘油三脂水解成容易用水冲洗掉的甘油二脂、甘油单脂和游离脂肪酸。从而达到清除衣物上脂质污垢的作用
产生：产生菌是某些青霉
脂肪 甘油 + 脂肪酸
脂肪酶
方程式：
③淀粉酶
应用：可以去除例如来自面条、巧克力、肉汁和婴儿食品中含有淀粉的污垢
作用：水解直链淀粉中的1，4－a－糖苷键，使糊化淀粉迅速分解为可溶解的糊精和低聚糖
淀粉 麦芽糖
淀粉酶
方程式：
④纤维素酶
应用：去除棉纺织品表面的浮毛，使洗涤后的棉纺织品柔软蓬松，织纹清晰，色泽更加鲜艳，穿着更加舒适
作用：碱性纤维素酶本身不能去除衣物上的污垢，它的作用是使纤维的结构变得蓬松，从而使渗入到纤维深层的尘土和污垢能够与洗衣粉充分接触，从而达到更好的去污效果
种类：碱性纤维素酶
纤维素 葡萄糖
纤维素酶
方程式：
⑤复合酶
实际污垢组成复杂，往往蛋白污垢被脂肪污垢或淀粉污垢覆盖，单一酶的作用一般达不到彻底清除污垢的作用。而复合酶可以发挥其独特的“协同效应”。
试验测定，单独使用蛋白酶或淀粉酶，得到的洗涤效果远不如把每种酶用量减半后放在一起使用的效果。即给定酶的用量，复合酶的效果远远超过单一酶的效果。原因是淀粉酶分解了污渍表面的淀粉污垢，使蛋白酶能以更有效的方式向蛋白质污垢进攻。
（三）普通洗衣粉和加酶洗衣粉异同
相同点：
不同点：
表面活性剂可以产生泡沫，可以将油脂分子分散开；水软化剂可以分散污垢；等等
酶可以将大分子有机物分解为小分子有机物，小分子有机物易于溶于水，从而与纤维分开
（四）影响酶活性的因素
温度、pH等
成分：略
用法：洗涤前先将衣物浸于加有适量洗衣粉的水内数小时，用温水浸泡效果更佳,切勿用60℃以上的水.
注意：切勿用于丝质及羊毛衣料，用后须彻底清洗双手。
(五）资料分析
一般洗衣粉不易清除衣物的血渍和奶渍，但加酶洗衣粉则可以。 一生物活性洗衣粉包装盒上印有以下材料：
1、该洗衣粉较易清除衣物的血渍和奶渍，说明该洗衣粉中加入的是什么酶？为什么？
蛋白酶，因为血渍和奶渍的主要成分是蛋白质，蛋白酶能分解血渍和奶渍中的蛋白质。
2、为什么洗涤前先将衣物浸于加有适量洗衣粉的水内数小时？如何缩短衣物的浸泡时间？
是为了使洗衣粉中的蛋白酶充分的分解衣物中的蛋白质污渍；用温水浸泡衣物，因为酶的催化作用需要适宜的温度。
3、为什么不能在60℃以上的水中使用此洗衣粉？
使用加酶洗衣粉时，必须注意洗涤用水的温度，温度过高会使酶变性失活。在低温下也会失效；
4、试解释为什么此洗衣粉不能用于丝质及羊毛衣料？
因为蛋白酶能使蛋白质水解，而丝质及羊毛衣料中含有蛋白质，这样会损坏衣物
5.为什么用后须彻底清洗双手？
人体皮肤细胞有蛋白质，如不彻底清洗双手，就会使手的皮肤受到腐蚀。而使人患过敏性皮炎、湿疹等，因此，应避免与这类洗衣粉长时间地接触。
此外：加酶洗衣粉也不宜长期存放，存放时间过长会导致酶活力损失
二、实验设计
（一）子课题一：探究普通洗衣粉和加酶洗衣粉对衣物污渍的洗涤效果
1、实验原理
生活中的各种污渍主要是蛋白质、脂质、淀粉等多种不溶于水的有机物，这些有机物能在相应的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的作用下水解成易溶于水的小分子有机物
2、遵循原则
实验变量为洗涤剂，设计时应遵循单一变量原则、对照性原则有效的控制其他变量，如水的用量、污染物的量，所用实验用布的质地大小、两种洗衣粉的用量，搅拌及洗涤时间，
3、实验操作流程
（1）实验准备
带有污染物的实验用布的制取：取一定量的污染物制成溶液，取等量的污染物滴加在相同大小、质地的新布上
称取等量的洗衣粉：用天平准确称取等量普通洗衣粉和加酶洗衣粉
（2）实验过程
①取两只大烧杯并编号，用量筒分别量500ml蒸馏水放入其中。放入400C的水浴锅保温。
②将制好的污染布和洗衣粉（一组为污染布和普通洗衣粉，另一组为污染布和加酶洗衣粉）分别放入两只烧杯中。
③用玻璃棒同时充分搅拌一段时间。一段时间后搅拌可重复进行。
④过相同的时间后观察洗涤效果。
（3）实验结论
加酶洗衣粉的效果好
1、分析资料二
温度梯度设置并不恰当和完善，主要是梯度差值偏大。在达到最适温度之前提高温度，可以增加酶促反应的速度，每提高反应温度10度，所增加的反应速度称为反应的温度系数，对于许多酶来说，这个系数为1－2，也就是每增高10度，酶反应速度增加1－2倍，假定用上述梯度测得40度时洗涤效果最好，但并不能说最适温度就是40度
①结论
（二）探究加酶洗衣粉使用时的最适温度
②改进
制取同样的污染布，称取等量的同一种洗衣粉，分几个温度不同的试验组，温度梯度可设为20、25、30、35、40、45、50、55度，若测出在40度时洗涤效果最好，可设置更细的试验组如35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45度，直至测出具体的最适温度
①实验原理
酶的活性受温度的影响，最适温度时酶的活性最大，去污力最强，高于或低于此温度酶的活性降低，去污力下降
②洗涤效果的判断
可在洗涤后比较污物的残留状况，如：已消失、颜色变浅、面积缩小等，最好能进行定量的比较
2、实验设计
③材料器具：
加酶洗衣粉、鸡血、新白棉布、蒸馏水、烧杯、滴管、温度计、恒温水浴锅、玻璃棒、量筒、直尺、天平等
⑤实验步骤
④实验准备
（1）制取带有污物的实验用布
将等量的鸡血滴到7块大小相同的、质地相同的新布上
（2）称取1g加酶洗衣粉：用天平准确的称取等量的同种加酶洗衣粉
（1）配制系列温度梯度水溶液
取大烧杯7只，用量筒量取500ml的蒸馏水放入其中。然后将7只烧杯分别放入250C、300C、350C、400C、450C、500C、550C的恒温水箱加热。
（2）将制好的污染布和称好的洗衣粉分别放入7只烧杯中。
（3）用玻璃棒同时充分搅拌一段时间。一段时间后搅拌可重复进行，持续保持各自的温度。
（4）过相同的时间后观察洗涤效果
实验中可以用滴管控制污物的量，待污物干燥后再进行实验；布料应放在洗衣粉溶液中浸泡相同的时间；采用玻璃棒或筷子搅拌的方式模拟洗衣过程；模拟搅拌的时间、次数和力量应基本相同
实验遵循的原则：单因子变量的原则和对照原则
（三）子课题三：不同种类的加酶洗衣粉的洗涤效果
1、实验原理
不同种类的加酶洗衣粉所加的酶不同，而酶具有专一性，所以对不同污渍洗涤效果不同
2、实验步骤
①取30块大小相同的白棉布，分成6组，每组5块，依次编号1a、1b、1c、1d、1e、2a、2b…6a、6b、6c、6d、6e。
（a为蛋白酶处理组，b为脂肪酶处理组，c为淀粉处理组，d为复合酶处理组，e为普通洗衣粉组)
②制取带有污染物的实验用布
给第一组白布滴加鸡血，待血渍扩散停止后，记录血渍面积
按同样的方法给第2－6组分别滴加牛奶、菜油、番茄汁、墨水、颜料，并记录污渍面积
③将上述白棉布分别放入30个已编号的烧杯中，各注入500ml蒸馏水，用玻璃棒搅拌使白棉布湿透
④温度控制
烧杯均放入温度为45度的水浴锅
⑤洗衣粉洗涤
给1a－6a号烧杯中加入等量的蛋白酶洗衣粉，给1b－6b号烧杯中加入等量的脂肪酶洗衣粉，
给1c－6c号烧杯中加入等量的淀粉酶洗衣粉，
给1d－6d号烧杯中加入等量的复合酶洗衣粉，
给1e－6e号烧杯中加入等量的普通酶洗衣粉，
各烧杯均搅拌洗涤10分钟后，用清水漂洗3次，晾干
（6）记录结果：将实验结果记入下表。
3、实验结论：
编号
1
2
3
4
5
6
污渍类型
鸡血
牛奶
菜油
番茄汁
墨水
染料
洗涤效果
蛋白酶
脂肪酶
淀粉酶
复合酶
普通洗衣粉
四、课题延伸
1.“衣领净”含高效表面活性剂、还原增白剂、液体蛋白酶制剂等成分，可洗去领口、袖口的顽渍及其它顽渍，而一般洗衣粉效果较差。
2.厨房的洗涤剂有两大类 （1）用于清洗食具的洗涤剂（如洗洁净），其重要的化学成分是化学合成的烷基类活性剂，对皮肤有刺激性，残留的烷基苯磺酸盐对人体有一定的危害。
（2）用于清洗灶具、排气扇油垢的清洗剂。它渗透能力、脱脂能力强，碱性也强，对皮肤有损伤。要求高的专业洗涤加入少量的脂肪酶。
（3）马桶污垢分三类
酸性产品、中性产品和碱性产品。
目前市场上以酸性为主，清洗效果最佳。洁厕灵是人们常用的一种洁厕剂，其主要成分是：各种有机酸、缓蚀剂、增稠剂、表面活性剂、香精等。(共25张PPT)
课题1.果酒和果醋的制作
学习目标
1.说明果酒和果醋的制作原理
2.设计果酒和果醋的发酵装置
3.了解制作果酒和果醋的过程
1、果酒的制作原理
（1）果酒制作的原理是什么？写出反应式。
（2）制作果酒的原料是什么？如果制作葡萄酒，取材时你认为应先冲洗还是先除去枝梗？
（3）制作葡萄酒的酵母菌主要来源于哪里？其它杂菌会不会引起发酵液的污染？你认为应该从哪些方面防止发酵液被污染？
（4）果酒制作时应给予怎样的温度、空气条件？
（5）关于酵母菌的生物学特性你知道哪些？
一、基础知识分析
1、果酒的制作原理
（1）果酒制作的原理是什么？写出反应式。
一、基础知识分析
酵母是兼性厌氧微生物，有氧时进行有氧呼吸；在厌氧条件下，将双糖或单糖进行糖酵解，并进行乙醇发酵，产生乙醇。
C6H12O6 ＋6O2 CO2+6H2O
C6H12O6 2CH3CH2OH+2CO2
1、果酒的制作原理
（2）制作果酒的原料是什么？如果制作葡萄酒，取材时你认为应先冲洗还是先除去枝梗？
一、基础知识分析
制作果酒的原料是鲜果。制作葡萄酒时，应先冲洗葡萄，然后再除去枝梗，从而避免除去枝梗时，引起葡萄损坏，增加被杂菌感染的机会。
1、果酒的制作原理
（3）制作葡萄酒的酵母菌主要来源于哪里？其它杂菌会不会引起发酵液的污染？你认为应该从哪些方面防止发酵液被污染？
一、基础知识分析
制作葡萄酒的酵母菌来源于附着在葡萄皮上的野生酵母菌。杂菌不会引起发酵液的污染，因为首先，葡萄在榨汁前要清洗；其次，在缺氧、酸性的发酵液中，绝大多数微生物无法适应环境而被抑制。
对发酵瓶、纱布、榨汁器等用具进行清洗并消毒。每次排气时只要拧松瓶盖，不要完全揭开瓶盖等。
1、果酒的制作原理
（4）果酒制作时应给予怎样的时间、温度、空气
条件？
一、基础知识分析
时间：10-12天
温度： 18－25℃
空气：缺氧
1、果酒的制作原理
（5）关于酵母菌的生物学特性你知道哪些？
一、基础知识分析
同化作用类型：自养、异养
异化作用类型：需氧、厌氧、兼性厌氧型
主要分布：土壤、空气、河流
结构：单细胞、多细胞
分类：真核生物、原核生物
生殖（主要方式）：出芽生殖
2、果醋的制作原理
（1）果醋制作的原理是什么？写出反应式。
（2）制作果醋的原料是什么？如果制作葡萄醋应先如何处理鲜葡萄？为什么要加入果胶酶？
（3）制作葡萄醋的醋酸菌主要来源于哪里？
（4）果醋制作时应给予怎样的时间、温度、空气等条件？
（5）关于醋酸菌的生物学特性你知道哪些？
一、基础知识分析
2、果醋的制作原理
（1）果醋制作的原理是什么？写出反应式。
一、基础知识分析
乙醇转变成乙酸的氧化过程是由醋酸杆菌完成的，这一过程是需氧过程。
C2H5OH+O2 CH3COOH+H2O
2、果醋的制作原理
（2）制作果醋的原料是什么？如果制作葡萄醋应先如何处理鲜葡萄？为什么要加入果胶酶？
一、基础知识分析
将葡萄洗净、榨汁，并加入一些果胶酶
使细胞壁溶解，获取更多的果汁。
2、果醋的制作原理
（3）制作葡萄醋的醋酸菌主要来源于哪里？
一、基础知识分析
制作葡萄醋的醋酸菌可以直接购买，或用选择培养基培养
2、果醋的制作原理
（4）果醋制作时应给予怎样的时间、温度、空气等条件？
一、基础知识分析
时间：7-8天
温度： 30－35℃
空气：充足的氧
2、果醋的制作原理
（5）关于醋酸菌的生物学特性你知道哪些？
一、基础知识分析
同化作用类型：自养、异养
异化作用类型：需氧、厌氧、兼性厌氧型
主要分布：酸性环境
结构：单细胞、多细胞
分类：真核生物、原核生物
生殖：出芽生殖、分裂生殖
二、果酒和果醋的发酵装置
（1）实验室制作果酒、果醋的基本装置是什么？排气口、冲气口、出料口各有什么作用？
二、果酒和果醋的发酵装置
（2）为什么排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接？
排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接，其目的是防止空气中的微生物污染。
二、果酒和果醋的发酵装置
（3）如果进行大规模生产果酒、果醋时，需要解决哪些问题？
大规模生产果酒、果醋时，需要解决全面考虑，如：
a: 原料的来源和选择
b: 菌种的培养
c: 发酵设备、发酵条件的自动化控制
d：严格控制杂菌污染等
e: 实际生产中还要考虑沉淀、消毒包装、保存，风味色泽等
设计制作果酒和果醋的详细过程 (方案)
(一)阅读教材操作提示:
思考用葡萄制作果酒的基本过程，写出详细方案。
设计制作果酒和果醋的详细过程
简述果酒、果醋制作的基本过程。
1.对发酵瓶、纱布、榨汁器等用具进行清洗并消毒。
2.取葡萄500g，去除枝梗和腐烂的叶子。
3.用清水冲洗葡萄1－2次除去污物。（注意冲洗次数不宜太多）
4.榨汁后装入发酵瓶。
5.将发酵瓶置于适宜的温度（18－25℃）下发酵。
6.简易装置2－4天排气一次。（拧松瓶盖）
7.10天后，取样检验。
8.加入醋酸菌或醋曲，然后移至30－35℃条件下发酵，适时充气。
四、结果分析\评价
（1）制作葡萄酒和葡萄醋的过程中，发酵液分别有哪些变化？其中最明显的变化发生在发酵后多少天？你能分析引起变化的原因吗？
由于发酵作用，糖分大部分转变为CO2和乙醇。CO2 排出越来越旺盛，使发酵液沸腾，CO2从排气口排出，在发酵10天后，现象最明显。发酵过程产热，会使发酵液温度上升，但酒精发酵温度应严格控制在25-30 ℃；发酵过程中，色素及其他成分逐渐溶解于发酵液中。
（2）如何鉴别是酵母菌作用的结果。 设置对照组，将葡萄汁进行高压灭菌，分别装入1和2号发酵瓶中，1号加入酵母菌，2号不加。比较发酵结果。
四、结果分析\评价
（3）如何检验果酒、果醋的制作是否成功？
果酒的制作是否成功的鉴定方法是：
嗅味和品尝、显微镜观察、用重铬酸钾检验酒精的存在
果醋的制作是否成功的鉴定方法是：
观察菌膜的形成、嗅味和品尝、比较发酵前后的PH值显微镜观察
葡萄酒色泽鲜艳、爽口、柔和、有浓郁的果实香味；果醋具有琥珀色或棕红色，具有特有的果香，酸味柔和，稍有甜味，不涩。
在酒的制作中，依种类分大体上可有白酒、果酒、啤酒和黄酒四类。
制作方法各不相同，但相同部分是它们都是由酵母完成的。
酵母在自然界中广泛分布，已知有几百种之多，也是应用最广的一类微生物。如面包制作、酒精制造、药用酵母片、酿酒等。
酒的种类
“干”是葡萄酒中的糖分要在一定的水平之下(低于4g/升)，几乎全部被降解发酵，甜葡萄酒(每升总糖50g以上)。
干红与干白
都可以是由红色葡萄制作的，但白葡萄酒在葡萄榨汁时，不使皮和子中的色素出来，因此得白葡萄酒，而红葡萄酒是将皮和子部分捣碎，有了红色素而得红葡萄酒，
红葡萄酒和白葡萄酒(共33张PPT)
专题二 微生物的培养
无菌技术
获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，无菌技术围绕着如何避免杂菌的污染展开。
无菌技术
消毒与灭菌的区别？
无菌技术
分类 定义 方法
灭菌法 杀灭一切微生物 物理法：热力、辐射、微波、等离子体
化学法：醛类、烷化剂
高效消毒法 杀灭一切致病微生物 紫外线、含氯剂、臭氧、复配剂等
中效消毒法 杀灭除芽孢外的致病微生物 超声波、碘类、醇类、酚类
低效消毒法 杀灭细菌繁殖体、亲脂病毒 单链季胺盐、双胍类、中草药、金属离子
无菌技术
消毒的方法：
1、100℃煮沸5-6min
2、巴氏消毒法：70-75 ℃下煮30min或 80 ℃ 下煮15min
3、用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒
4、氯气消毒水源
5、紫外线消毒
……
无菌技术
灭菌的方法：
1、灼烧灭菌
2、干热灭菌：160-170 ℃下加热1-2h。
3、高压蒸气灭菌：100kPa、121 ℃下维持15-30min.
无菌技术
最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。
有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。
而平皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。
基本操作程序
1、器具的灭菌
2、培养基的配制
3、培养基的灭菌
4、倒平板
5、微生物接种
6、恒温箱中培养
7、菌种的保存
1、培养基的配制
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
固体培养基
液体培养基
天然培养基
合成培养基
基础培养基
加富培养基
鉴别培养基
选择培养基
1、培养基的配制
牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）
1、培养基的配制
牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）
1．称量
2．溶化
3．调pH：　pH7．6　
4．过滤：这一步可以省去。
5．分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。
6．加塞
7．包扎
8．灭菌
9．倒平板
10．无菌检查：将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。
2、倒平板技术
2、倒平板技术
3、微生物的接种技术
3、微生物的接种技术
3、微生物的接种技术
4、微生物的恒温培养
4、微生物的恒温培养
4、微生物的恒温培养
5、菌种的保存
1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4℃冰箱保存。
2、长期保存：甘油冷冻管藏法
实践:分离土壤中的细菌
1、由土壤浸出液中提取细菌。
2、有哪些注意事项？
3、如何判断土壤中有哪些种类的细菌？
菌落的特征？
实践:分离土壤中的细菌
关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。
实践:分离土壤中的细菌
关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。
实践:分离土壤中的细菌
关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。
实践:分离土壤中的细菌
关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。
实践:分离土壤中的细菌
关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。
实践1:分离土壤中的细菌
关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。
实践2:分离土壤中的分解尿素的细菌
1、培养基的选择？
实践2:分离土壤中的分解尿素的细菌
1、培养基的选择？
构建怎样的选择培养基呢？
附：鉴别培养基：伊红—美蓝培养基是鉴别培养基，可以用来检测自来水中的大肠杆菌是否超标，因为大肠杆菌的代谢产物与伊红—美蓝结合，使菌落呈深紫色并带有金属光泽，使大肠杆菌的菌落显示出来，并没有促进大肠杆菌的生长和抑制其他微生物的生长。
实践3:分离并计算土壤中的分解尿素的细菌的数目
1、如何对细菌进行计数？
实践3:分离并计算土壤中的分解尿素的细菌的数目
1、如何对细菌进行计数？
实践3:分离并计算土壤中的分解尿素的细菌的数目
1、如何对细菌进行计数？
实践3:分离并计算土壤中的分解尿素的细菌的数目
1、如何对细菌进行计数？(共11张PPT)
课题3
酵母菌细胞的固定化
课题目标:
1、说出固定化酶和固定化细胞的原理；
2、尝试制备固定化酵母细胞，并利用固定化酵母细胞进行酒精发酵。
课题重难点：制备固定化酵母细胞。
本节问题：
1、阅读课题背景资料，完成教材P52课后练习1，并说明该材料体现了什么观点？
2、举出固定化酶的应用实例。
用固定化酶（葡萄糖异构酶）进行高果糖浆的生产高果糖浆。
类型 优点 不足
直接使用酶 催化效率高；低能耗；低污染等。 易失活；难回收，成本高；酶混合在产物中可能影响产品质量。
固定化酶 既能与反应物接触，又能与反应物分离；可重复利用 一种酶只能催化一种或一类反应，而生产中很多产物需一系列酶促反应才能得到。
固定化细胞 成本低；操作更容易 大分子物质难以自由通过细胞膜使应用受到某些限制。
3、固定化酶和固定化细胞技术有哪些？各有什么优缺点？固定化细胞常用的载体有哪些？
有包埋法、化学结合法和物理吸附法。
固定化酶分子小更适合采用化学结合法和物理吸附法，用包埋法却容易从包埋材料中漏出。固定化细胞因细胞大不易被吸附或结合适宜采用包埋法。
常用载体：明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。
4、固定化酶和固定化细胞的原理是什么？
就是将酶固定在不溶于水的载体上，或者将微生物细胞均匀地包埋于不溶于水的多孔性载体上，使酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用的技术。
5、制备固定化酵母细胞的步骤及注意事项有哪些？
详见P50-51
6、教材相关问题及练习的解决。
巩固练习
1、酶固定化技术与细胞固定化技术的关系是
A 酶固定化技术是细胞固定化技术的基础
B 细胞固定化技术是酶固定化技术的基础
C 酶固定化技术与细胞固定化技术是同时发展起来的
D 固定化细胞技术先于酶固定化技术
2、固定化酶技术常采用
A 包埋法 B 化学结合和物理吸附法
C 活化法 D 微囊化法
3、海藻酸钠在水中溶解的速度较慢，需要经过加热促进其溶解，采用的最好加热方法是
A 快速加热 B 持续高温加热
C 小火间断加热 D 灼烧加热
4、酵母菌的活化是指
A 让酵母细胞恢复运动状态
B 让酵母细胞在缺水状态下更容易休眠
C 让酵母细胞内酶活性加倍
D 让处于休眠状态的酵母细胞重新恢复正常的生活状态
5、细胞固定化技术与酶固定化技术相比，所具备的特点是
A 成本更低、操作更容易、不能连续性生产
B 成本更高、操作更难、不能连续性生产
C 成本更低、操作更容易、能连续性生产
D 成本更低、操作更难、能连续性生产(共57张PPT)
了解有关微生物及培养基的基础知识，进行无菌技术的操作，进行微生物的培养。
一、课题目标：
掌握培养基的制备、高压蒸气灭菌和平板划线法等基本操作技术，熟练、规范地进行无菌操作，成功地培养微生物。
无菌技术的操作。
二、课题重点和难点：
三、技能目标：
微生物包括哪五类：
病毒
细菌
放线菌
真菌
原生动物
特点：结构简单,形体微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.且体内一般不含有叶绿素.不能进行光合作用.
原核生物界
原生生物界
真菌界
病毒界
一、基础知识：
(一)微生物
细菌的外形与大小
细菌：单细胞不分枝的原核微生物。
细菌细胞微小而透明，通常用适当染料染色后显微镜观察
图1-1 常见的三种细菌典型形态
A.球菌 B.杆菌 C.弧菌
细菌细胞由外向里依次有鞭毛、菌（纤）毛、荚膜、细胞壁、细胞膜、细胞质，细胞质中又有液泡、储存性颗粒、核质等。
细菌的构造
图1-3 细菌的结构
*细胞壁
结构特点：坚韧且有弹性
细胞壁有哪些功能？
①固定细胞外形；
②保护细胞免受外力的损伤；
③阻拦大分子物质进人细胞；
④使细胞具有致病性及对噬菌体的敏感性。
伤寒杆菌细胞壁中含毒素
有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌.
菌落：
单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。
菌落是鉴定菌种的重要依据。
菌落
细菌的菌落特征因种而异
细菌的营养类型
根据细菌所利用的能源和碳源的不同，将细菌分为两大营养类型。
自养菌:分类,举例
异养菌:
腐生菌
寄生菌 大部分病原菌
光合自养型:光合细菌
化能自养型:硝化细菌,铁细菌,硫细菌
放线菌
1、结构：
单细胞原核
分支状的菌丝（基内菌丝、气生菌丝）
链霉素、土霉素、四环素、
氯霉素、红霉素、庆大霉素
微生物中发现了几千种抗生素，其中2/3是
由放线菌产生的
应用:
病毒的结构
2、病毒的增殖：
真菌
一、基础知识：
（二）培养基
培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。
（1）按物理状态分：固体培养基和液体培养基、半固体培养基。其中固体培养基用于菌种保存及分离、鉴定菌落、活菌计数等，半固体培养基可观察微生物的运动，液体培养基常用于发酵工业。
（2）按功能分：选择培养基和鉴别培养基。
（3）按成分分：天然培养基和合成培养基。
1.培养基的类型和用途
选择培养基
加入青霉素的培养基:
分离酵母菌、霉菌等真菌
加入高浓度食盐的培养基:
分离金黄色葡萄球菌
不加氮源的无氮培养基:
分离固氮菌
不加含碳有机物的无碳培养基:
分离自养型微生物
加入青霉素等抗生素的培养基:
分离导入了目的基因的受体细胞
加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基:
分离杂交瘤细胞
天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。
优点：营养成分丰富，培养效果好
缺点：来源受限;成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析;易发生支原体污染;
根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。
合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。
优点：标准化生产，组分和含量相对固定;成本低
缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。
合成培养基:
天然培养基：
血清中含有：
①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）
②多种金属离子；
③激素；
④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。
⑤各种生长因子
⑥转移蛋白
⑦不明成分
人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。
液体培养基：
表面生长
均匀混浊生长
沉淀生长
固体培养基：菌落，菌苔
半固体培养基：
无动力 有动力(弥散)
(是否运动)
2.不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方 (参考教材附录内容)
3.不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、和氮源、 无机盐、等营养物质，
另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质,例如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。
4.培养基的用途
液体培养基：增菌
固体培养基：纯化，增菌
半固体培养基：动力检测，保种
二、无菌技术
1.无菌技术的概念
无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。无论是随后将要学到的倒平板、平板划线操作，还是平板稀释涂布法，其操作中的每一步都需要做到“无菌”，即防止杂菌污染。只有熟练、规范地进行无菌操作，才可能成功地培养微生物。
　（１）消毒定义：
　　利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。区分为高程度消毒（High-level Disinfection）、中程度消毒（Intermediate-level Disinfection）、低程度消毒（Low-level Disinfection）三种方式。
2.消毒与灭菌的概念及两者的区别
　　（2）灭菌的定义：
　　以化学剂或物理方法消灭所有微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌之过程。 灭菌消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。
1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min
2、巴氏消毒法：70-75 ℃下煮30min或 80 ℃ 下煮15min
3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源
4、紫外线消毒
……
(1)消毒的方法：
3.常用的消毒与灭菌的方法
1、灼烧灭菌
2、干热灭菌：160-170 ℃下加热1-2h。
3、高压蒸气灭菌：100kPa、121 ℃下维持15-30min.
(2)灭菌的方法：
最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。
有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。
而平皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。
分类 定义 方法
灭菌法 杀灭一切微生物 物理法：热力、辐射、微波、等离子体
化学法：醛类、烷化剂
高效消毒法 杀灭一切致病微生物 紫外线、含氯剂、臭氧、复配剂等
中效消毒法 杀灭除芽孢外的致病微生物 超声波、碘类、醇类、酚类
低效消毒法 杀灭细菌繁殖体、亲脂病毒 单链季胺盐、双胍类、中草药、金属离子
无菌技术
3.微生物实验室培养的基本操作程序
1、器具的灭菌
2、培养基的配制
3、培养基的灭菌
4、倒平板
5、微生物接种
6、恒温箱中培养
7、菌种的保存
1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？
2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。
（1） 培养细菌用的培养基与培养皿
（2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管
（3） 实验操作者的双手
答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。
答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。
三、实验操作
1.制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）
1．计算、称量
2．溶化
3．调pH：　pH7．6　
4．过滤：这一步可以省去。
5．分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。
6．加塞
7．包扎
操作步骤
8．灭菌:
将50ml培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121℃，灭菌15～30min。将培养基用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在160～170 ℃下灭菌2h。
9．倒平板:
待培养基冷却到50 ℃左右时，在酒精灯附近倒平板。（倒平板操作见课本）2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种.
10．无菌检查：
将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。
倒平板技术
1.培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？
答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。
2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。
2、纯化大肠杆菌
接种方法有：
平板划线法和稀释涂布平板法
平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌钟逐步稀释分散到培养基的表面.
在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.
微生物的接种技术
平板划线的操作方法
交叉划线法
连续划线法
平板划线时不能划破培养基的原因
一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；
二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。
1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
答：以免接种环温度太高，杀死菌种。
3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？
应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。
微生物的恒温培养
微生物的恒温培养
菌种的保存
1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4℃冰箱保存。
2、长期保存：甘油冷冻管藏法
四、课题成果评价
（一）培养基的制作是否合格
如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。
（二）接种操作是否符合无菌要求
如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。
（三）是否进行了及时细致的观察与记录
培养12 h与24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯。
本课题知识小结:
【典例解析】
例1．关微生物营养物质的叙述中，正确的
A.是碳源的物质不可能同时是氮源
B.凡碳源都提供能量
C.除水以外的无机物只提供无机盐
D.无机氮源也能提供能量
解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于A、B选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；NaHCO3，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。
答案：D
例2．下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是
A.防止杂菌污染 B.消灭杂菌
C.培养基和发酵设备都必须灭菌
D.灭菌必须在接种前
答案：B
解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是正确的；B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。C是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。
编号 成分 含量
① 粉状硫 10g
② （NH4）2SO4 0.4g
③ K2HPO4 4.0g
④ MgSO4 9.25g
⑤ FeSO4 0.5g
⑥ CaCl2 0.5g
⑦ H2O 100ml
例3．右表是某微生物培养基成分，请据此回答：
（1）右表培养基可培养的微生物类型是 。
（2）若不慎将过量NaCl加入培养基中。
如不想浪费此培养基，可再加入 .
自养型微生物
含碳有机物
（3）若除去成分②，加入（CH2O），该培养基可用于培养 。
（4）表中营养成分共有 类。
（5）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是 。
（6）右表中各成分重量确定的原则是 。
（7）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分 。
固氮微生物
3
调整pH
依微生物的生长需要确定
琼脂（或凝固剂）(共20张PPT)
课题1
＋
酶普遍存在于动、植物和微生物中，将酶从生物组织或细胞以及发酵液中提取出来，可加工成具有一定纯度标准的生化酶制剂。
思考讨论
酶具有
哪些独特的优点其本质和作用场所是什么
●催化效率 ●专一性强 ●作用条件温和
酶的本质主要是蛋白质,少数是RNA.
在生物体内外均可发挥作用
一.果肉的出汁率低,耗时长．
二．榨取的果汁浑浊，黏度高，
易发生沉淀．
为什么能够提高
水果的出汁率并使果汁变得澄清？
果胶酶有什么作用？
1. 果胶是植物组织的组成成分之一,它主要存
在于植物组织的哪一部分 （　　）
Ａ．细胞核　Ｂ．细胞质　Ｃ．细胞间隙
Ｄ．细胞壁及胞间层
２．果胶酶能将植物组织内的果胶分解成（　）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ａ．透明果汁　　　Ｂ．半乳糖醛酸
Ｃ．丙酮酸　　　　Ｄ．酶制剂
３．果胶酶是分解果胶的一类酶的总称，它不包括( )
A.多聚半乳糖醛酸酶 B.果胶分解酶
C.乳糖分解酶 D.果胶酯酶
　
D
B
C
4.在果汁加工中,果胶不仅会影响出汁率,还会
使果汁浑浊,因此应加入果胶酶去除果胶,这表现酶的( 　　)
A.多样性 B.高效性 C.专一性 D.受温度影响
Ｃ
果汁经浓缩在高浓度的糖存在的条件下，可以形成果冻。但糖含量太多影响风味，a也不符合当今人们对健康食品的要求，必须采用酶法处理技术。
“最佳果浆酶解工艺”（OME工艺），其优点是明显提高榨汁率，使压榨机生产能力提高30％～100％，果渣量减少30％～50％
作食品添加剂．改善口味，增加营养
果胶酶发挥作用需要怎样的条件呢
什么是酶的活性？如何表示？影响酶活性的因素是什么？
有哪些能产果胶酶的生物？
。
酶的活性受温度pH值
等外界因素的影响，
本节课我们首先探究一下
温度对酶活性的影响
提出问题：探究温度对酶活性的影响
预期假设：在最适温度（约 40 ℃）酶的活
性大、低于或高于最 适温度时酶活性递减
可以保证底物和酶在混合时的温度是相同的
避免了果泥和果胶酶混合是影响混合物的温度，
从而影响果胶酶的活性
为什么在混合苹果泥和果胶酶之前，要将果泥和果胶酶分装在不同的试管中恒温处理？
为什么在混合苹果泥和果胶酶之前，要将果泥和果胶酶分装在不同的试管中恒温处理？
搅拌器搅拌制成苹果泥均分装入
9支试管
果胶酶水溶液等量
9支试管
各取一支分九组分别放入30℃、 35℃ 、40℃ 、45℃、 50℃ 55℃、60℃、65℃ 、70℃的恒温箱中恒温加热
待试管内温度稳定后，将果胶酶加入相同温度的苹果泥内
恒温保持10分钟
过滤果汁，用量筒测量果汁的量，填入表格
实验温度 30℃ 35℃ 40℃ 45℃
果汁量
说明: 等量的控制 （果泥 果胶酶的量）
等时间的控制（反应时间、过滤时间）
恒温的控制（不同反应物的预热 水浴、反应物的混合搅拌等）
其他处理（加水、滤纸等）
分析结果得出结论:温度影响酶的活性
探究pH对果胶酶活性的影响，只须将温度梯改成pH梯度，并选定一个适宜的温度进行水浴加热。
反应液中的pH可以通过体积分数为0.1%的氢氧化钠或盐酸溶液进行调节。
搅拌器拌制成苹果泥均分装入
果胶酶水
溶液等量
５支试管
５支试管
各取一支分５组分别放入37度的恒温水箱中恒温加热．
待试管内温度稳定后，将果胶
酶加入相同温度的苹果泥中调节ＰＨ为
５．６．７．８．９
恒温保持１０ｍｉｎ
过滤果汁，用量筒测量果汁的量，填入表格
探究PH对酶活性的影响
将乳清蛋白、淀粉、胃蛋白酶、唾液淀粉酶和适量的水混合装入一个容器内，调整之PH至2.0,保存于37度的水浴锅内。过一段时间后，容器内剩余的物质为（ ）
A.淀粉、胃蛋白酶、多肽和水
B.唾液淀粉酶、淀粉、胃蛋白酶、水
C.唾液淀粉酶、多肽、胃蛋白酶、水
D.唾液淀粉酶、麦芽糖、淀粉、胃蛋白酶、水
A
探究果胶酶的用量是建立在探究最适温度和pH对果胶酶活性影响的基础之上的。此时，研究的变量是果胶酶的用量，其他因素都应保持不变。
实验时可以配制不同浓度的果胶酶溶液，也可以只配制一种浓度的果胶酶溶液，然后使用不同的体积即可。需注意的是，反应液的pH必须相同，否则将影响实验结果的准确性。
在实际的操作过程中，还需要注意下列事项。
1．与其他工业用酶基本相同，果胶酶的适宜温度范围也比较宽泛，因此，
可以选用10 ℃作为温度梯度，设置的具体温度为10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃、
50 ℃和60 ℃等，也可以尝试以5 ℃作为温度梯度。
2．苹果、橙子和葡萄等水果都可以作为反应物，水果不用去皮。
3．果泥的用量可以采用5 mL左右，果胶酶的用量可采用质量浓度为
2%的果胶酶溶液2 mL。
4．水浴时间可以为20～30 min。
5．过滤果汁时，漏斗中应放置滤纸。(共38张PPT)
酵母细胞的固定化
一、基础知识
1、酶制剂的概念和种类
（一）酶制剂
含有酶的制品
①定义：
多酶片、加酶洗衣粉中的蛋白酶和脂肪酶
②种类：
A、液体酶制剂
治疗某些胃病的胃蛋白酶液
B、固体酶制剂
2、酶的生产
①提取法
定义：采用一定的技术直接从动植物或微生物的组织、细胞中将酶提取出来
优点：
简单易行，在动植物或微生物资源丰富的地区具有应用价值
实例：在屠宰厂，可以从家畜胰脏中提取出胰酶；在水果加工厂，可以从菠萝皮中提取出菠萝蛋白酶
缺点：
要有充足的原材料，广泛应用受到限制
②发酵法
定义：通过微生物发酵获得所需要的酶
如果是胞外酶，可以从发酵液中直接提取；如果是细胞内酶，则可将细胞弄碎再经过提取纯化而得到
易培养、繁殖速度快、便于大规模生产
优点：
提取方式：
③化学合成法
缺点：
成本高、已知分子结构的酶
提取出来的酶还要经过分离、纯化，再加入适量的稳定剂和填充剂，制成相应的酶制剂后才能用于催化化学反应
3、酶的提取和分离纯化
①酶的提取
盐溶液提取法、碱溶液提取法、有机溶剂提取法
适宜的温度和pH和保护剂
方法：
条件：
②酶的分离提纯
沉淀技术（密度梯度离心法）
层析技术
方法：
4、酶制剂特点
①天然酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易失活
②溶液中酶很难回收，不能再次利用，提高了生产成本
③反应后，酶会混在产物中，影响产品质量，难以在工业生产中广泛应用
（二）固定化酶
固定化酶是指限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂
（三）固定化细胞
将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术
被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞
固定化技术：
固定化细胞：
类型 优点 不足
直接使用酶 催化效率高，低耗能、低污染等 对环境条件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本；反应后酶会混在产物中，可能影响产品质量
固定化酶 酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用 一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形成都通过一系列的酶促反应才能得到的
固定化细胞 成本低、操作容易、对酶活性的影响更小、可以催化一系列的反应、容易回收 固定后的酶或细胞与反应物不容易接近，可能导致反应效果下降由于大分子物质难以自由通过细胞膜，因此固定化细胞的应用也受到限制
（四）直接使用酶、固定化酶和固定化细胞催化的优缺点
（五）酶和细胞固定化方法
1、物理吸附法：
将酶吸附到固体吸附剂表面的方法，固体吸附剂多为活性碳、多孔玻璃等
2、包埋法
①定义：将酶包裹在多孔的载体中，包埋成格子型或包埋成微胶囊型
②载体：明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺
③种类
凝胶包埋法：将个别酶分子包在高聚物格子中，可以将块状聚合形成的凝胶切成小块，也可以直接包埋在珠状聚合物中，这样作可以使固定化酶机械强度提高10倍，并改进酶脱落的情况
微囊化法：将酶溶液或悬浮液包裹在膜内，膜既可以使酶存在于类似细胞内的环境中，又阻止酶的脱落或直接与微囊外环境接触。小分子底物能迅速通过膜与酶作用，产物也能扩散出来
交联法：通过双功能试剂，将酶和酶联结成网状结构的方法
3、化学结合法：
①定义：将酶分子相互结合，或将其结合到纤维素、琼脂糖，离子交换树脂等载体上的固定方式
②种类
共价结合法：酶和载体以共价键的形式结合在一起的方法，这种方法需要酶和载体都具有氨基、羧基或羟基等官能团
（六）酶和细胞固定方法的选择
①酶适合采用化学结合和物理吸附法固定
②细胞适合采用包埋法固定
1、方法
2、原因
①细胞个大，酶分子很小
②个体大的细胞难以被吸附或结合而个小的酶容易从包埋的材料中漏出
（七）固定化酶的应用实例
1、高果糖浆
①生产原料
葡萄糖，葡萄糖是由淀粉转化而来
是以酶法糖化淀粉所得的糖化液，经葡萄糖异构酶的异构作用，将其中一部分葡萄糖异构成果糖，由葡萄糖和果糖而组成的一种混合糖糖浆
②生产机理
③生产流程
含淀粉的浆液
α-淀粉酶
糊精
糖化酶
葡萄糖
葡萄糖异构酶
葡萄糖的异构化
42%～45%转化成果糖
果葡糖浆
果糖和葡萄糖分离
葡萄糖再次异构化
反复多次
果糖含量70%～90%
高果糖浆
2、固定化酶技术生产高果糖浆
使用固定化酶技术，将葡萄糖异构酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这些酶颗粒装到一个反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应液却可以自由出入。生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触转化成果糖，从反应柱的下端流出
①生产过程
②生产优点
反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量
二、实验操作
（一）方法
1、包埋法固定化细胞
2、海藻酸钠作载体包埋酵母细胞
（二）制备固定化酵母细胞
1、酵母细胞的活化
① 过程
称取1g干酵母，放入50ml的小烧杯中，加入蒸馏水10ml。用玻璃棒搅拌，使酵母细胞混合均匀，成糊状，放置1h左右，使其活化
②注意事项
A、选用的干酵母要具有较强的活性，而且物种单一
B、在缺水状态下，微生物处于休眠状态。活化就是让处于( )的微生物重新恢复正常的生活状态
休眠状态
2、配置物质的量浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液
① 过程
称取无水CaCl2 0.83g，放入200ml的烧杯中，加入150ml的蒸馏水，使其充分溶解，待用
②注意事项
溶解物质要彻底，勿用自来水溶解，以防自来水中各种离子影响实验结果
3、配制海藻酸钠溶液
称取0.7g海藻酸钠，放入50ml小烧杯中，加入10ml水，用酒精灯加热，边加热边搅拌，将海藻酸钠调成糊状，直至完全溶化，用蒸馏水定容至10ml
① 过程
②注意事项
加热时要用 ，或者 反复几次，直到海藻酸钠溶化为止
小火
间断加热
海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞的质量。如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少
4、海藻酸钠溶液和酵母细胞混合
将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入以活化的酵母细胞，进行充分搅拌，再转移至注射器中
① 过程
②注意事项
A、溶化好的海藻酸钠溶液必须冷却至室温，否则会因温度过高杀死酵母菌
B、搅拌要彻底充分，使两者混合均匀，以免影响实验结果的观察
（5）固定化酵母细胞
以恒定的速度缓慢的将注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl2溶液中，将形成的凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30min左右
① 过程
②注意事项
A、可利用海藻酸钠制成不含酵母菌的凝胶珠，用作对照
B、海藻酸钠胶体在CaCl2这种电解质的作用下，发生聚沉，形成凝胶珠，需稳定30min左右
（三）用固定化酵母细胞发酵
①将固定化酵母细胞（凝胶珠）用蒸馏水冲洗2－3次，洗去凝胶珠表面多余的电解质溶液
1、过程
刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下列方法。一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的
②将150ml质量分数为10％的葡萄糖溶液转移至200ml的锥形瓶中，再加入固定好的酵母细胞，置于25°C下发酵24h
2、注意事项
①控制好发酵温度，一般是室温25 °C
②发酵时间可视具体情况而定，一般时间稍长一些，效果明显
③可用不含酵母的凝胶珠做相同的处理，对照实验结果
（一）观察凝胶珠的颜色和形状
如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。
（二）观察发酵的葡萄糖溶液
利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生了很多气泡，同时会闻到酒味
课题成果评价(共34张PPT)
课题1.
果酒和果醋的制作
凉州词
唐朝王翰
葡萄美酒夜光杯，欲饮琵琶马上催。
醉卧沙场君莫笑，古来征战几人回。
果酒果醋在酿造过程中，水果中富含的维生素、矿物质、氨基酸等被很好地保存，大大提高了原醋液的营养价值。实验表明，果醋中的醋酸、乳酸、氨基酸甘油和醛类化合物，对人的皮肤有柔和的刺激作用，能使血管扩张，增加血液循环，从而起到延缓衰老的作用。

以苹果、葡萄、山楂等为原料生产的果酒果醋饮料迎合了现代都市人绿色、健康的消费理念，也同时满足了现代都市女性保健、美容的需求。
喝果醋有益健康 冬季易燥，人们常用室内熏醋的方法预防流感。食醋是人们日常生活中不可缺少的调味品。 果醋饮料是养生保健的时尚产品，它特有的养颜抗衰、调节血压、杀菌抗癌、解酒保肝的作用越来越受到消费者青睐。经常喝醋饮料，可以驻颜美容、减肥消食、护肝健胃、软化血管，这正好迎合现代人的健康理念。与通常食醋相比，由水果酿制的果醋不但保持了水果特有的果香，而且酸度适中口感更容易接受。它既是饮料，又具有醋的药效，是一种全新的保健饮品。 《黄帝内经》、《本草纲目》中有关醋能强身健体的记载有700余处。现代医学和食品专家证明：果醋中有丰富的有机酸，有软化植物纤维和促进糖代谢的功效。它能溶解动物食品中的骨质，促进钙、鳞吸收，并能使肌肉中的“疲劳物质”化解；醋还能调节血液中的酸碱平衡，帮助消化，它对改善少儿偏食厌食亦有疗效。
学习目标
1.说明果酒和果醋的制作原理
2.设计果酒和果醋的发酵装置
3.了解制作果酒和果醋的过程
1、果酒的制作原理
（1）果酒制作的原理是什么？写出反应式。
（2）制作果酒的原料是什么？如果制作葡萄酒，取材时你认为应先冲洗还是先除去枝梗？
（3）制作葡萄酒的酵母菌主要来源于哪里？其它杂菌会不会引起发酵液的污染？你认为应该从哪些方面防止发酵液被污染？
（4）果酒制作时应给予怎样的温度、空气条件？
（5）关于酵母菌的生物学特性你知道哪些？
一、基础知识分析
1、果酒的制作原理
（1）果酒制作的原理是什么？写出反应式。
酵母是兼性厌氧微生物，有氧时进行有氧呼吸；在厌氧条件下，将双糖或单糖进行糖酵解，并进行乙醇发酵，产生乙醇。条件：酶和温度
C6H12O6 ＋6O2 CO2+6H2O
C6H12O6 2CH3CH2OH+2CO2
1、果酒的制作原理
（2）制作果酒的原料是什么？如果制作葡萄酒，取材时你认为应先冲洗还是先除去枝梗？
一、基础知识分析
制作果酒的原料是鲜果。制作葡萄酒时，应先冲洗葡萄，然后再除去枝梗，从而避免除去枝梗时，引起葡萄损坏，增加被杂菌感染的机会。
1、果酒的制作原理
（3）制作葡萄酒的酵母菌主要来源于哪里？其它杂菌会不会引起发酵液的污染？你认为应该从哪些方面防止发酵液被污染？
制作葡萄酒的酵母菌来源于附着在葡萄皮上的野生酵母菌。杂菌不会引起发酵液的污染，因为首先，葡萄在榨汁前要清洗；其次，在缺氧、酸性的发酵液中，绝大多数微生物无法适应环境而被抑制。
对发酵瓶、纱布、榨汁器等用具进行清洗并消毒。每次排气时只要拧松瓶盖，不要完全揭开瓶盖等。
1、果酒的制作原理
（4）果酒制作时应给予怎样的时间、温度、空气条件？
时间：10-12天
温度： 18－25℃
空气：缺氧
厌氧制酒
1、果酒的制作原理
（5）关于酵母菌的生物学特性你知道哪些？
同化作用类型：异养
异化作用类型：兼性厌氧型
主要分布：土壤
结构：单细胞
分类：真核生物
生殖（主要方式）：出芽生殖
2、果醋的制作原理
（1）果醋制作的原理是什么？写出反应式。
（2）制作果醋的原料是什么？如果制作葡萄醋应先如何处理鲜葡萄？为什么要加入果胶酶？
（3）制作葡萄醋的醋酸菌主要来源于哪里？
（4）果醋制作时应给予怎样的时间、温度、空气等条件？
（5）关于醋酸菌的生物学特性你知道哪些？
一、基础知识分析
2、果醋的制作原理
（1）果醋制作的原理是什么？写出反应式。
乙醇转变成乙酸的氧化过程是由醋酸杆菌完成的，这一过程是需氧过程。条件：酶和温度
C2H5OH+O2 CH3COOH+H2O
2、果醋的制作原理
（2）制作果醋的原料是什么？如果制作葡萄醋应先如何处理鲜葡萄？为什么要加入果胶酶？
将葡萄洗净、蒸煮、榨汁，并加入一些果胶酶
使细胞壁溶解，获取更多的果汁。
2、果醋的制作原理
（3）制作葡萄醋的醋酸菌主要来源于哪里？
制作葡萄醋的醋酸菌可以直接购买，或用选择培养基培养
2、果醋的制作原理
（4）果醋制作时应给予怎样的时间、温度、空气等条件？
时间：7-8天
温度： 30－35℃
空气：充足的氧
有氧制醋
2、果醋的制作原理
（5）关于醋酸菌的生物学特性你知道哪些？
同化作用类型：异养
异化作用类型：需氧
主要分布：酸性环境
结构：单细胞
分类：原核生物
生殖：分裂生殖
二、果酒和果醋的发酵装置
（1）实验室制作果酒、果醋的基本装置是什么？排气口、冲气口、出料口各有什么作用？
（2）为什么排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接？
（3）如果进行大规模生产果酒、果醋时，需要解决哪些问题？
（1）实验室制作果酒、果醋的基本装置是什么？排气口、冲气口、出料口各有什么作用？
（2）为什么排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接？
排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接，其目的是防止空气中的微生物污染。
（3）如果进行大规模生产果酒、果醋时，需要解决哪些问题？
大规模生产果酒、果醋时，需要解决全面考虑，如：
a: 原料的来源和选择
b: 菌种的培养
c: 发酵设备、发酵条件的自动化控制
d：严格控制杂菌污染等
e: 实际生产中还要考虑沉淀、消毒包装、保存，风味色泽等
左：葡萄酒窖；中：啤酒酒窖；右：白酒酒窖
大规模生产果酒的发酵和保存
三、了解制作果酒和果醋的过程
（1）简述果酒、果醋制作的基本过程。
（2）如何检验果酒、果醋的制作是否成功？
（1）简述果酒、果醋制作的基本过程。
1.对发酵瓶、纱布、榨汁器等用具进行清洗并消毒。
2.取葡萄500g，去除枝梗和腐烂的叶子。
3.用清水冲洗葡萄1－2次除去污物。（注意冲洗次数不宜太多）
4.榨汁后装入发酵瓶。
5.将发酵瓶置于适宜的温度（18－25℃）下发酵。
6.简易装置2－4天排气一次。（拧松瓶盖）
7.10天后，取样检验。
8.加入醋酸菌或醋曲，然后移至30－35℃条件下发酵，适时充气。
（2）如何检验果酒、果醋的制作是否成功？
果酒的制作是否成功的鉴定方法是：
嗅味和品尝、显微镜观察、用重铬酸钾检验酒精的存在
果醋的制作是否成功的鉴定方法是：
观察菌膜的形成、嗅味和品尝、比较发酵前后的PH值显微镜观察
巩固练习
1．下列关于果醋的制作，错误的是( )
A．果醋的制作需用醋酸菌，醋酸菌是一种好氧菌，所以在制作过程中需通氧气
B．醋酸菌是一种嗜温菌，温度要求较高，一般在50 ℃左右
C．醋酸菌能将果酒变成果醋
D．当氧气、糖源充足时，醋酸菌可将葡萄中的糖分解成醋酸
2．在制作果酒时如果一直往发酵罐中通入充足的氧气，会发生何种现象？（）
A酵母菌死亡，不产生酒精
B酵母菌大量繁殖，长生较多酒精
C酵母菌大量繁殖，不产生酒精
D酵母菌数目较少，不长生酒精
3．下列微生物属于严格厌氧的是：（ ）
酵母菌
B. 醋酸杆菌
C. 乳酸菌
D. 曲霉
4．酵母菌在氧气充足的条件下，主要的生殖方式为（ ）
A出芽生殖
B分裂生殖
C孢子生殖
D卵式生殖
5.在酿酒的过程中，温度对酒精的发酵过程起到重要的作用，应把发酵温度控制在（ ）
A 0-10 ℃
B 25-35 ℃
C 18-25℃
D 40℃以上
6.在酿酒和酿醋的过程中都要涉及各种微生物，在上述两个过程中所涉及的微生物在结构上有什么本质区别？
A前者有细胞结构，后者没有细胞结构
B前者没有细胞结构，后者有细胞结构
C前者有成形的细胞核，后者没有成形细胞核
D 前者没有成形的细胞核，后者有成形细胞核
7.在制造葡萄醋时为什么要适时通过充气口充气
A醋酸菌的新陈代谢类型为自养需氧型
B 醋酸菌的新陈代谢类型为异养需氧型
C醋酸菌的新陈代谢类型为自养厌氧型
D 醋酸菌的新陈代谢类型为异养厌氧型
8.在果酒制作实验结束时我们要检测试验是否成功，通常用重铬酸钾来检测酒精的有无，原理是在酸性条件下，重铬酸钾与酒精反应是（ ）
A蓝色
B砖红色
C灰绿色
D深紫并带金属光泽
在酒的制作中，依种类分大体上可有白酒、果酒、啤酒和黄酒四类。
制作方法各不相同，但相同部分是它们都是由酵母完成的。
酵母在自然界中广泛分布，已知有几百种之多，也是应用最广的一类微生物。如面包制作、酒精制造、药用酵母片、酿酒等。
酒的种类
“干”是葡萄酒中的糖分要在一定的水平之下(低于4g/升)，几乎全部被降解发酵，甜葡萄酒(每升总糖50g以上)。
干红与干白
都可以是由红色葡萄制作的，但白葡萄酒在葡萄榨汁时，不使皮和子中的色素出来，因此得白葡萄酒，而红葡萄酒是将皮和子部分捣碎，有了红色素而得红葡萄酒，
红葡萄酒和白葡萄酒
制作葡萄酒和葡萄醋的过程中，发酵液分别有哪些变化？其中最明显的变化发生在发酵后多少天？你能分析引起变化的原因吗？
葡萄酒制作图片
学习知识动手实践收获美酒体会乐趣美味美妙享受生活(共8张PPT)
课题3
血红蛋白的提取和分离
请根据本节课后练习题阅读教材，回答相关问题。
第1：P64
2、具有缓冲作用的溶液称缓冲溶液。缓冲作用：在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的作用。
3、P65-66
4、血红蛋白提取和分离的完整过程
（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红蛋白溶液。
（2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。
（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。
（4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。
5、哺乳动物的红细胞无细胞核，血红蛋白含量最高（95%），便于操作和分离。
练习巩固
1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是
A 弄清各种蛋白质的空间结构
B 弄清各种蛋白质的功能
C 弄清各种蛋白质的合成过程
D 获得高纯度的蛋白质
2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是
A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质
B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质
C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质
D 二者根本无法比较
3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于
A 电荷的多少 B 分子的大小
C 肽链的多少 D 分子形状的差异
4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是
A 调节pH B 维持红细胞的能量供应
C 防止微生物生长 D 防止血液凝固
5、一分子血红蛋白最多可携带的 O2分子数和CO2分子数分别是
A 4、2 B 4、4 C 2、1 D、1、1
6、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序自上而下是：
有机溶剂-----脂类物质-----血红蛋白溶液------红细胞破碎物沉淀(共20张PPT)
泡菜是一种以湿态发酵方式加工制成的浸制品，为泡酸菜类的一种。泡菜制作容易，成本低廉，营养卫生，风味可口，利于贮存。在我国四川、东北、湖南、湖北、河南、广东、广西等地民间均有自制泡菜的习惯。目前较受欢迎的是川味和韩味泡菜，在许多风味餐馆里，都有其踪影，它鲜嫩清脆，可以增进食欲，帮助消化与吸收。如果自己在家也做一些这样的泡菜，做为每天饭前小菜，或以它配菜，烹成各种菜肴，不失为一件美事。但是泡菜含亚硝酸盐具制癌作用危害身体健康，所以不易多吃
一、泡菜的制作
1、泡菜制作基础知识
（1）乳酸菌
乳酸菌是异养厌氧型细菌，在无氧条件下，将葡萄糖分解成乳酸。常见的乳酸菌有乳酸链球菌和乳酸杆菌，乳酸杆菌常用于制作酸奶。
（2）亚硝酸盐
亚硝酸盐(包括亚硝酸钾和亚硝酸钠)为白色粉末，易溶于水。当人体摄入的亚硝酸盐总量达到0.3～0.5g时，会引起中毒，达3g时会引起死亡。
（3）腌制条件
腌制过程中，要注意控制腌制的时间、温度和食盐的用量。
温度过高、食盐用量不足10％、腌制时间过短，容易造成细菌大量繁殖，亚硝酸盐含量增加。一般在腌制10天后，亚硝酸盐的含量开始下降。
泡菜坛本身质地好坏对泡菜与泡菜盐水有直接影响，故用于泡菜的坛子应经严格检验，其优劣的区分方法如下：
① 观型体:泡菜坛以火候老、釉质好、无裂纹、无砂眼、形体美观的为佳。
② 看内壁:将坛压在水内，看内壁，以无砂眼、无裂纹、无渗水现象的为佳。
③ 视吸水:坛沿掺入清水一半，用废纸一卷，点燃后放坛内，盖上坛盖，能把沿内水吸干（从坛沿吸入坛盖内壁）的泡菜坛质量较好，反之则差。
④ 听声音:用手击坛，听其声，钢音的质量则好，空响、砂响、音破的质次。
2、设备及用品
泡菜罐、菜刀、菜板
（2） 添加的调味品，如花椒、八角等。
（3） 白酒。
（4） 食糖和盐。
4、步骤
（1）各种菜洗净并切成3～4cm长的小块。
3、材料
（1） 各种蔬菜均可，一般用白菜、洋白菜、黄瓜、柿子椒、胡萝卜、白萝卜等。
（2）将泡菜坛洗净，并用热水洗坛内壁两次。
（3）将各种蔬菜、盐水、糖及调味品放入坛，混合均匀。如果希望发酵快些，可将蔬菜在开水中浸1分钟后入坛，再加上一些白酒。
（4）将坛口用水封好，防止外界空气进入。
（5）泡菜发酵
发酵前期：蔬菜刚入坛时，表面带入的微生物，主要是以不抗酸的大肠杆菌和酵母菌等较为活跃，它们进行异型乳酸发酵和微弱的酒精发酵产生较多的乳酸、酒精、醋酸和二氧化碳等，二氧化碳以气泡从水槽内放出，逐渐使坛内形成嫌气状态。
发酵产物中除乳酸外，还有其他，如乙醇、CO2等称异型乳酸发酵
发酵中期：由于前期乳酸的积累，pH下降，嫌气状态的形成，乳酸杆菌活跃进行活跃的同型乳酸发酵，乳酸积累pH达3.5~3.8.大肠杆菌、酵母菌、霉菌等的活动受到抑制。这一期为完全成熟阶段，泡菜有酸味且清香品质最好。
发酵后期：继续进行乳酸发酵，乳酸积累达1.2％以上时，乳酸杆菌的活性受到抑制，发酵速度逐渐变缓甚至停止。
腌制1周左右即可开坛食用。也可随时加入新鲜蔬菜，不断取用。
发酵产物中只有乳酸，称为同型乳酸发酵
（6）如果加入一些已经腌制过的泡菜汁更好，这相当于接种已经扩增的发酵菌，可减少腌制时间。
1、加入白酒有什么作用？
白酒可抑制泡菜表面杂菌的生长，它也是一种调味剂，可增加醇香感。
思考：
2、用水封闭坛口起什么作用？不封闭有什么结果？
水封闭坛口起着使坛内与坛外空气隔绝的作用，空气中21％是氧气，这是最简易的造成无氧环境的方法。这样，坛内可利用蔬菜中天然存在的乳酸菌进行乳酸发酵。如不封闭，则会有许多需氧菌生长，蔬菜会腐烂。
3、为什么泡菜坛内有时会长一层白膜，这层白膜是怎么形成的？
形成白膜是由于产膜酵母的繁殖。酵母菌是兼性厌氧微生物，泡菜发酵液营养丰富，其表面氧气含量也很丰富，适合酵母菌的繁殖。
4、为什么日常生活中要多吃新鲜蔬菜，不吃存放时间过长、变质的蔬菜？
有些蔬菜，如小白菜和萝卜等含有丰富的硝酸盐。当这些蔬菜放置过久时发生变质（发黄、腐烂）或者煮熟后存放太久时，蔬菜中的硝酸盐会被微生物还原成亚硝酸盐，危害人体健康。
二、亚硝酸盐含量的测定
1、测定亚硝酸盐含量的原理
在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，再与N-1－萘基乙二胺盐酸盐结合生成玫瑰红溶液。将经过反应显色后的待测样品与标准液比色，即可计算出样品中的亚硝酸盐含量。
2、材料与器具
泡菜、对氨基苯磺酸、 N-1－萘基乙二胺盐酸盐、氯化钠、氢氧化钠、氢氧化铝、氯化镉、氯化钡、亚硝酸钠、蒸馏水、移液管、容量瓶、比色管、榨汁机等
3、步骤
（1）配置溶液
对氨基苯磺酸溶液：称取0.4克对氨基苯磺酸，溶解于100ml体积分数为20％的盐酸中，避光保存(4mg/ml)。
N-1－萘基乙二胺盐酸盐溶液：称取0.2克N-1－萘基乙二胺盐酸盐，溶解于100ml的水中，避光保存(2mg/ml) 。
亚硝酸钠溶液：称取0.10克于硅胶干燥器中干燥24小时的亚硝酸钠，用水溶解至500ml，再转移5 ml溶液至200 ml容量瓶，定容至200ml(5ug/ml)
（2） 配制标准液
用移液管吸取0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml、1.50ml亚硝酸钠溶液，分别置于50ml比色管中，再取1支比色管作为空白对照。并分别加入2.0ml对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3～5分钟后，再分别加入1.0ml N-1－萘基乙二胺盐酸盐溶液，加蒸馏水至50ml，混匀，观察亚硝酸钠溶液颜色的剃度变化。
提取剂：分别称取50克氯化镉、氯化钡，溶解于1000ml蒸馏水中，用盐酸调节pH至1。氢氧化铝乳液和2.5mol/l的氢氧化钠溶液。
（3） 制备样品处理液
将3坛样品做好标记后，分别称取0.4千克泡菜，榨汁过滤得200ml汁液。取其中100 ml至500ml容量瓶中，加200ml蒸馏水、 100ml提取剂，混匀，再加入40ml氢氧化钠溶液，用蒸馏水定容至500ml后，立即过滤。将60ml滤液转移至100ml容量瓶中，加入氢氧化铝（吸附脱色）乳液，定容至100ml，过滤。
（4）比色
吸取40ml透明澄清的滤液，转移到50ml比色管中，将比色管做好标记。按步骤2的方法分别加入对氨基苯磺酸溶液和N-1－萘基乙二胺盐酸盐溶液，并定容至50ml，混匀，静置15
分钟后，观察样品颜色的变化，并与标准显色液比较，找出与标准液最相近的颜色，记录对应的亚硝酸钠含量，并计算。每隔2天测一次，将结果记录下来。
2001年1月4日
（封坛前）
2001年1月8日
2001年1月12日
2001年1月15日
2001年1月19日
0.15
0.60
0.20
0.10
0.10
1号坛
2号坛
0.15
0.20
0.10
0.05
0.05
3号坛
0.15
0.80
0.60
0.20
0.20
泡菜腌制过程中亚硝酸盐含量的变化
4、实验结果分析和讨论选录
……三只泡菜坛中的亚硝酸盐含量变化的绝对数量虽然不同，但整体的变化趋势却基本相同。在腌制后的第五天，三只泡菜坛中亚硝酸盐的含量都达到最高峰（1、2、3号坛中的亚硝酸盐分别达到 0.6mg/kg、0.2mg/kg、0.8mg/kg），
在腌制后的前6天内，泡菜中的亚硝酸盐含量就可以达到最高峰。而第9天后泡菜中的亚硝酸盐含量开始有明显下降。这可能是由于泡菜在开始腌制时，坛内环境有利于某些细菌的繁殖（包括一些硝酸盐还原菌），这些细菌可以促进硝酸盐还原为亚硝酸盐。但随着腌制时间的延长，乳酸细菌也大量繁殖，对硝酸盐还原菌产生一定的抑制作，使其生长繁殖受到影响，造成泡菜中亚硝酸盐的含量又有所下降。
均样+水→捣碎→加果蔬提取剂（50gBaCl2+CdCl2→加1000ml重蒸馏水中，用浓HCl调PH为1）→振荡1小时→用NaOH调至中性→定容→过滤→滤液应无色透明(共20张PPT)
果酒和果醋的制作
专题1
【基础知识】
（一）果酒制作的原理
酵 母 菌
1、酵 母 菌
有氧呼吸
无氧呼吸
酶
C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O+能量
C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2+能 量
酶
最适温度
20 0C
1、酵 母 菌
存在位置
附着在葡萄上
来自土壤
2、思考讨论
（1）葡萄上微生物很多，会不会污染葡萄酒呢？
（2）葡萄酒为什么呈深红色呢？
（3）酵母菌能否把酒酿成醋？
（二）果醋制作的原理
醋 酸 菌
醋 酸 菌
最适温度
30 0C— 35 0C
特 性
好氧细菌
糖分 醋酸
醋酸菌
醋酸菌死亡
乙醇 乙醛 醋酸
当氧气、糖源充足时：
当短时间中断氧气时：
当缺少糖源时：
C2H5OH + O2 CH3COOH+H2O
【实验设计】
醋酸发酵
果酒
酒精发酵
果醋
挑选葡萄
冲洗
榨汁
发酵瓶
√
发酵装置
思考讨论
（1）装置中充气口、排气口和出料口分别有哪些作用？
（2）为什么排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接？
（3）为什么发酵瓶中只装入2/3的液体？
【结果分析与评价】
1、如何检测果醋的制作是否成功？
闻一闻有没有醋味
尝一尝有没有醋酸
观察菌膜的形成
检测和比较醋酸发酵前后的pH值
显微镜观察是否有醋酸菌存在
2、如何检测果酒的制作是否成功？
闻一闻有没有酒味
尝一尝有没有酒精
用显微镜观察酵母菌 并用重铬酸钾检测是否有酒精
【课题延伸】
用重铬酸钾检测是否有酒精
【原理】
橙红色
灰绿色
重铬酸钾
重铬酸钾与酒精反应
【实验】
发酵液
对照组
实验组
H2SO4
H2SO4
重铬酸钾
重铬酸钾
酒 精
【课外探究】
课题1、如何将葡萄上附着的酵母菌分离出来？
课题2、尝试从食醋中分离醋酸菌。
【联系社会】
@我来当老板
散醋 0.8元/Kg
每月利润 2500——3200
1Kg苹果
4—5Kg果醋
每月300Kg苹果
4800—5700Kg果醋
成本1330元
原辅材料 1180元
+
煤、电、杂项开支 150元(共10张PPT)
专题6
植物有效成分的提取
植物芳香油的提取
胡萝卜素的提取
课题1
植物芳香油的提取
课题目标：
1、了解植物芳香油的来源，针对原料的不同特点，采用适宜的提取方法；
2、结合玫瑰精油和橘皮精油的提取，正确选择提取方法，弄清植物芳香油提取的具体操作步骤。
本节问题：
1、芳香油的来源有哪些？
2、植物芳香油的主要成分是什么？
3、植物芳香油的提取方法有哪些？常用方法是什么？
主要是植物、动物，真菌也有。
主要包括萜类化合物极其衍生物。
蒸馏、压榨和萃取。常用水蒸气蒸馏法。
4、玫瑰精油的提取具体步骤怎样？
5、使用水蒸气蒸馏装置的注意事项有哪些？
详见教材P73图6-1。
1）安装仪器时一般按自下而上，从左到右的顺序，拆卸仪器的顺序与安装时相反。保证冷凝管下进上出。
2）蒸馏开始时，先通冷水后加热；蒸馏完毕时，先撤热源后停止通水。
6、橘皮精油的提取具体操作步骤怎样？
详见教材P74图6-4。
7、橘皮精油的主要成分是什么？为什么用压榨法提取？
柠檬烯。用水蒸气蒸馏法产生原料焦糊问题。
1、蒸馏时要提高产品质量，应采取的措施是
A 提高蒸馏温度，延长蒸馏时间
B 提高蒸馏温度，缩短蒸馏时间
C 降低蒸馏温度，缩短蒸馏时间
D 严格控制蒸馏温度，延长蒸馏时间
练习巩固
2、用于提取植物芳香油的植物器官包括
A 花、茎、叶 B 树干、树皮
C 根、果实、种子 D 以上三项都是
3、玫瑰精油被称为“液体黄金”，提取玫瑰精油的方法有
A 只用水蒸气蒸馏法 B 可用蒸馏法和压榨法
C 可用蒸馏法和萃取法
D 可用压榨法和萃取法
4、在用水蒸气蒸馏法制取玫瑰乳液提纯过程中，先后使用NaCl和无水Na2SO4的作用分别是
A 分层、吸水 B 溶解、吸水
C 吸水、分层 D 分层、萃取
同学们
再见^_^(共10张PPT)
酶的研究与应用
——探究加酶洗衣粉的洗涤效果与酵母细胞固定化
一、加酶洗衣粉：
1、加酶洗衣粉是指含 的洗衣粉，目前常用的酶制剂有 、 、 和
四类。
2、 可以将脂肪分解成 和
， 可以将蛋白质分解成可溶性的 或小分子的 。
3、应用最广泛、效果最明显的是 和
。
二、设计实验的两大基本原则
原则和 原则是设计实验的
两大基本原则。
三、酵母细胞固定化
1、常用的固定化技术： 、 （前两种适
合酶的固定）、 （适合细胞的固定）。
2、酶的固定化实例：高果糖浆的生产需要用 ，它能将葡萄糖转化为果糖。
3、固定化酵母细胞
（1）固定化细胞常用的载体： 、 、
、 和 。
（2）固定化酵母细胞操作流程
的活化→配制物质的量浓度 的 溶液→配制 溶液→ 与 混
合→固定化酵母细胞
（3）注意事项
细胞的固定化要在严格 的条件下进行。
的配制是固定化酵母细胞的关键，浓度过高过低，都会影响实验效果。对海藻酸钠溶化时要 加热。
CaCl2的作用是 ，形成凝胶珠。
例题1：某工厂生产了一种加酶洗衣粉，其包装袋上印有如下说明：
成分：含碱性蛋白酶等
用法：洗涤前先将衣服浸于洗衣粉水内数小时。使用温水效果最佳。
注意：切勿用于丝质及羊毛衣料。用后彻底清洗双手。
请回答下列问题：
（1）质检局针对该洗衣粉设汁了如下装置进行实验
该实验的目的是 。
（2）一学生为探索该洗衣粉中酶催化作用的最适温度，参考上述（1）的实验材料及方法进行如下实验，并把结果用图A、B表示。
①由图可知，使用该加酶洗衣粉的最适温度约为 。
②在0℃和75℃时，酶的催化效率基本都降为零，但温度再度回到45℃，后者的催化作用已不能恢复，这是因为 。
③该同学在实验过程中可通过测定 指标来表示酶的催花效率。
（3）该加酶洗衣粉不能用于洗涤丝质及羊毛衣料，其主要原因是 。
H2O2
过氧化氢酶
愈创木酚
――――→
红褐色物质
例题2：新收获的稻米煮出的饭香气诱人，但是不法商贩也可以用陈稻米抛光增白，上油后以假乱真，欺骗消费者，新稻米过氧化氢酶活性明显高于陈稻米。植物体内的过氧化氢酶在过氧化氢（H2O2）存在下能把某些酚化物（如愈创木酚）氧化成红褐色物质，简单表示为：
其颜色的深浅与酶活性呈正相关。请你为食品卫生质量检验人员设计一个检测稻米新鲜程度的简易实验。
1、实验目的： 。
2、实验原理： 。
3、实验材料：新稻米，陈稻米（数量足够）。
试剂和用具：1％愈创木酚、1％过氧化氢、具塞试管、培养皿、移液管、观察颜色的放大镜等。
4、实验步骤：①让稻米事先浸有1％愈创木酚，具体做法是 。
然后分别用移液管向两试管内加入1％的愈创木酚溶液，浸没大米，盖上试管塞用力摇摆20下，静置一段时间后，弃掉多余液体。
②将浸有1％愈创木酚的稻米分别倒入两个具有相同编号的培养皿中，用镊子摊开，然后 。
③ 。
5、结果预期： 。
6、结论： 。
例题3：下面的流程图示意制备固定化酵母菌细胞的过程，请据图回答：
酵母细胞活化 → 配制CaCl2溶液 → 配制海藻酸钠溶液 → 海藻酸钠溶液与酵母细胞混合→ 固定化酵母细胞
1、图中酵母菌活化就是 状态。活化前应选择足够大的容器，因为酵母细胞活化时 。
2、影响此实验成败的关键步骤是 。此步的操作应采用 。
3、CaCl2溶液在形成凝胶珠时的作用原理是 。观察形成的凝胶珠颜色和形状：如果颜色过浅，说明 ；如果形成的凝胶珠不是 ，说明实验操作失败。
4、本实验所用的固定化技术是 ，而制备固定化酶则不宜用此方法，原因是 。(共26张PPT)
专题1:传统发酵技术的应用
腐乳是中华民族独特的传统调味品，具有悠久的历史：它是我国古代劳动人民创造出的一种微生物发酵大豆制品，品质细腻、营养丰富、鲜香可口，深受广大群众喜爱，其营养价值可与奶酪相比，具有东方奶酪之称。
各地人民依据自己不同的口味，形成了各具特色的传统产品，如浙江绍兴腐乳、北京王致和腐乳、黑龙江的克东腐乳、上海奉贤的鼎丰腐乳、广西桂林的桂林腐乳、广东水江的水口腐乳、云南路南的石林牌腐乳、河南拓城的酥制...
那么腐乳是如何制作的呢？
一、课题目标：
本课题以制作腐乳为例了解传统发酵技术的应用，说明腐乳制作过程的科学原理，设计并完成腐乳的制作，分析影响腐乳品质的条件。
1、说明腐乳制作过程的科学原理，设计并完成腐乳的制作。
2、在实践中探索影响腐乳品质的条件。
二、课题重点和难点：
三、思考与讨论：
阅读课本，回忆相关知识点：
1、毛霉的细胞结构、繁殖方式及类型？
2、毛霉在腐乳制作中的作用？
3、腐乳酿造选择优良菌种的条件？
4、腐乳制作的实验流程？
5、实验操作过程？
1、腐乳的制作原理
豆腐乳是我国独特的传统发酵食品，是用豆腐发酵制成，多种微生物参与发酵，其中起主要作用的是毛霉。
(1)毛霉是一种丝状真菌具发达的白色菌丝。它的菌丝可分为直立菌丝和匍匐菌丝。繁殖方式为孢子生殖，新陈代谢类型为异养需氧型。应用于腐乳等发酵工艺。
（2）毛霉在腐乳制作中的作用：在豆腐的发酵过程中，毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸，脂肪酶可将脂肪水解为甘油和脂肪酸,与醇类作用生成酯，形成细腻、鲜香等豆腐乳特色。发酵的温度为15～18 ℃ 。
2、设备及用品
瓦罐或有盖玻璃瓶、保温容器(恒温箱)、小刀、摇床、250ml三角瓶(腐乳瓶)、酒精灯、超净台及接种设备、灭菌锅培养皿、、电热干燥箱
3、试验材料：
北方豆腐块、、粽叶（或干稻草）、盐、烧杯、米酒、糖、香辛料（如胡椒、花椒、八角、茴香、桂皮、姜、辣椒等）.
4.实验流程：
让豆霉上长出毛霉→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制
操作步骤:
1）将豆腐切成3cm×3cm×1cm的若干块。所用豆腐的含水量为70％左右，水分过多则腐乳不易成形。
水分测定方法如下：
精确称取经研钵研磨成糊状的样品5～10 g (精确到0.02mg )，置于已知重量的蒸发皿中，均匀摊平后，在100～105 ℃电热干燥箱内干燥4 h，取出后置于干燥器内冷却至室温后称重，然后再烘30 min，直至所称重量不变为止。
样品水分含量（%）计算公式如下：
(烘干前容器和样品质量-烘干后容器和样品质量)/烘干前样品质量
2）将豆腐块平放在铺有干粽叶的盘内，粽叶可以提供菌种，并能起到保温的作用。每块豆腐等距离排放，周围留有一定的空隙。豆腐上面再铺上干净的粽叶。气候干燥时，将平盘用保鲜膜包裹，但不要封严，以免湿度太高，不利于毛霉的生长。
3）将平盘放入温度保持在15～18 ℃的地方。毛霉逐渐生长，大约5 d后豆腐表面丛生着直立菌丝（即长白毛）
4）当毛霉生长旺盛，并呈淡黄色时，去除包裹平盘的保鲜膜以及铺在上面的粽叶，使豆腐块的热量和水分能够迅速散失，同时散去霉味。这一过程一般持续36 h以上
5）当豆腐凉透后，将豆腐间连接在一起的菌丝拉断，并整齐排列在容器内，准备腌制
6）长满毛霉的豆腐块（以下称毛坯）与盐的质量分数比为5∶1。将培养毛坯时盘没长直立菌丝的一面统一朝向玻璃瓶边，将毛坯分层盘立摆放在容器中。分层加盐，并随层加高而增加盐量，在瓶口表面铺盐厚些，以防止杂菌从瓶口进入。(约腌制8 d)
7）将黄酒、米酒和糖，按口味不同而配以各种香辛料（如胡椒、花椒、八角茴香、桂皮、姜、辣椒等）混合制成卤汤。卤汤酒精含量控制在12％左右为宜
［注］酒精含量的高低与腐乳后期发酵时间的长短有很大关系。酒精含量越高，对蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延长；酒精含量过低，蛋白酶的活性高，加快蛋白质的水解，杂菌繁殖快，豆腐易腐败，难以成块
8）将广口玻璃瓶刷干净后，用高压锅在100 ℃蒸汽灭菌30 min。将腐乳咸坯摆入瓶中，加入卤汤和辅料后，将瓶口用酒精灯加热灭菌，用胶条密封。在常温情况下，一般六个月可以成熟.
酿造腐乳的主要生产工序是将豆腐进行前期发酵和后期发酵。前期发酵所发生的主要变化是毛霉在豆腐（白坯）上的生长。发酵的温度为15～18 ℃，此温度不适于细菌、酵母菌和曲霉的生长，而适于毛霉慢慢生长。毛霉生长大约5 d后使白坯变成毛坯。前期发酵的作用，一是使豆腐表面有一层菌膜包住，形成腐乳的“体”；二是毛霉分泌以蛋白酶为主的各种酶，有利于豆腐所含有的蛋白质水解为各种氨基酸。后期发酵主要是酶与微生物协同参与生化反应的过程。通过腌制并配入各种辅料（红曲、面曲、酒酿），使蛋白酶作用缓慢，促进其他生化反应，生成腐乳的香气。
5、腐乳的主要生产工序
6、课题成果评价
1）是否完成腐乳的制作
是否完成腐乳的制作依据是：能够合理地选择实验材料与用具；前期发酵后豆腐的表面长有菌丝，后期发酵制作基本没有杂菌的污染。
2）腐乳质量的评价
制作成功的腐乳应该具有以下特点：色泽基本一致、味道鲜美、咸淡适口、无异味、块形整齐、厚薄均匀、质地细腻、无杂质。
3）能否总结不同条件对腐乳风味和质量的影响。
影响腐乳品质的主要因素：
①菌种和杂菌：菌种是生产发酵的关键，如果菌种退化则表现出生化功能的变化，如水解速率、代谢产物等都会发生变化，从而影响品质。如有杂菌污染则直接影响产品的色、香、味。
②温度：温度影响菌丝的生长和代谢，如温度过低，则菌丝生长缓慢，不能进入豆腐块的深层；温度高，菌丝易老化和死亡，影响品质。温度还影响生化反应速度。
③ 发酵时间
发酵时间影响生化反应度及生化产物的量。
④调味品
加入的各种酒类、糖类等辅料的多少也对口感有重要影响。
1.你能利用所学的生物学知识，解释豆腐长白毛是怎么一回事？
答：豆腐上生长的白毛是毛霉的白色菌丝。严格地说是直立菌丝，在豆腐中还有匍匐菌丝。
2.王致和为什么要撒许多盐，将长毛的豆腐腌起来？
答：盐能防止杂菌污染，避免豆腐腐败。
思考：
3.我们平常吃的豆腐，哪种适合用来做腐乳？
答：含水量为70%左右的豆腐适于作腐乳。用含水量过高的豆腐制腐乳，不易成形。
4.吃腐乳时，你会发现腐乳外部有一层致密 的“皮”。这层“皮”是怎样形成的呢？它对人 体有害吗？它的作用是什么？
答：“皮”是前期发酵时在豆腐表面上生长的菌丝（匍匐菌丝），它能形成腐乳的“体”，使腐乳成形。“皮”对人体无害。
5.为什么发酵的温度为15～18 ℃？
此温度不适于细菌、酵母菌和曲霉的生长，而适于毛霉慢慢生长。
6.市售腐乳有时口感不好，豆腐较硬，你认为是什么原因造成的？
① 豆腐块的含水量不当，它影响毛霉菌丝的深入程度。
②发酵时间短，蛋白质未完全水解，在加盐后豆腐脱水，蛋白质变性，于是变硬。
③菌种不纯、菌种变异、菌种老化都会影响产品口感
④调味品加入量不足等。
课堂练习：
例1．以下四种微生物都参与的豆腐的发酵，从代谢类型上考虑哪一项与其它三项有明显区别：
A．青霉 B．酵母
C．曲霉 D．毛霉
解析：四种生物全为真核生物，同化作用类型都为异养型，不同的是酵母菌的异化作用类型是兼性厌氧型，而其它三项全为需氧型。
答案：B
例2．葡萄糖在毛霉细胞质内分解至丙酮酸的过程中，下列叙述正确的是
A．在线粒体中进行的无氧呼吸
B．需在有氧条件下进行
C．不产生CO2
D．反应速度不受温度影响
解析：葡萄糖在细胞质基质中分解成两分子丙酮酸和少量[H]及少量的能量，这一阶段也是无氧呼吸的第一阶段，因此不需氧的参与。
答案：C
例3．下面对发酵过程中灭菌的理解不正确的是
A、防止杂菌污染
B、消灭杂菌
C、培养基和发酵设备都必须灭菌
D、灭菌必须在接种前
答案：C
解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单 一纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是正确的；B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。C是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的。D也是正确的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。(共10张PPT)
一、课题目标：
以制作腐乳为例了解传统发酵技术的应用，说明腐乳制作过程的科学原理，设计并完成腐乳的制作，分析影响腐乳品质的条件。
1、说明腐乳制作过程的科学原理，设计并完成腐乳的
制作。
2、在实践中探索影响腐乳品质的条件。
二、课题重点和难点：
三、思考与讨论：
阅读课本，回忆相关知识点：
1、毛霉的细胞结构、繁殖方式及类型？
2、毛霉在腐乳制作中的作用？
3、腐乳酿造选择优良菌种的条件？
4、腐乳制作的实验流程？
5、实验操作过程？
一、基础知识：
1、关于毛霉：
（1）毛霉是一种丝状真菌，它的菌丝可分为直立菌丝和匍匐菌丝。繁殖方式为孢子生殖，新陈代谢类型为异养需氧型。应用于腐乳等发酵工艺。
（2）毛霉在腐乳制作中的作用：在豆腐的发酵过程中，毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸，脂肪酶可将脂肪水解为甘油和脂肪酸。
一、基础知识：
1、关于毛霉：
（3）传统腐乳的生产中，豆腐块上生长的毛霉来自空气中的毛霉孢子，而现代的腐乳生产是在无菌条件下，将优良毛霉菌种直接接种在豆腐上，这样可以避免其他菌种的污染，保证产品质量。
（4）优良菌种的选择：不产生毒素；生长繁殖快，且抗杂菌力强；生长的温度范围大，不受季节的限制；有蛋白酶、脂肪酶、肽酶等酶系；使产品气味正常良好。
实验流程：
让豆霉上长出毛霉→加盐腌制→加卤汤装瓶
→密封腌制
实验操作过程
题目： 腐乳制作
实验原理：豆腐中的蛋白质和脂肪经微生物分解为小
分子肽，氨基酸和甘油、脂肪酸等，再经加工腌制成
为腐乳，其主要生产过程离不开微生物的发酵。
试验材料与用具：豆腐块、小刀、电热干燥箱、干粽
叶（或干稻草）、培养皿、恒温箱、盐、烧杯、米酒、
糖、香辛料（如胡椒、花椒、八角、茴香、桂皮、姜、
辣椒等），酒精灯、腐乳瓶
操作步骤：
1、把豆腐块切成3×3×1cm的若干块。所用豆腐的含水量应为70％左右，水分过多则腐乳不易成形。
2、将豆腐块平放在铺有干粽叶的盘内，粽叶可以提供菌种，并能起到保温的作用。每块豆腐等距离排放，周围留有一定的空隙。豆腐上面再铺上干净的粽叶。气候干燥时，将平盘用保鲜膜包裹，但不要封严，以免湿度太高，不利于毛霉的生长。
3、将平盘放入温度保持在15～18℃的地方。大约5天后豆腐表面丛生直立菌丝。
4、当毛霉生长旺盛并呈淡黄色时，去除铺在上面的粽叶，使豆腐块的热量和水分能够迅速散去，同时散去霉味，需时36h以上。
5、当豆腐凉透后，将豆腐间连接在一起的菌丝拉断，并整齐排列在容器内，准备腌制。
6、长满毛霉的豆腐块（毛坯）与盐的质量分数比为5：1。将培养毛坯时盘没长直立菌丝的一面统一朝向玻璃瓶边，将毛坯分层盘立摆放在容器中。分层加盐，并随层加高而增加盐量，在瓶口表面铺盐厚些，以防止杂菌从瓶口进入。约腌制8天。
7、将米酒和糖，按口味不同而配以各种香辛料混合制成卤汤。卤汤酒精含量控制在12％左右为宜。
8、将腐乳瓶刷干净后，用高压锅在100℃蒸汽灭菌30min。将腐乳咸坯摆入瓶中，加入卤汤和辅料后，将瓶口用酒精灯加热灭菌，用油密封。需时六个月可以成熟。
练习：
1、下列菌种蛋白酶活力强，适于高温发酵酿制腐乳的是（ A ）
A.根霉 B.毛霉 C.嗜盐性小球菌 D.曲霉
2、腐乳在酿制后期发酵中添加多量酒液的目的是（ ）
A.防腐 B.与有机酸结合形成酯
C.利于后期发酵 D.满足饮酒需要
ABC(共50张PPT)
多聚酶链式反应扩增DNA片断
一、基础知识
（一）DNA分子的结构
C、H、O、N、P
1、组成元素
脱氧核苷酸
2、基本单位
3、脱氧核苷酸结构
脱氧核苷酸
脱氧核苷
磷酸
脱氧核糖
含氮碱基
嘌呤
嘧啶
腺嘌呤（A）
鸟嘌呤（G）
胞嘧啶（C）
胸腺嘧啶（T）
一个核苷酸上的磷酸基团上的“－OH”和另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成磷酸二脂键，即在相邻的两个脱氧核苷酸的3’和5’碳原子之间形成磷酸二脂键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3’、5’、磷酸二脂键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基“－OH”末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端
4、多脱氧核苷酸链得形成
脱氧核苷酸结构式
O
O
P
O
HO
碱基
O
OH
O
O
P
O
HO
OH
碱基
5’
3’
3’
5’
碱基
脱氧核糖
磷酸基团
碱基
脱氧核糖
碱基
脱氧核糖
5’
3’
多脱氧核苷酸链结构简图
5、DNA分子的双螺旋结构
① DNA分子是由两条反向平行的（即一条链为3’－5’，另一条链为5’ －3’ ）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则双螺旋结构
②脱氧核糖与磷酸交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；碱基排列在链的内侧
③两条链上的碱基通过氢键连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定与胸腺嘧啶配对，鸟嘌呤一定同胞嘧啶配对
6、利用碱基互补配对规律的计算
规律一：DNA双链中的两条互补链的碱基相等，任意两个互补的碱基之和相等即A=T，G=C。任意两个不互补的碱基之和恒等，占碱基总数的50%。即：A+G＝T+C＝A+C＝T+G＝50%，（A+G）/(T+C)＝(A+C)/(G+T)＝(T+C)/(A+G)＝1
规律二：在DNA双链中的一条单链(A+G)/(T+C)的值与另一条互补链的 (A+G) /(T+C)的值互为倒数关系
规律三：DNA双链中，一条单链的(A+T)/(G+C)的值与另一条互补链的(A+T)/(G+C)的值是相等的，也与整个DNA分子中的(A+T)/(G+C)的值相等
（二）DNA分子的特性
1、稳定性
在DNA分子双螺旋结构的内侧，通过氢键形成的碱基对，使两条脱氧核苷酸长链稳固的并联起来
例题：甲DNA分子中，A和T占25％，G和C占75%，乙DNA分子中，G和C占25％， A和T 占75%，哪一个稳定？
答：甲DNA分子比乙DNA分子稳定。因为A与T之间形成两个氢键，在G和C之间形成三个氢键，三个氢键比两个氢键稳定，所以在DNA分子中含有较多的G－C碱基对比含有较多的A－T碱基稳定
2、多样性
构成DNA分子的碱基对的数量不同，碱基对的排列顺序千变万化
例题：如果有4000个碱基对，碱基对有多少种排列方式？
答：碱基对排列方式有44000种
3、特异性
不同的DNA分子由于碱基对的排列顺序存在差异，因此每一个DNA分子的碱基对都有其特定的排列顺序，这种特定的排列顺序包含着特定的遗传信息，每一种生物(A+T)/(G+C)的比值是特定的
（三）DNA的复制
2、时期
有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期
3、场所
细胞核（主）、线粒体、叶绿体
4、模板
DNA母链
1、概念
由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程
5、原材料
脱氧核苷酸
6、基本条件
酶、ATP、原料、模板
7、复制过程
① DNA的解旋
亲代DNA分子利用细胞提供的能量在解旋酶的作用下氢键断裂，部分双螺旋链解旋为两条平行的双链
② RNA引物的合成
以单股DNA为模板，在引物酶的作用下合成小段的RNA引物
③ DNA的生成
以单股的DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下，在RNA引物的末端由5’端－3’端合成DNA。
④切掉引物生成冈崎片断
在核酸酶的作用下切掉引物。在DNA聚合酶的作用下将引物部位换上DNA，此时的DNA片断称为冈崎片断
⑤ DNA片断的连接
在DNA连接酶的作用下将冈崎片断连接起来。形成一条完整的新的DNA链。新链与旧链构成新的DNA
边解旋边复制(过程）
8、复制特点
半保留复制（结果）
9、遵循原则
碱基互补配对原则
10、精确复制的原因
11、复制的意义
DNA分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代，从而保持了遗传信息的连续性
①规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板
②碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行
①一条双链DNA分子，复制N次，形成的子代DNA分子中，含亲代DNA母链的有两个DNA分子，占子代DNA总数的2/2N；亲代DNA分子母链两条，占子代DNA中脱氧核苷酸链总数的2/2 N+1= 1/2N
②设一条DNA分子中有胸腺嘧啶为m个，则该DNA复制n次后，形成子代DNA分子需游离的胸腺嘧啶为T=(2N-1)m
12、DNA复制过程中的等量关系
（四） PCR(多聚酶链式反应）
1、 DNA聚合酶特性
不能从头合成DNA，只能从DNA的3′端开始延伸DNA链，因此， DNA复制需要引物
2、 DNA聚合酶作用过程
当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后， DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链， DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸
3、 PCR原理
①在80－100°C的温度范围内， DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性
②当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链
③ PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器
高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的Taq DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化
4、 Taq DNA聚合酶的应用
5、 缓冲液需要为PCR反应提供的物质
DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行
PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出
6、 PCR技术的特点
7、细胞内和细胞外DNA复制环境的区别
体内DNA的复制 体外的模拟
模板（母链） 细胞内源 外源加入
引物 引物合成酶 外源加入
底物dNTP 细胞内源 外源加入
聚合酶 细胞内源 外源加入
反应环境 细胞内环境 缓冲液
① PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸
8、细胞内复制和PCR不同点
② PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的
（五） PCR的反应过程
1、PCR的反应步骤
PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸
①变性（模板DNA解旋）
模板DNA经加热至900C以上。一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备
2、循环过程
靶序列
靶序列
PCR 循环第一步 ：加热变性
②复性（退火）
模板DNA经加热变性成单链后，温度降到500C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合
靶序列
靶序列
引物 Ⅰ
引物 Ⅱ
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
PCR 循环第二步 ：引物与靶序列退火
③延伸
DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链
靶序列
靶序列
引物Ⅰ
引物Ⅱ
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
Taq DNA
聚合酶
PCR 循环第三步 ：引物延伸
靶序列
靶序列
第1个 PCR 循环完成后 ：得到两个拷贝的靶序列
循环次数 DNA数量
1 2
2 4
3 8
20 1,048,576
30 1,073,741,824
3、30次循环后靶序列扩增的数量
4、PCR 循环的结果
② DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增
①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸
二、 PCR 的实验操作
1、PCR仪
（一）设备及用具
实质上一台能够自动调控温度的仪器
2、微量离心管
一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml
3、微量移液器
用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次
PCR仪
微量离心管
微量移液器
1、准备
2、移液
（二）实验操作步骤
按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上
用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂
①过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁
②注意：
3、混合
B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀
A、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢
将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序
①过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s
4、离心
5、反应
②离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果
循环数 变性 复性 延伸
第一次 94°C，10min － －
30次 ９4℃，30s 55℃，30s 72℃，1min
最后一次 ９4℃，1min 55℃，30s 72℃，1min
PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到：
6、注意事项
①隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；
②分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头
（一）理论上DNA扩增数目的计算
三、课题成果评价
1 、一条DNA，复制n次， DNA为2 n
2 、 a条DNA，复制n次， DNA为a x2 n
（二）实验中DNA含量的测定
1 、原理
可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关
2 、过程
①稀释
2uLPCR反应液，加入98uL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释
②对照调零
以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零
取DNA稀释液100uL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值
③计算
④计算
DNA含量（ g ）＝50 x (260nm的读数）
x 稀释倍数
50：1 g /ml的DNA在厚度为1cm比色杯中的吸光值为0.02
比色杯
四、 课题延伸
例如：PCR产物每轮循环增加一倍，30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）
PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出特点
五、实验小结
PCR仪加热使（ ）变性, 复性使引物与模板DNA（ ）,延伸需将反应温度升至中温( ),在（ ）的作用下,以 （ ）为原料,以（ ）为复制的起点,合成新链。 如此重复改变反应温度,经（ ）三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。
模板
互补
Taq聚合酶
四种脱氧核苷酸
引物
变性、复性和延伸
72℃