人教版选修一高中生物2.3-分解纤维素的微生物的分离(31张PPT)

(共44张PPT)
纤维素生物燃料：最有希望替代石油能源
第二代生物燃料主要以纤维素质材料为原料，如富含纤维素、生长迅速的草本植物。
可转化为草油的原料有很多，从木材废料（锯木屑
、木质建筑残片）到农业废弃物
（玉米秸秆、小麦茎秆），再到“能源作物”。
这些原料作物耕作成本低（与每桶石油有等价能效的草油为10到40美元）、量大，具备与60美元/桶的原油竞价的能力。
更关键的是，这些作物的种植生产不会干扰和危及粮食生产。
纤维素：
棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物；
纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过70亿吨；分布植物的根、茎、叶中；许多商品纤维素都是由天然纤维素制得的。
分解纤维素的微生物的分离
JLSSY
BYH
能分解纤维素的微生物，有各种细菌、真菌和少数放线菌。
纤维素
纤维素酶
组成
分布
作用
C1酶、CX酶
葡萄糖苷酶
纤维二糖
葡萄糖
纤维素
由葡萄糖相连而成的高分子化合物
由C1酶、CX酶和
葡萄糖苷酶组成的复合酶
植物的根、茎、叶等器官，木材、作物秸秆等
某些微生物
与果胶构成植物的细胞壁，用于纺织业、造纸业，食品中的膳食纤维具有通便清扫的作用
纤维素酶能水解纤维素，
一.了解纤维素和纤维素酶
土壤中某些微生物能够产生纤维素酶,把纤维素分解为葡萄糖，后再利用。
下列生物能分解纤维素的是（
）
①人
②兔
③牛
④蘑菇
⑤纤维杆菌
A.①②③④⑤
B.②③⑤
C.②③④⑤
D.③⑤
C
在草食性动物等的消化道内，也共生有分解纤维素的微生物，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素的能力。
①取二支20mL的试管
小实验：纤维素酶分解纤维素的实验
②各加入一张滤纸条
③分别加入pH4.8，物质量为0.1mol/L的醋酸－醋酸钠缓冲液11ml和10ml
甲
乙
④在乙试管中加入1mL纤维素酶
⑤两支试管固定在锥形瓶中，放在
140r/min的摇床上振荡1h
⑥结果：乙试管的滤纸条消失
讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的
作用是什么？
本实验的自变量是纤维素酶的有无
自变量的操纵方法是：在一支试管中添加适量（1mL）的纤维素酶溶液，在另一支试管不添加纤维素酶，但需加入等量的缓冲液，不能加入蒸馏水，否则会影响溶液的pH。
实验分析：P27的小实验中的自变量是什么？
二.纤维素分解菌的筛选
1.纤维素分解菌的筛选方法
2.纤维素分解菌的筛选方法的原理
刚果红染色法：这种方法能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选
。
即：可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
1、实验流程图：
土壤取样
选择培养
梯度稀释
将样品涂布在鉴别纤
维素分解菌的培养基上
筛选产生透
明圈的菌落
三.实验操作
①分布环境
富含纤维素的环境中
2、注意事项
生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的菌的几率要高于普通环境。
②原因
【资料一】土壤取样
③实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等。
④讨论:如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？
将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约10cm左右的腐殖土壤中。
【资料二】选择培养
1、选择培养的目的：
增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物
2、制备选择培养基：
???
???
酵母膏实际上是膏状的酵母抽提物，酵母抽提物是国家行业标准的规定名称。
???
酵母抽提物以酵母为原料，采用自溶法或加酶水解法工艺，经分离、脱色（或精制浓缩、喷雾干燥）而成的，含氨基酸、肽、多肽及酵母细胞水溶性成分的产品。包含粉状、与膏状的产品。
???
酵母膏可以有食品调味与生物发酵培养基两大类用途。在生物发酵行业应用还有一种习惯叫法是酵母浸膏。
【酵母膏】
微生物培养基的氨基酸氮源，由酪蛋白水解得到，常见商品名称为水解酪素或酶解酪素。酪蛋白水解后富含21种氨基酸，氨基酸种类齐全。因此常用于制备培养基。
【酪素】
培养基成分分析
培养基组成
提供主要的营养物质
纤维素粉
5g
碳源（能源）
NaNO3
1g
氮源、无机盐
KCl
0.5g
Na2HPO4·7H2O
1.2g
KH2PO4
0.9g
MgSO4
·7H2O
0.5g
无机盐
酵母膏
0.5g
生长因子、氮源、碳源（极少）
水解酵素
0.5g
氮素、生长因子
溶解后，蒸馏水定容至1000mL
水
课本问题：
①右边的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？
②这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？
③你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用
液体培养基，原因是配方中无凝固剂
有选择作用，本配方中的碳源是纤维素（粉），所以能分解纤维素的
微生物可以大量繁殖
自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,或者将纤维素改为葡萄糖。
3.选择培养的操作方法
将土样加入装有30
mL______________的锥形瓶中，将锥形瓶固定在_______上，在一定温度下振荡培养1～2
d，直至培养液变________
，也可重复选择培养。
选择培养基
摇床
混浊
按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释101～107倍。
101
102
103
104
105
106
【资料三】梯度稀释
1、制备鉴别培养基:
【资料四】将样品涂布到
鉴别纤维素分解菌的培养基上
2、涂布平板：将稀释度为104～106的菌悬液各取0.1ml涂布在培养基上，30～37℃倒置培养
鉴别纤维素分解菌的培养基配方
CMC-Na
酵母膏
KH2PO4
琼脂
土豆汁
5～10g
1g
0.25g
15g
100mL
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1
000mL
培养基组成分
提供的主要营养物质
CMC-Na
5~10g
碳源
酵母膏
1g
碳源、氮源、生长因子
KH2PO4
0.25g
无机盐
土豆汁
100mL
碳源
琼脂
15g
凝固剂
上述物质溶解后，加蒸馏水定容至1000mL
水
鉴别纤维素分解菌的培养基
(水溶性羧甲基纤维素钠)
参照课本刚果红染色法，挑选产生透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落
【资料五】挑选产生透明圈的菌落
方法一：先
，
再加入刚果红进行颜色反应。
方法二：在
时就加入刚果红。
培养微生物
倒平板
◎方法一加入中NaCl溶液的作用？
漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。
〖思考2〗
〖思考1〗
◎这两种方法各有哪些优点与不足？
染色法
优点
缺点
方法一
方法二
颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用
1、操作繁琐
2、刚果红会使菌落之间发生混杂
操作简便，不存在菌落混杂问题
1.产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈，产生假阳性反应
2.有些微生物能降解色素，在培养过程中可形成明显的透明圈。
在产生明显的透明圈的菌落，挑取并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在300C－
370C培养，可获得纯化培养。
【资料六】纯化培养
（二）选择培养的操作方法
（一）本课题涉及的生物技术主要有：
培养基的配制、无菌操作技术、稀释涂布平板法、选择培养基的作用、土壤取样等。
将土样加入装有30
mL______________的锥形瓶中，将锥形瓶固定在_______上，在一定温度下振荡培养1～2
d，直至培养液变________
，也可重复选择培养。
选择培养基
摇床
混浊
四.操作提示
为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？
在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。
（一）如何了解培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落
（二）分离的结果是否一致
设置空白对照，若对照的培养基在培养过程中无菌落生长则说明培养基制作合格。
如果观察到产生明显透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。
如果不同，分析产生不同结果的原因。
五.结果分析与评价
为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行_______________实验。
纤维素酶的发酵方法有______
发酵和______
发酵。
纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的________
含量进行定量测定。
发酵产纤维素酶
液体
固体
葡萄糖
六.课题延伸
课后比较：本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？
课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。（固体培养基）
本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致。（液体培养基）
比较
项目
分解尿素的细菌
纤维素分解菌
鉴
定
培养基
原理
现象
方法
在细菌分解尿素的化学反应
中，细菌合成的脲酶将尿素
分解成了氨，氨会使培养基
的碱性增强，pH升高。在培
养基中加入酚红指示剂，如
果pH升高指示剂会变红
刚果红可以与纤维素形成
红色复合物，当纤维素被
纤维素酶催化分解后红色
复合物无法形成，培养基
上就会出现以纤维素分解
菌为中心的透明圈
观察菌落周围是否有着色的
环带出现来鉴定尿素分解菌
观察菌落周围是否出现
透明圈来筛选纤维素分解菌
脲酶检测法
刚果红染色法
◎课题2和课题3的鉴别方法有何区别？
分解纤维素的微生物的分离
纤维素酶
种类、作用、催化活力
刚果红染色
筛选原理
实验设计
土壤取样
选择培养
涂布培养
梯度稀释
前置染色法
后置染色法
富含纤维素土壤
增大分解菌含量
染色鉴别
分离出分解菌
课堂总结