高中生物选修一5.2《多聚酶链式反应扩增DNA片段》人教版(66张PPT)

(共66张PPT)
DNA多聚酶链式反应扩增DNA片断
课题2
★分子生物学研究中最强大的实验技术之一
★其本质是在体外模拟胞内DNA分子复制的过程
美国科学家　穆利斯(K.B.Mullis)
发明了PCR技术　1993年诺贝尔奖
1、多聚酶链式反应的概念
一 、课题背景
2、多聚酶链式反应的应用： 的诊断、 、 、 和DNA 等各方面。
遗传疾病
刑侦破案
古生物学
基因克隆
序列测定
1、DNA分子的组成成分和结构
DNA 分子的基本组成单位是 .共有 种,每个基本单位是由一分子的 、一分子的 、和一分子的 构成。
脱氧核甘酸
4
磷酸
碱基
脱氧核糖
那么DNA分子的平面结构怎样呢？
二 、基础知识
㈡.DNA的复制
2.时期
有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期。
3.场所
细胞核（主要）、线粒体、叶绿体。
1.概念
由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程。
4.基本条件
酶:解旋酶、DNA聚合酶
能量:ATP
原料:四种脱氧核苷酸
模板:DNA的两条链
⑴.边解旋边复制(过程）
5.复制特点
⑵.半保留复制（结果）
6.遵循原则：
碱基互补配对原则
7.精确复制的原因
8.复制的意义
DNA分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代，从而保持了遗传信息的连续性
⑴规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板
⑵碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶 打开DNA双链
DNA母链 提供DNA复制的模板
4种脱氧核苷酸 合成子链的原料
DNA聚合酶 催化合成DNA子链
引物 使DNA聚合酶能够从引物的
3′ 端开始连接脱氧核苷酸
思考：3、体内DNA复制的条件是什么？
基本单位
A
T
G
C
A
T
G
C
3′
3′
5′
5′
1、DNA分子的3′ 端与5′ 端
-OH端为3′ ; 磷酸基团的末端为5′。
DNA双链反向平行
3′
5′
5′
3′
DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′ 端延伸DNA链，因此DNA复制需要引物。
引物
引物是一小段 ，它能与 互补配对。通常为 个核苷酸。
DNA或RNA
DNA母链的一段 碱基序列
20-30
5/
3/
G—G
T—C
3/
5/
A—G
C—C
5/
3/
A—G
引物Ⅱ
5/
3/
G—G
引物Ⅰ
如何设计引物？（三维P48）
PCR一定要知道目的基因全部序列吗？
复制的方向：子链的5′端向 3′端延伸。
解链方向
半不连续性复制（复制叉）
3
5
3
5
3
5
3
5
3
5
前导链
( leading strand )
后随链
( lagging strand )
冈崎片段（Okazaki fragment）
DNA双链
单链
变性（加热80-100℃ ）
复性（缓慢冷却）
4、DNA 分子的热变性原理：
变性的目的：
复性的目的：
解开双链
有利于引物Ⅰ和引物Ⅱ与两条单链的结合
如何在体外将双螺旋打开？
高温解决了如何打开DNA双链的问题，但是导致DNA聚合酶失活的新问题。
（一） 、PCR技术的原理
体外DNA复制的条件：
四种脱氧核苷酸、
耐高温的聚合酶、
2种引物、
模板；
缓冲溶液和严格控制温度的温控设备。
为什么不加入ATP？
PCR反应体系中加入的并非是普通的4种脱氧核苷酸，而是4种脱氧核苷三磷酸即dATP，dTTP，dGTP，dCTP，它们分别由4种脱氧核苷酸在消耗ATP的基础上活化形成的
（一）、PCR技术原理
PCR 参与的组分 在DNA复制中的作用
高温变性 解旋酶 打开DNA双链
DNA母链 提供DNA复制的模板
4种脱氧核苷酸 合成子链的原料
Taq酶（耐高温） DNA聚合酶 催化合成DNA子链
20-30个核苷酸构成DNA或RNA单链 引物 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
（二）、PCR的反应过程
每个循环包括：变性 ——复性——延伸
从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。
第一轮
①
②
3
3
5
5
①
3
5
②
3
5
5
5
3
3
③
④
第二轮
①
3
5
②
3
5
3
④
5
3
5
③
5
5
5
5
3
⑤
3
⑥
3
⑦
3
⑧
第三轮
①
3
5
②
3
5
3
④
5
3
5
③
5
5
5
5
3
⑤
3
⑥
3
⑦
3
⑧
①
3
5
②
3
5
3
④
5
3
5
③
3
5
⑤
5
3
⑥
5
3
⑦
5
3
⑧
5
5
5
5
5
5
5
5
3
3
3
3
3
3
3
3
循环次数 DNA数量
1 2
2 4
3 8
20 1,048,576
30 1,073,741,824
3、30次循环后靶序列扩增的数量
1个DNA复制n次后,会形成2n
共有2X2n 条链
其中长链2条
中链：2X30=60
其余都是短链
这样，DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列。
4、循环特点：
①上一次循环的产物为下一循环的模板 ②结果单链中有最初母链的只两条（无引物存在于两个子代DNA分子中 ③其它子代DNA分子都为双引物分子式 ④处于两引物之间的DNA序列呈指数增长1×2N
①
②
5/
3/
G—G
T—C
3/
5/
A—G
C—C
5/
3/
A—G
引物Ⅰ
5/
3/
G—G
引物Ⅱ
变性
复性
延伸
复制过程
5/
3/
G—G
T—C
5/
3/
G—G
T—C
5/
3/
G—A
引物Ⅰ
5/
3/
G—A
引物Ⅰ
5/
3/
G—G
引物Ⅱ
5/
3/
G—A
引物Ⅰ
3/
3/
5/
G—A
C—C
3/
5/
G—A
C—C
5/
3/
G—G
引物Ⅱ
5/
3/
G—G
引物Ⅱ
5/
3/
G—G
引物Ⅱ
3/
5/
3/
G—A
引物Ⅰ
（1）变性：当温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解聚为单链。
（2）复性：温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
（3）延伸：温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A，T，C，G)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
（二）、PCR的反应过程
3、每个循环包括：变性 ——复性——延伸
（1）PCR循环--变性
95℃变性
（1）PCR循环--变性
95℃变性
（1）PCR循环--变性
95℃变性
（2）PCR循环—复性
55℃复性
（3）PCR循环—延伸
（3）PCR循环—延伸
（3）PCR循环—延伸
（3）PCR循环—延伸
六、 PCR 的实验操作
1、PCR仪
（一）设备及用具
实质上一台能够自动调控温度的仪器
2、微量离心管
一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml
3、微量移液器
用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次
PCR仪
微量离心管
一 次 性
吸液枪头
调节轮
卸枪头按钮
推动按钮
卸枪头器
微量移液器
三、实验步骤：
准备好PCR反应体系的配方
用微量移液器按配方在往微量离心管中加入各组分
盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁混合反应液
离心10S
将离心管放入PCR仪上，设置好循环程序进行反应
PCR扩增体系（以50μL为例）
依次混匀下列试剂
35μL H2O
5μL 10×PCR反应缓冲液
4μL 25mmol/L MgCl2
4μL 4种dNTP
0.5μL 上游引物（引物１）
0.5μL 下游引物（引物２）
0.5μL 模板DNA (约1ng)
2.PCR扩增过程
变性 复性 延伸
预变性 95 ℃，5 min 55 ℃，1 min 72 ℃，1 min
重复30次 95 ℃，30 s 55 ℃，30 s 72 ℃，1 min
最后一次循环 － － 72 ℃，1 min
1、循环之前的一次预变性
以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率(破坏DNA中可能存在较难以破环的二级结构)
没有PCR仪可用恒温水浴锅代替，如图示：
四、操作提示：
操作提示
1．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。
2．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀，再将微量离心管放在离心机上，离心约10s，使反应液集中在离心管底部，再放入PCR仪中进行反应。
目的：
避免外源性DNA大量扩增造成假阳性反应。
五、结果分析与评价
1、原理：DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰(图5-11)。可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定。
五、结果分析与评价
DNA 含量的测定：稀释→对照调零→
测定→计算（公式见P63）
波长260nm处读数
蒸馏水做对照
50倍
2 、过程
①稀释
2uLPCR反应液，加入98uL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释
②对照调零
以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零
取DNA稀释液100uL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值
③计算
比色杯
DNA稀释液
蒸馏水
DNA含量(ug/mI)=50 ×（260nm的读数）× 稀释倍数
50的含义：在标准厚度1cm的比色杯中，OD260为1相当于50ug/mI的双链DNA
④计算
2.结果分析
DNA片段的扩增是否成功的判断
(1)对于电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。
(2)扩增不成功的可能原因有：
①漏加了PCR的反应成分；
②各反应成分的用量不当；
③PCR程序设置不当等。
在PCR扩增DNA的实验中，预计一分子DNA经过30次循环后，应该得到230个DNA分子，但是结果只有约210个DNA分子，那么不是出现该现象的原因是(　　)
A．Taq DNA聚合酶的活力不够，或活性受到抑制
B．系统设计欠妥
C．循环次数不够
D．复性时，部分亲链与亲链结合
例1
六、课题延伸
1、PCR优点：
2、PCR技术的应用P58
原理虽然复杂，但操作却十分简单。快速、高效、灵活和易于操作
PCR技术与体内DNA复制的区别：<三维P47>
1. PCR不需要解旋酶；体内DNA复制需要；
2. PCR需要耐热的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而其他生物体内的聚合酶在高温时会变性；
3. PCR一般要经历三十多次循环，而生物体内DNA复制需要生物体自身的复制。
近20年来，PCR技术(多聚酶链式反应)成为分子生物学实验室的一种常规实验手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如图)，在短时间内,将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，从而使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。
(1)加热使DNA双链间的_______键完全打开，称为________；而在细胞中是在_________酶的作用下进行的。
(1)氢　
变性　解旋
(2)如果只需要大量克隆模板DNA中间的某个特定区段，应该加入__________种特定的引物。当温度降低至55 °C时，引物与两条“舒展”的模板的特定位置结合，在DNA聚合酶的作用下，只能在引物的________端连接脱氧核苷酸，两条子链的延伸方向都是_____________________________________________。
(2)两　3′　从子链的5′端向3′端延伸
(3)PCR技术的必需条件，除了模板、原料、酶之外，至少还有三个条件，即液体环境、适宜的__________和________，前者由__________自动调控，后者则靠__________来维持。
(4)通过PCR技术使DNA分子大量复制，如果将一个用15N标记的DNA分子放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制四次之后，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例是________。
(3)温度　酸碱度　PCR仪　缓冲液　(4)1/8
练习 (课堂检测)
1、DNA单链的________末端为3′端, ________末端为5′端,在DNA复制时,引物从模板链的___端配对结合.在___________酶的作用下,从引物的____端,使子链向下延伸.
2每次循环可以分为______________________这三个过程,对应温度分别为__________________.
磷酸基团
羟基
羟基
DNA聚合
3/
变性、复性、延伸
95℃、55 ℃ 、72 ℃
90℃以上、50℃左右 、72 ℃左右
练习 (教材P63)
1、一个DNA片段经过30次循环后能形成________个这样的片段.
2、依据DNA吸收紫外光的情况,用紫外分光光度计测得
DNA=_____________________________
230
50 x(260nm的读数)x稀释倍数
练习巩固
1、关于PCR技术的应用，错误的一项是
A 古生物学、刑侦破案、DNA序列测定
B 诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学
C DNA序列测定、基因克隆、刑侦破案‘
D 诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列测定
2、DNA的合成方向总是从子链的哪一端向哪一端延伸？
3、PCR技术最突出的优点是
A 原理简单 B 原料易找
C TaqDNA聚合酶有耐热性
D 快速、高效、灵活、易于操作
子链的5′端向 3′端延伸
4、做PCR使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是
A 反复洗涤 B 不怕外源DNA污染
C 高压灭菌 D 在-20 ℃储存
互动探究
(1)PCR中由碱基错配而引起哪种变异？
(2)假设对一个DNA进行扩增，第一次循环时某一条模板链上发生碱基错配，则扩增若干次后检测所用DNA的扩增片段，与原DNA相应片段相同的占多少？
【提示】　(1)基因突变。　(2)50%。
要点三　实验操作与结果分析
1.检测PCR扩增效果的过程
移液器
返回
离心管
返回
离心机
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