人教版选修一高中生物专题二课题2：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(33张PPT)

(共33张PPT)
专题2
:微生物的培养与应用
课题2
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
明天的你一定会感谢今天努力的自己！
学习活动一
课题背景与原理
【自主学习】
阅读教材P21-23页，回答下列问题：
一.课题背景
1.尿素是一种重要的农业氮肥，但农作物
直接吸收利用，而是首先通过
将尿素在
的催化下分解成
之后，才能被植物利用。
2.细菌能利用尿素的原因
土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶
CO(NH2)2
细菌脲酶
+
H2O
+
CO2
2NH3
不能
土壤中细菌
脲酶
氨NH3
明天的你一定会感谢今天努力的自己！
课题目的
①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌
②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
研究思路
㈠.筛选菌株
㈡.统计菌落数目
㈢.设置对照
明天的你一定会感谢今天努力的自己！
二．筛选菌株
1.自然界中目的菌株的筛选：
实例----耐高温DNA聚合酶的寻找：
美国科学家布鲁克（1966
年）--在美国黄石公园的一个热泉中发现耐热细菌。这说明寻找菌株要根据它对_________的要求，到相应的_____中去寻找。
2.实验室中目的菌株的筛选：
(1)原理：人为提供有利于
生长的条件(包括营养、温度、pH
等)，同时
或
其他微生物生长。
(2)方法：利用选择培养基分离。
生存环境
环境
目的菌株
抑制
阻止
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3.选择培养基
(1)概念：指允许______________微生物生长，同时_____________________微生物生长的培养基。
(2)制备原理：根据不同微生物的特殊______要求或其对某一化学、物理因素的_____不同而制备。
(3)制备方法：在培养基中加入某种允许特定种类微生物生长，抑制或阻止其他种类微生物生长的化学成分。
(4)
实例：在培养基中以尿素为唯一的______源，可得到能利用尿素的微生物。
特定种类的
抑制或阻止其他种类的
营养
要求
氮
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【合作探究】
1.以下是本课题使用的培养基配方，请思考：
（1）该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？
提供碳源的是：葡萄糖
提供氮源的是：尿素
（2）该培养基对微生物是否具有选择作用？
如果具有，是如何进行选择的？
有选择作用
有脲酶能分解尿素的细菌能获得氮源从而能生长，其他微生物因不能合成脲酶导致缺乏氮源而生长受抑制。
这个培养基按物理性质分属于：
按用途分属于：
明天的你一定会感谢今天努力的自己！
★怎样证明此培养基具有选择性呢？
?
培养基类型
是否
接种
目的
结果
实验组
以尿素为唯一氮源的培养基
是
分离尿素细菌
只生长尿素细菌
对照组
牛肉膏蛋白胨
培养基
是
判断该培养基有无选择性
生长多种微生物
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三．统计菌落数目
测定微生物数量的常用方法有
____________________和
__________
_
。
1.稀释涂布平板法----活体计数法
（1）原理：
当样品的
足够高时，
培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个__
。通过统计平板上的_____数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，
一般选择菌落数在
_____
的平板进行计数。
（2）计算公式：
每克样品中的菌株数=
_________________。
C:________________________
_；
V:_____________
_____；
M:______________________
稀释涂布平板法
显微镜直接计数
稀释度
活菌
菌落
30-300
(C/V)╳M
某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
涂平板时所用的稀释液的体积
稀释倍数
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说明设置重复组的重要性。在设计实验时，一定要涂布至少3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。
第二位同学虽然设置了重复组，但其中一个平板的计数结果与另两个相差太远，说明操作有误，需要重新实验。
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注意事项
①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。
②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平板中，经涂布，培养计算出菌落平均数。
③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。
P22旁栏思考：想一想，如何根据平板上的菌落数推测出每克样品中的菌株数？
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统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板上菌落的平均值，然后按公式计算。
【合作探究】
2.
稀释涂布平板法统计的菌落数往往比实际数目低，原因是什么？（课本22页）
因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
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（3）统计原则
①、选
________________个菌落的平板统计。
②、每个稀释度取_______个平板取其平均值。
2．显微镜直接计数
利用__________________________在显微镜下计算一定容积内微生物数量。
优点：准确统计微生物实际数目
缺点：______________________
3.
滤膜法
测定饮水中大肠杆菌数量的方法
是将一定体积的水用细菌过滤器
过滤后，将滤膜放到
培
养基上培养，大肠杆菌菌落呈现
，可以根据培养基上黑色菌落的数目计算水样中大肠杆菌数量。
30-300
3
血球计数板（血细胞计数板）
不能区分细胞的死活
伊红-美蓝
黑色（深紫色），带金属光泽
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四．设置对照
设置对照的主要目的是设置对照的主要目的是排除实验组中_________对实验结果的影响，提高实验结果的______。
非测试因素
可信度
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①判断培养基中是否有杂菌污染：
将未接种的培养基同时进行培养。
②判断选择培养基是否具有筛选作用：
完全培养基（营养成分齐全）接种后培养观察菌落数目。
P22-23实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。
小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。
可能的原因有两种，一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。究竟是哪个原因，可通过实验来证明。
假设二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。
结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。
如何验
证?
假设一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验
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【拓展延伸】
1.能在选择培养基上生长的肯定是所筛选的目的菌吗？
原则上选择培养基只能允许特定种类的微生物生长，但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能在培养基上生长的微生物不一定都是所需要的微生物，还需进一步验证。
2.（1）在培养基全部营养成分具备的前提下，依据某些微生物对某些物质的抗性，在培养基中加入某些物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微生物生长，如培养基中加入高浓度食盐时可抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长，从而可将该菌分离出来；而在培养基中加入青霉素时可抑制细菌、放线菌的生长，从而分离得到酵母菌和霉菌。
（2）通过改变培养基的营养成分达到分离微生物的目的：培养基中缺乏氮源时，可分离自生固氮微生物，非自生固氮微生物因缺乏氮源而无法生存；培养基中若缺乏有机碳源则异养微生物无法生存，而自养微生物可利用空气中的CO2制造有机物生存。
明天的你一定会感谢今天努力的自己！
【正误判断】
1.选择培养基可以鉴定某种微生物的种类（
）
2.只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素（
）
3.筛选分解尿素的细菌时，应以尿素作为培养基中唯一的营养物质（
）
4.统计样品中的活菌数目一般用平板划线法（
）
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【典例训练】
例1.
选择培养基是根据某一种或某一类微生物的特殊营养
要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种
培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。
为选择酵母菌和硝化细菌，应选用的培养基分别为(　　)
A.伊红美蓝培养基、含青霉素的培养基
B.含青霉素的培养基、含氨的无机培养基
C.含氨的无机培养基、含青霉素的培养基
D.含青霉素的培养基、伊红美蓝培养基
例2.
在做分离分解尿素的细菌实验时，A同学从对应106培
养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约
50个菌落。产生A同学结果的原因可能有(??
?
)
①土样不同?
②培养基污染?
③操作失误?
④没有设置对照
A.?①②③
B.?②③④
C.?①③④
D.?①②③?
?
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学习活动二
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
【自主学习】阅读教材P23-26页，回答下列问题：
一、实验流程：
土壤取样---制备培养基----样品的稀释与涂布平板-----微生物的培养与观察---菌落计数
二、实验操作：
1.土壤取样
（1）土壤是天然培养基
--
其微生物数量
、种类
。
（2）要求：富含______，酸碱度________且_____的土壤。
（3）取样部位：先铲去表层土，再取距地表________cm的土壤层，将样品装入事先准备好的_______中。
2.
制备培养基
以__________________作为对照组，以______为唯一氮源的培养基作为实验组，用来判断选择培养基是否具有选择的作用。
最大
最多
有机质
接近中性
潮湿
3~8
信封
牛肉膏蛋白胨培养基
尿素
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3.
样品的稀释与涂布平板
（1）取样稀释：在火焰旁将____g
土样加入盛有____mL
无菌生理盐水的锥形瓶中(体积为
250
mL)，充分摇匀，制成101倍土样稀释液。吸取__________土壤悬液，转移至盛有_________无菌水的无菌大试管中，充分混匀，制成102倍土壤稀释液。依次类推，制成103、104、105、106、107倍土壤稀释液。
（2）稀释原则：确保平板上的菌落数在______之间。
如测定土壤中细菌的数量时，一般选用________________倍的稀释液进行平板涂布培养；
测定土壤中放线菌的数量时，一般选用________________倍的稀释液进行平板涂布培养；
测定土壤中真菌的数量时，一般选用__________________倍的稀释液进行平板涂布培养。
10
90
1mL
9mL
30~300
104、105、106
103、104、105
102、103、104
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◆应在火焰旁称取土壤10g。
◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行
◆分离不同的微生物采用不同的稀释度
原因：不同微生物在土壤中含量不同
目的：保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板
明天的你一定会感谢今天努力的自己！
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按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。
明天的你一定会感谢今天努力的自己！
制备培养基
由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。
可准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基。
将稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。
4.微生物的培养与观察
（1）培养：将涂布好的培养皿放在适宜条件下倒置培养。
细菌一般在__________℃的温度下培养________d，放线菌一般在_________℃的温度下培养________d，霉菌一般在_________℃的温度下培养________d。
（2）观察：微生物的菌落特征包括菌落的________、________、__________和_______等方面。仔细观察分离到的菌落、最好以表格的形式将不同菌落的特征记录下来。
30~37
1~2
25~28
5~7
25~28
3~4
形状
大小
隆起程度
颜色
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5.菌落计数
每隔
h统计一次菌落数目。选取
时的记录作为结果，以防止因
而导致遗漏菌落的数目。
24
菌落数目稳定
培养时间不足
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三、操作提示
1.无菌操作
（1）取样用的小铁铲和盛土样的信封都要经过______。
（2）应在__________旁称取土壤并将称好的土壤在
_________旁将土样倒入锥形瓶中，塞好_________。
（3）在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在
__________旁操作。
2.做好标记
（1）实验时要对培养皿作好标记。注明_
_________、
_________以及_
___________________等。
（2）装系列稀释菌的试管在试管架上最好
_______________________放置。
3.制定计划
灭菌
火焰
火焰
棉塞
火焰
培养基种类
培养日期
平板上培养样品的稀释度
按稀释度递增的顺序
明天的你一定会感谢今天努力的自己！
◆一般在培养皿皿底作好标记。
四、结果分析与评价
1.若选取的是同一种土样，统计结果应该接近。
2.分解尿素的细菌的进一步鉴定
(1)鉴定原理：在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的
将尿素分解成了
。会使培养基的碱性
，PH
。因此，我们可以通过检测培养基
变化来判断该化学反应是否发生。
(2)鉴定方法：在以
为唯一氮源的培养基中加入
指
示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指
示剂将变
，说明该细菌能够
。
脲酶
NH3
增强
升高
PH
尿素
红
分解尿素
明天的你一定会感谢今天努力的自己！
酚红
【合作探究】
思考1：为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？
?
思考2：怎样判断是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落？
?
?
思考3：怎样判断稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数?
因为土壤中各类微生物的数量是不同的。
如果对照的培养基在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。
如果牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。
如果得到了2个或2个以上菌落数目在30~300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。
明天的你一定会感谢今天努力的自己！
例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2
185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。
【正误判断】
1.从土壤中取样时，土层越浅越好(　
　)
2.来自土壤的微生物稀释倍数越大越好(　　
)
3.培养过程中每隔一周观察一次（
）
4.用尿素为唯一氮源、加有酚红指示剂的培养基培养尿素分解菌，指示剂变蓝（
）
明天的你一定会感谢今天努力的自己！
【典例训练】
例3．实验测定链霉素对3种细菌的抗生素效应，用3种细菌在事先准备好的琼脂平板上画3条等长的平行线(3条线均与图中的链霉素带接触)，将平板置于37
℃条件下恒温培养3天，结果如图所示。从实验结果分析，以下叙述不正确的是(　　)
A．链霉素能阻止结核菌的生长
B．链霉素对结核菌比对霍乱菌
更有效
C．链霉素对结核菌比对伤寒菌
更有效
D．链霉素可以用于治疗伤寒病人
D
明天的你一定会感谢今天努力的自己！
2.如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。据图分析正确的是(
)
A．3号试管的稀释倍数为103倍
B．4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数恰为5
号试管的10倍
C．5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1．7×109个
D．该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要高
明天的你一定会感谢今天努力的自己！
9.为了分离和纯化高效分解石油的细菌，科研人员利用被石油污染过的土壤进行如图A所示的实验。
(1)配制好的培养基通常使用_____________法灭菌。步骤③与步骤②中培养基成分相比，最大的区别是
__________________________________。
(2)同学甲进行步骤④的操作，其中一个平板经培养后的菌落分布如图B所示。该同学的接种方法是___________________，出现图B结果可能的操作失误是_______________。
高压蒸汽灭菌
步骤③的培养基中石油是唯一碳源。
稀释涂布平板法
涂布不均匀
明天的你一定会感谢今天努力的自己！
(3)同学乙也按照同学甲的接种方法进行了步骤④的操作：将1
mL样品稀释100倍，在3个平板上分别接人0.1
mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为56、58和57。据此可得出每升样品中的活菌数为_________个。
(4)步骤⑤需要振荡培养，原因是_________________________
_____________________________________________________。
(5)步骤⑤后取样测定石油含量的目的是______________________________________。
5.7╳107
提高培养液中溶解氧的含量，
同时使菌体与培养液充分接触，提高营养物质的利用率。
筛选出分解石油能力最强的细菌。
明天的你一定会感谢今天努力的自己！